TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 5164:2018 (EN 14122:2014) VỀ THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH VITAMIN B1 BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 5164:2018

EN 14122:2014

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH VITAMIN B₁ BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Foodstuffs – Determination of vitamin B₁ by high performance liquid chromatography

Lời nói đầu

TCVN 5164:2018 thay thế TCVN 5164:2008;

TCVN 5164:2018 hoàn loàn tương đương với EN 14122:2014;

TCVN 5164:2018 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH VITAMIN B₁ BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Foodstuffs – Determination of vitamin B₁ by high performance liquid chromatography

CẢNH BÁO – Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể cần phải sử dụng các vật liệu, thiết bị và các thao tác nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đề cập đến các vấn đề an toàn khi sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định vitamin B₁ trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) xử lý bằng enzym và dẫn xuất hóa trước cột hoặc sau cột. Phương pháp này được đánh giá xác nhận trong hai nghiên cứu liên phòng. Nghiên cứu thứ nhất phân tích mẫu bột mì nguyên cám, sữa bột/sữa bột khô sấy phun, rau hỗn hợp đông khô và gan lợn đông lạnh, từ 0,295 mg/100 g đến 0,807 mg/100 g. Nghiên cứu thứ hai phân tích các mẫu thức ăn dùng bằng đường xông, thức ăn trẻ em bổ sung rau, sữa bột, thức ăn bổ sung hoa quả, nấm men, ngũ cốc, bột sô cô la và thực phẩm bổ sung từ 0,11 mg/100 g đến 486 mg/100 g. Vitamin B₁ là tổng các phần khối lượng của thiamin bao gồm các dẫn xuất phosphoryl hóa.

Thông tin thêm về đánh giá xác nhận, xem Điều 8 và Phụ lục B.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi.

TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm. Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

3  Nguyên tắc

Thiamin được chiết từ thực phẩm bằng cách thủy phân axit, sau đó dephosphoryl hóa bằng enzym và định lượng bằng HPLC có dẫn xuất hóa trước cột hoặc sau cột với thiochrom. Sử dụng chất ngoại chuẩn để định lượng. Để biết thêm thông tin xem [1] đến [7]

4  Thuốc thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước ít nhất đạt loại 1 của TCVN 4851 (ISO 3696) hoặc nước cất hai lần, trừ khi có quy định khác.

4.1  Metanol, khối lượng w(CH₃OH) ≥ 99,8 %, loại dùng cho HPLC.

4.2  Dung dịch axit axetic, nồng độ chất c(CH₃COOH) = 0,02 mol/l.

4.3  Isobutanol, w(C₄H₁₀O) ≥ 98 %.

4.4  Natri dihydro phosphat, w(NaH₂PO₄) ≥ 99,8 %.

4.5  Dung dịch axit clohydric, w(HCl) = 36 %.

4.6  Dung dịch axit clohydric, c(HCl) = 0,1 mol/l.

4.7  Dung dịch axit sulfuric, c(H₂SO₄) = 0,05 mol/l.

4.8  Natrl hydroxit, w(NaOH) ≥ 99 %.

4.9  Dung dịch natri hydroxit, nồng độ khối lượng ