TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 12709-2-2:2019 VỀ QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH CÔN TRÙNG VÀ NHỆN NHỎ HẠI THỰC VẬT – PHẦN 2-2: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI MỌT THÓC SITOPHILUS GRANARIUS LINNAEUS

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 12709-2-2:2019

QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH CÔN TRÙNG VÀ NHỆN NHỎ HẠI THỰC VẬT

PHẦN 2-2: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI MỌT THÓC SITOPHILUS GRANARIUS LINNAEUS

Procedure for identification of insect and mite pests

Part 2-2: Particular requirements for identification of grain weevil Sitophilus granarius Linnaeus

Lời nói đầu

TCVN 12709-2-2: 2019 do Cục Bảo vệ thực vật biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ TCVN 12709 Quy trình giám định côn trùng và nhện nhỏ hại thực vật gồm các phần sau đây:

– Phần 1: Yêu cầu chung

– Phần 2-1: Yêu cầu cụ thể đối với mọt to vòi Caulophilus oryzae (Gyllenhal)

– Phần 2-2: Yêu cầu cụ thể đối với mọt thóc Sitophilus granarius Linnaeus

– Phần 2-3: Yêu cầu cụ thể đối với mọt cứng đốt (Trogoderma granarium Everts), mọt da vệt thận (Trogoderma inclusum Leconte) và mọt da ăn tạp (Trogoderma variable Ballion)

– Phần 2-4: Yêu cầu cụ thể đối với rệp sáp vảy San Jose’ Diaspidiotus perniciosus (Comstock) Danzig

 

QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH CÔN TRÙNG VÀ NHỆN NHỎ HẠI THỰC VẬT

PHẦN 2-2: YÊU CẦU CỤ THỂ ĐỐI VỚI MỌT THÓC SITOPHILUS GRANARIUS LINNAEUS

Procedure for identification of insect and mite pests

Part 2-2: Particular requirements for identification of grain weevil Sitophilus granarius Linnaeus

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này đưa ra các yêu cầu về quy trình giám định mọt thóc Sitophilus granarius Linnaeus hại thực vật.

2  Tài liệu viện dẫn

Tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các phiên bản sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 8597: 2010. Kiểm dịch thực vật – Phương pháp luận về việc lấy mẫu chuyến hàng.

TCVN 12709-1: 2019. Quy trình giám định côn trùng và nhện gây hại thực vật – Phần 1: Yêu cầu chung

3  Thiết bị, dụng cụ

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thiết bị dụng cụ cơ bản dùng trong phòng thí nghiệm và các dụng cụ thiết bị sau:

3.1  Kính lúp soi nổi có độ phóng đại từ 10 lần đến 40 lần

3.2  Kính hiển vi có thước đo, có độ phóng đại từ 40 lần đến 1 000 lần

3.3  Bàn gia nhiệt có dải nhiệt từ 20°C đến 100 °C

3.4  Tủ định ôn có thể vận hành ở nhiệt độ từ 0 °C đến 50 °C

3.5  Tủ sấy có thể vận hành từ 5 °C đến 100 °C

3.6  Tủ lạnh có thể vận hành từ -10 °C đến 5 °C

3.7  Máy sàng côn trùng

3.8  Bộ sàng côn trùng có đường kính mắt sàng là 1,4 mm, 2,0 mm, 2,8 mm

3.9  Túi đựng mẫu

3.10  Ống nghiệm có nắp

3.11  Hộp nhựa có nắp lưới (diện tích mắt lưới 1 cm² có từ 630 mắt lưới đến 700 mắt lưới)

3.12  Dụng cụ thủy tinh cốc thuỷ tinh có dung tích thích hợp; ống nghiệm thủy tinh có đường kính 2 cm

3.13  Lọ thủy tinh nút mài có dung tích thích hợp

3.14  Kim côn trùng đầu nhọn và đầu gập (dạng chữ L)

3.15  Lam

3.16  Lamen

3.17  Đèn cồn

3.18  Bình thủy tinh chống ẩm

3.19  Hộp đựng mẫu

3.20  Hộp đựng mẫu lam

4  Hóa chất

Chỉ sử dụng các hóa chất loại tinh khiết phân tích và nước cất, trừ khi có quy định khác.

4.1  Dung dịch Natri Hydroxlt (NaOH) 10 % hoặc Kali Hydroxit (KOH) 10 % (xem A.1 của TCVN 12709- 1: 2019)

4.2  Kali xyanua (KCN) tinh thể

4.3  Cồn (C₂H₆O) 99,8 %

4.4  Dung dịch cồn (C₂H₆O) 70 % (xem A.2 TCVN của 12709-1: 2019)

4.5  Dung dịch Hoyer’s (xem A.15 của TCVN 12709-1: 2019)

4.6  Bôm Canada

4.7  Keo dính mẫu

4.8  Dung dịch Formalin – glycerol (FG) (xem A.17 của TCVN 12709-1: 2019)

4.9  Dung dịch tổng hợp (xem A.18 của TCVN 12709-1: 2019)

4.10  Fluon

5  Lấy mẫu và bảo quản mẫu

5.1  Lấy mẫu

– Lấy mẫu theo TCVN 8597: 2010

– Mẫu hàng hóa thu được đặt trong các hộp nhựa có nắp lưới (3.11). Thành phía trong của hộp nhựa (1/3 khoảng cách tính từ trên nắp xuống) được phủ một lớp fluon (4.10) chất ngăn trưởng thành bò lên nắp. Các hộp nhựa có dán nhãn ký hiệu mẫu và đặt trong các tủ đựng mẫu lưu.

– Thu các giai đoạn phát dục (trưởng thành, sâu non, nhộng) dựa vào ký chủ và triệu chứng gây hại:

Mọt thóc gây hại chủ yếu cho các sản phẩm sau thu hoạch hoặc cận thu hoạch thuộc các họ Asteraceae, Fabaceae và Poaceae (xem phụ lục A) như: yến mạch, thóc, kê, lúa mạch đen, cao lương, ngô hoặc có thể gây hại trên rất nhiều loại hàng hóa khô có nguồn gốc động vật hay thực vật bảo quản. Triệu chứng gây hại của mọt thóc là: các pha phát dục của mọt thóc như sâu non, nhộng đều nằm và gây hại bên trong hạt. Hạt bị hại có vết tròn mờ xung quanh lỗ đục. Trưởng thành mọt thóc chui ra ngoài khi vũ hóa tạo thành lỗ đục rất rõ trên bề mặt hạt. Vì vậy, có thể thu sâu non, nhộng, trưởng thành của các loài này bằng sàng hoặc thu trực tiếp:

+ Sàng mẫu: Dùng máy sàng côn trùng (3.7) hoặc bộ sàng côn trùng (3.8) với kích thước mắt sàng phù hợp để thu bắt sâu non và trưởng thành trong hàng hóa.

+ Kiểm tra và thu trực tiếp:

Tách thu sâu non, nhộng từ hàng hóa bảo quản có triệu chứng hại. như vết đục.

Kiểm tra thu trưởng thành của mọt trên bề mặt, tại các khe, kẽ bao bì đóng gói, kệ hàng, khe kẽ hở trên sàn, tường, trần nhà, hầm tàu…

5.2  Xử lý mẫu

5.2.1  Mẫu sử dụng cho định loại bằng phương pháp quan sát đặc điểm hình thái hoặc bảo quản

– Đối với trưởng thành mọt thóc: trước khi giám định hoặc bảo quản, cá thể trưởng thành được làm chết bằng phương pháp sử dụng lọ độc hoặc xử lý lạnh.

Xử lý bằng lọ độc: Mẫu thu được cho vào lọ độc, đậy nắp kín để trong 2 giờ. Cách làm lọ độc xem TCVN 12709-1:2019, điều 5.2.1

Xử lý lạnh: Mẫu thu được cho vào trong túi đựng mẫu (3.9) hoặc ống nghiệm có nắp (3.10) bỏ trong ngăn đá tủ lạnh (3.6) từ 1 giờ đến 3 giờ.

– Đối với sâu non, nhộng mọt thóc: trước khi giám định hoặc bảo quản được làm chết bằng phương pháp xử lý lạnh hoặc xử lý nước nóng.

Xử lý lạnh: Mẫu thu được cho vào trong túi đựng mẫu (3.9) hoặc ống nghiệm có nắp (3.10) bỏ trong ngăn đá tủ lạnh (3.6) từ 1 giờ đến 3 giờ.

Xử lý bằng nước nóng: Cho mẫu vào cốc thủy tinh (3.12) và đổ trực tiếp nước nóng 100 °C lên mẫu và để trong thời gian từ 3 phút đến 7 phút.

– Mẫu hàng hóa: bảo quản trong các hộp nhựa có nắp lưới (3.11). Thành phía trong của hộp nhựa (1/3 khoảng cách tính từ trên nắp xuống) được phủ một lớp fluon (4.10) chất ngăn trưởng thành bò lên nắp. Các hộp nhựa có dán nhãn ký hiệu mẫu và đặt trong các tủ đựng mẫu lưu ở điều kiện nhiệt độ phòng.

5.2.2  Mẫu sử dụng cho định loại bằng phương pháp sinh học phân tử (PCR hoặc Realtime – PCR)

– Trưởng thành và sâu non được ngâm trực tiếp trong cồn 99,8 % (4.3).

– Mẫu hàng hóa (lúa mỳ, bột): bảo quản trong các hộp nhựa có nắp lưới (3.11). Thành phía trong của hộp nhựa (1/3 khoảng cách tính từ trên nắp xuống) được phủ một lớp fluon (4.10) chất ngăn trưởng thành bò lên nắp. Các hộp nhựa có dán nhãn ký hiệu mẫu và đặt trong các tủ đựng mẫu lưu ở điều kiện nhiệt độ phòng.

5.3  Bảo quản

– Mẫu là hàng hóa nghi nhiễm mọt thóc được bảo quản trong các hộp nhựa có nắp lưới (3.12). Thành phía trong của hộp nhựa (1/3 khoảng cách tính từ trên nắp xuống) được phủ một lớp fluon (4.4) chất ngăn trưởng thành bò lên nắp. Các lọ có dán nhãn ký hiệu mẫu và đặt trong các tủ đựng mẫu lưu.

– Đối với trưởng thành mọt thóc: Các cá thể trưởng thành sau khi được xử lý để trong tủ sấy (3.5) ở nhiệt độ 40 °C đến 45 °C từ 5 ngày đến 7 ngày. Chuyển mẫu vào lọ thủy tinh nút mài (3.13) đặt trong bình thủy tinh chống ẩm (3.18) hoặc trong hộp đựng mẫu (3.19). Các mẫu được lưu giữ trong phòng tiêu bản có nhiệt độ nhỏ hơn 20 °C, ẩm độ nhỏ hơn 50 % hoặc trong tủ định ôn (3.4).

– Đối với sâu non, nhộng mọt thóc: Các cá thể sau non, nhộng sau khi được xử lý được cho vào các lọ nút thủy tinh mài (3.13) chứa dung dịch Formalin – glycerol (FG) (4.8) hoặc dung dịch tổng hợp (4.9).

– Đối với tiêu bản lam: Tiêu bản lam được dán nhãn, để trong hộp đựng mẫu lam (3.20) và đặt trong phòng tiêu bản có nhiệt độ nhỏ hơn 20 °C, ẩm độ không khí nhỏ hơn 50 %, hoặc trong tủ định ôn (3.4).

– Mẫu dùng cho định loại bằng phương pháp sinh học phân tử: Trưởng thành và sâu non được ngâm trực tiếp trong cồn 99,8 % (4.3).

6  Giám định

6.1  Giám định bằng các đặc điểm hình thái

Mọt thóc giám định bằng phương pháp quan sát các đặc điểm hình thái dưới kính lúp soi nổi (3.1) và kính hiển vi (3.2). Định loại đến loài đối với mẫu giám định là pha sâu non tuổi 4 và pha trưởng thành.

6.1.1  Pha sâu non

6.1.1.1  Làm tiêu bản lam

Bước 1: Xử lý mẫu làm tiêu bản lam

– Cho sâu non cần giám định vào ống nghiệm thủy tinh (3.12) chứa 5 ml dung dịch Natri Hydroxit (NaOH) 10 % hoặc Kali Hydroxit (KOH) 10 % (4.1) đun trên đèn cồn (3.17) từ 15 phút đến 20 phút (vừa đun vừa lắc ống nghiệm); hoặc cho mẫu vào cốc thủy tinh (3.12) có chứa 10 ml dung dịch Natri Hydroxit (NaOH) 10 % hoặc Kali Hydroxit (KOH) 10 % (4.1) đun trên bàn gia nhiệt (3.3) ở 60 °C từ 15 phút đến 20 phút.

– Vớt mẫu đã xử lý ra, đặt vào một giọt dung dịch Hoyer’s (4.5) hoặc Bôm Canada (4.6) hoặc nước cất trên lam (3.15). Các thao tác thực hiện dưới kính lúp soi nổi (3.1).

Bước 2: Dùng kim côn trùng tách lấy bộ phận cần quan sát

– Tiêu bản phần miệng

+ Dùng kim côn trùng đầu nhọn (3.14) tách nhẹ lấy phần đầu + Tách rời hàm trên.

+ Tách riêng phần môi trên.

+ Đặt phần môi trên, xúc biện và xương hàm lên lam (3.15) để quan sát

– Tiêu bản đốt bụng

+ Dùng kim côn trùng đầu nhọn (3.14) tách ít nhất 3 đốt bụng cuối, làm sạch bằng cách sử dụng kim côn đầu nhọn (3.14) trùng gạt nhẹ lớp mỡ trong cơ thể ra ngoài.

+ Đặt mặt lưng của đốt bụng lên lam quan sát các ngấn trên mặt lưng và đường rãnh ở mặt bên.

Bước 3: Chuyển bộ phận giải phẫu cần quan sát lên lam

+ Đặt lam (3.15) dưới kính lúp soi nổi (3.1) và nhỏ 1 giọt dung dịch Hoyer’s (4.5) hoặc Bôm Canada (4.6) vào giữa lam (3.15).

+ Dùng kim côn trùng đầu nhọn (3.14) chuyển bộ phận giải phẫu cần quan sát đã tách rời trên bước 2 lên giọt dung dịch Hoyer’s (4.5) hoặc Bôm Canada (4.6) và chỉnh tiêu bản trên lam (3.15).

Bước 4: Đậy lamen

Đặt lamen (3.16) tạo góc 45° từ từ hạ xuống sao cho mẫu trên lam (3.15) không có bọt khí. Dùng kim côn trùng đầu gập (3.14) ấn nhẹ lên lamen (3.16) để giữ mẫu và làm cho dung dịch tràn đều.

CHÚ THÍCH 1: Đối với tiêu bản soi ngay, tiêu bản lam sau khi hoàn thành được đặt trên bàn gia nhiệt (3.3) làm khô ở 30 °C đến 45 °C trong 2 giờ.

CHÚ THÍCH 2: Đối với tiêu bản bảo quản trong thời gian dài, tiêu bản lam sau khi hoàn thành được đặt trên bàn gia nhiệt (3.3) làm khô ở 30 °C đến 45 °C từ 4 tuần đến 6 tuần.

6.1.1.2  Trình tự giám định

– Quan sát hình thái sâu non dưới kính lúp soi nổi (3.1).

– Quan sát mẫu lam phần miệng và đốt bụng dưới kính hiển vi (3.2).

– So sánh các đặc điểm hình thái quan sát được với khóa phân loại của sâu non tuổi 4 mọt thóc (điều 6.1.1.3).

6.1.1.3  Đặc điểm giám định pha sâu non tuổi 4 mọt thóc

1 .Sâu non có chân, chân phát triển rõ ……………………………………….  không phải S. granarius

Sâu non không có chân, hoặc chân bị tiêu biến………………………………………………………….. 2

2. Cơ thể phủ lông thưa, các lông thường ngắn, trên mặt lưng của đốt bụng không có rãnh ngăn dọc không phải S. granarius

Cơ thể có phủ nhiều lông dày, các lông thường dài, trên mặt lưng của đốt bụng thường có rãnh ngăn dọc             3

3. Mảnh xương môi phân nhánh dạng hình trái tim, hình ovan ………… không phải S. granarius

Mảnh xương môi phân nhánh dạng dĩa 3 răng (hình 4) ……………………………………………….. 4

4. Xúc biện có nhiều hơn 2 đốt ………………………………………………… không phải S. granarius

Xúc biện có từ 1 đến 2 đốt (hình 4) …………………………………………………………………………. 5

5. Ở mặt lưng của các đốt bụng không có 3 ngấn ngang ……………….. không phải S. granarius

Ở mặt lưng của các đốt bụng có 3 ngấn ngang (hình 1) ………………………………………………. 6

6. Rìa bên sườn của các đốt bụng không có 3 đường rãnh dọc ………. không phải S. granarius

Rìa bên sườn của các đốt bụng có 3 đường rãnh dọc (hình 2) ……………………………………… 7

7. Xương hàm không đều nhau hơi lõm về phía trước ………………….. không phải S. granarius

Xương hàm đều nhau (hình 3) ………………………………………………………………………………. 8

8. Xúc biện có 7 – 8 gai cảm giác, mảnh xương trước cằm thuôn dài về phía sau…………………

…………………………………………………………………………………………… không phải S. granarius

Xúc biện có 5 gai cảm giác (hình 5), mảnh xương trước cằm không thuôn dài về phía sau (hình 6)           9

9. Không bao gồm các đặc điểm trên ………………………………………… không phải S. granarius

Bao gồm tất cả các đặc điểm trên …………………………………………………………….  S. granarius

6.1.2  Pha trưởng thành

6.1.2.1  Làm mẫu lam tiêu bản

Bước 1: Xử lý mẫu làm mẫu lam tiêu bản

– Cho trưởng thành cần giám định vào ống nghiệm thủy tinh (3.12) chứa 5 ml dung dịch Natri Hydroxit (NaOH) 10 % hoặc Kali Hydroxit (KOH) 10 % (4.1) đun trên đèn cồn (3.17) từ 15 phút đến 20 phút (vừa đun vừa lắc ống nghiệm); hoặc cho mẫu vào cốc thủy tinh (3.12) có chứa 10 ml dung dịch Natri Hydroxit (NaOH) 10 % hoặc Kali Hydroxit (KOH) 10 % (4.1) đun trên bàn gia nhiệt (3.3) ở 60 °C từ 15 phút đến 20 phút.

– Vớt mẫu đã xử lý ra, đặt vào một giọt dung dịch Hoyer’s (4.5) hoặc Bôm Canada (4.6) hoặc nước cất trên lam (3.15). Các thao tác thực hiện dưới kính lúp soi nổi (3.1).

Bước 2: Dùng kim côn trùng tách lấy bộ phận cần quan sát

– Tiêu bản râu đầu

+ Luồn kim côn trùng đầu nhọn (3.14) tách râu đầu.

+ Quan sát hình dạng gốc râu đầu

– Tiêu bản phần miệng

+ Dùng kim côn trùng đầu nhọn (3.14) tách phần miệng

– Tiêu bản cánh cứng

+ Dùng kim côn trùng đầu nhọn (3.14) cắm vào giữa mảnh thuẫn nhẹ nhàng tách rời đôi cánh cứng.

+ Khi chuyển phần cánh cứng đã tách rời lên lam phải chú ý đặt mặt lưng hướng lên trên để quan sát

– Tiêu bản gai sinh dục cái

+ Dùng kim côn trùng đầu nhọn (3.14) tách riêng phần bụng.

+ Dùng kim côn trùng đầu nhọn (3.14) xẻ màng đốt dọc theo một bên sườn.

+ Bộ phận sinh dục cái nằm ở phần cuối bụng có dạng hình chữ Y.

– Tiêu bản gai sinh dục đực

+ Dùng kim côn trùng đầu gập (3.14) ấn vào phần cuối bụng, tiếp đến sử dụng kim côn trùng đầu nhọn (3.14) xẻ màng đốt dọc theo một bên sườn, ấn nhẹ để bộ phận sinh dục đực trôi ra.

Bước 3: chuyển bộ phận giải phẫu cần quan sát lên lam

+ Đặt lam (3.15) sạch dưới kính lúp soi nổi (3.1) và nhỏ 1 giọt dung dịch Hoyer’s (4.5) hoặc Bôm Canada (4.6) vào giữa lam (3.15).

+ Dùng kim côn trùng (4.14) chuyển bộ phận giải phẫu cần quan sát đã tách rời ở bước 2 lên giọt dung dịch Hoyer’s (4.5) hoặc Bôm Canada (4.6) và chỉnh tiêu bản trên lam.

Bước 4: Đậy lamen

Đặt lamen (3.16) tạo góc 45° từ từ hạ xuống sao cho mẫu trên lam (3.15) không có bọt khí. Dùng kim côn trùng đầu gập (3.14) ấn nhẹ lên lamen (3.16) để giữ mẫu và làm cho dung dịch tràn đều.

CHÚ THÍCH 1: Đối với tiêu bản soi ngay, tiêu bản lam sau khi hoàn thành được đặt trên bàn gia nhiệt (3.3) làm khô ở 30 °C đến 45 °C trong 2 giờ.

CHÚ THÍCH 2: Đối với tiêu bản bảo quản trong thời gian dài, tiêu bản lam sau khi hoàn thành được đặt trên bàn gia nhiệt (3.3) làm khô ở 30 °C đến 45 °C từ 4 tuần đến 6 tuần.

6.1.2.2  Trình tự giám định

– Quan sát hình thái trưởng thành dưới kính lúp soi nổi (3.1).

– Quan sát các lam tiêu dưới kính hiển vi (3.2).

– So sánh các đặc điểm quan sát được với khóa phân loại của trưởng thành mọt thóc (điều 6.1.2.3).

6.1.2.3  Đặc điểm giám định pha trưởng thành mọt thóc

Cơ thể hình ovan dài (hình 7) từ 3,0 mm đến 5,0 mm, có màu nâu.

Vòi hình trụ tròn có kích thước từ 0,7 mm đến 1 mm. Hàm trên dạng đĩa có khía lõm sâu. Hàm dưới và mảnh môi hẹp, dài.

Râu đầu 8 đốt, ở mỗi đốt đều có cơ quan cảm giác (sensilla chaetica -SC) (hình 8). Hốc mọc râu đầu dạng lõm sâu dạng chữ “L” (hình 9).

Trên mảnh lưng ngực: có nhiều chấm lõm hình ovan (hình 14).

Trên cánh cứng có các đường rãnh cánh rõ ràng (hình 15), không có cánh màng.

Chân: đốt háng, đốt chuyển, đốt đùi, đốt chày và đốt bàn (hình 16). Đốt bàn chân cuối cùng có đôi vuốt (cựa) sắc nhọn) (hình 17)

Bụng 10 đốt, ống đẻ trứng của trưởng thành cái dài từ 230 mm đến 245 mm (hình 18). Cơ quan sinh dục có 2 đốt, đốt 1 hóa kitin mạnh.

Hình 7 – Trưởng thành Sitophilus granarius

(NGUỒN: https://www.gralnscanada.gc.ca)

6.2  Giám định bằng sinh học phân tử

Giám định bằng sinh học phân tử đối với loài mọt thóc sử dụng đoạn gen COII (5’-3’) theo phương pháp PCR và Real – time PCR

6.2.1  Phương pháp PCR

Bước 1: Tách chiết DNA

DNA được tách chiết từ sâu non hoặc trưởng thành hoặc sản phẩm bị hại là lúa mì và bột.

Đối với sâu non hoặc trưởng thành sử dụng kít tách chiết, ví dụ như DNeasy Tissue Kít.

Đối với sản phẩm bị hại là lúa mì hoặc bột sử dụng kít tách chiết, ví dụ như DNeasy Plant Mini Kit.

Bước 2: Khuếch đại gen

Sử dụng đoạn gen mã hóa COI và COII (Mitochondrial cytochrome oxidase)

Bảng 1: Danh sách đoạn mồi sử dụng trong quá trình khuếch đại PCR

(Obrepalska-Steplowska et al.)

Mồi	Trình tự (5’ – 3’)		Vùng gen mã hóa	Chiều dài sản phẩm gen	Nhiệt độ chạy phản ứng
SgCOI 1	AAACAACAAAGATATCGGCA		mtCOI	299 bp	53 °C
SgCOI 2	TTAAAGATGGGGGAAGTAGT
SgCOI 3	GAGCCCCAGATATAGCCTTC		mtCOI	803 bp	57 °C
SgCOI 4	CTCCGGTTAGTCCTCCAATA
SgCOII a	ATTCCTGCTATTATTCTTATTT		mtCOII	450 bp	50 °C
SgCOII b	AGTTGGGAGTGATTCTTTCTA
DNA		50 ng
Mồi		1 μM
dNTP		200 μM
Allegro Taq polymerase		0,2 U

Đệm 1x (70 mM Tris HCl; 16 mM (NH₄)₂SO₄; 2,5 mM MgCI₂ )

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: Phản ứng được thực hiện bởi máy PCR theo chương trình như sau:

95 °C trong 1 phút 94 °C trong 30 giây 50 °C(SgCOIIa/ SgCOIIb), 53 °C(SgCOI1/ SgCOI2), 57 °C (SgCOI3/ SgCOI 4) trong 30 giây 72 °C trong 1 phút 72 °C trong 5 phút

35 chu kì

Bước 3: Đọc kết quả

Sảm phẩm PCR được điện di 30 phút với 2 % agrose trong đệm TBE 1X. Nhuộm mẫu (ví dụ với Ethidium bromide 1 μg/ml) và soi dưới tia UV.

Mẫu dương tính khi cho ra sản phẩm PCR có kích thước 299 bp (SgCOH/ SgCOI2), 803 bp (SgCOI3/ SgCOI 4), 450 bp (SgCOIIa/ SgCOIIb).

6.2.2  Phương pháp Real-time PCR

Bước 1: Tách chiết DNA

DNA được tách chiết từ sâu non hoặc trưởng thành hoặc sản phẩm bị hại là lúa mì và bột.

Đối với sâu non hoặc trưởng thành sử dụng kít tách chiết, ví dụ như DNeasy Tissue Kít.

Đối với sản phẩm bị hại là lúa mì hoặc bột sử dụng kít tách chiết, ví dụ như DNeasy Plant Mini Kít.

Bước 2: Khuyếch đại gen

Thành phần chạy phản ứng real time PCR cần tổng số 10 μl bao gồm:

AmpliLight Mix

0,5 pM mồi

1 pmol Taqman probe (5’FAM – TGACGGAACACCTGGTC -TMR- 3’)

DNA khuôn

Bảng 2: Danh sách đoạn mồi sử dụng trong quá trình chạy real time PCR

(Obrepalska-Steplowska et al.)

Mồi	Trình tự (5′ – 3’)	Vùng gen mã hóa	Chiều dài sản phẩm gen	Nhiệt độ chạy phản ứng
COIISG1	TGATAACCGAACACCAATTAAC	mtCOII	125 bp	68 °C
COIISG2	TTAGACGACCAGGTGTTCCGTC
qCOIISG1	TCCTGAACAATCCCAAGAATAAG	mtCOII	114 bp	60 °C
qCOIISG2	GATTTCTGAGCATTGACCAAAG

Chu trình nhiệt của phản ứng real time PCR: Phản ứng được thực hiện bởi máy real time PCR theo chương trình như sau:

95 °C trong 2 phút 95 °C trong 20 giây 60 °C trong 30 giây 72 °C trong 1 phút 72 °C trong 5 phút

40 chu kì

Bước 3: Đọc kết quả

Kết quả được phân tích bởi phần mềm.

6.3  Kết luận

Mẫu giám định được kết luận là loài mọt thóc Sitophilus granarius Linnaeus khi:

– Mẫu sâu non hoặc trưởng thành có đặc điểm điểm hình thái phù hợp với các đặc điểm đã nêu ở điều 6.1.1.3 hoặc 6.1.2.3.

hoặc

– Phương pháp PCR hoặc realtime-PCR cho kết quả là dương tính.

7  Báo cáo kết quả

Nội dung phiếu kết quả giám định gồm những thông tin cơ bản sau:

– Thông tin về mẫu giám định.

– Tên khoa học của loài

– Phương pháp giám định

– Tài liệu giám định

– Người giám định/cơ quan giám định

Phiếu giám định chi tiết có thể tham khảo phụ lục B.

 

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

Thông tin chung

A.1  Tên khoa học và vị trí phân loại

– Tên khoa học: Sitophilus granarius Linnaeus

– Tên tiếng Việt: Mọt thóc

– Vị trí phân loại:

Ngành	: Arthropoda
Lớp	: Insecta
Bộ	: Coleoptera
Họ	: Dryophthoridae
Giống	: Sitophilus

A.2  Phân bố

Châu Á: Afghanistan, India, Iran, Iraq, Isreal, Japan, Kazakhstan, Malaysia, Saudi Arabia, Sri Lanka, Syria, Thailand, Turkey, Yeman

Châu Âu: Austria, Belgium, Bosnia- Hercegovina, Denmark, France, Greece, Germany, Hungary, Italy, Poland, Spain, United Kingdom, Ukraine, Sweden, Slovenia, Serbia

Châu Đại Dương: Australia

Châu Mỹ: Argentina, Chile, Falkland Islands

Châu Phi: Algeria, Cameroon, Egypt, Morocco, South Africa, Swaziland .

A.3  Ký chủ

Mọt thóc gây hại chủ yếu cho các sản phẩm sau thu hoạch hoặc cận thu hoạch. Ký chủ chính của loài mọt thóc là các họ Asteraceae: Helianthus annuus (hướng dương); Fabaceae: Arachis hypogaea (lạc), Cicer arietinum (đậu gà), Vicia faba (đậu răng ngựa); Poaceae: Avena sativa (yến mạch), Oryza sativa (lúa), Panicum (kê), Pennisetum (có lông vũ), Secale cereale (lúa mạch đen), Sorghum bicolor (cao lương), Zea mays (ngô).

1. 4 Đặc điểm sinh học

– Trưởng thành của S. granarius bò rất nhanh. Trứng, sâu non và nhộng của loài này nằm trong hạt nên chúng có khả năng phát tán rất nhanh thông qua việc vận chuyển các loại hàng hoá này.

– Trưởng thành sống trung bình từ 7 tháng đến 8 tháng. Trưởng thành cái đẻ khoảng 150 trứng và cao nhất có thể đạt tới 300 trứng, ở điều kiện mùa hè, S. granarius có thể hoàn thành vòng đời từ 4 tuần đến 6 tuần nhưng trong điều kiện mùa đông, vòng đời có thể kéo dài từ 17 tuần đến 21 tuần.

– Khi không có thức ăn, ở điều kiện khí hậu mát, trưởng thành có thể sống ít nhất là 1 tháng

 

PHỤ LỤC B

(Tham khảo)

Mẫu phiếu kết quả giám định

Cơ quan giám định ———	CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc —————
	………., ngày … tháng … năm 20……

 

PHIẾU KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH

1. Tên hàng hoá:
2. Nước xuất khẩu:
3. Xuất xứ:
4. Phương tiện vận chuyển: Khối lượng:
5. Địa điểm lấy mẫu:
6. Ngày lấy mẫu:
7. Người lấy mẫu:
8. Tình trạng mẫu:
9. Ký hiệu mẫu:
10. Số mẫu lưu:
11. Người giám định:
12. Phương pháp giám định: Theo TCVN 12709-2-2:2019 về “Quy trình giám định côn trùng và nhện nhỏ gây hại thực vật – Phần 2 -2: Yêu cầu cụ thể đối với mọt thóc Sitophilus granarius Linnaeus”.
13. Kết quả giám định:

Tên khoa học: Sitophilus granarius Linnaeus

Họ: Dryophthoridae

Bộ: Coleoptera

 

TRƯỞNG PHÒNG KỸ THUẬT (hoặc người giám định) (ký, ghi rõ họ và tên)

THỦ TRƯỞNG ĐƠN VỊ (ký, ghi rõ họ và tên đóng dấu)

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Nghị định 86/2012/NĐ-CP. Quy định chi tiết và hướng dẫn thi hành một số điều của luật đo lường.

[2] QCVN 01-107:2012/BNNPTNT – Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về quy trình giám định mọt thóc Sitophilus granarlus L.

[3] QCVN 01-175:2014/BNNPTNT – Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về quy trình lưu giữ, bảo quản và vận chuyển mẫu trong kiểm dịch thực vật

[4] TCVN 1-2: 2008, Phần 2: Quy định về trình bày và thể hiện nội dung tiêu chuẩn quốc gia.

[5] Aleksandra Obrepalska-Steplowska, Katarzyna Nowaczuk, Marcin Hoysz, Magdalena Gawlak, Jan Nawrot. 2011. Molecular techniques for detection of granary weevil (Sitophilus granarius L.) in wheat and flour. Food Additives and Contaminants, 2008, 25(10), pp. 1179-1188.

[6] CABI, 2018. Crop Protection Compedium

(https://www.cabi.org/cpc/datasheet/10850)

[7] Dinuttă A., Bunescu H., Proorocu M., Bodis I. and Oros S. 2008. Reseaches concering the external morphology of granary weevil’s adult (Sitophilus granarius L), a major pests of the stored cereals. Bulletin UASVM, Agriculture 65 (1) 2008. pISSN 1843 – 5246; elSSN 1843 – 5386.

[8] Elda G. And Fava A. 1995. Egg general morphology and eggshell fine organization of the grain weevil Sitophilus granarius (L.) (Coleóptera: Curculionidae). Entomologica, Bari, 29, (1995): 87- 98.

[9] Fouda, M. A., Al – Dali A. G. and Ghannam I. A. 2016. Ultrastructure of sensory receptors on the antennae and mouthparts of the adult, Sitophilus oryzae L. and Sitophylus granarles L. (Coleoptera: Curculionidae). Jounal of Nuclear Technology in Applied Science. ISSN 2314 – 8209.

[10] Gorham J. R., 1991. Insect and mite pests In food. U. S. Government printing office. Washington, D. C. 20402. Page 115- 136.

[11] Ki – Jeong Hong, Wonhoon Lee, Yuong – Ju Park and Jeong – Oh Yang. 2018. First confirmation of the distribution of rice weevil, Sitophilus oryzae, in south korea. Journal of Asia- Pacific Biodiversity 11 (2018) 69-75.

[12] Yves Bousques, 1990. Beetles associated with stored products in Canada. An Identification guide. Blosytemtis Reseach Centre Ottawa, Ontario.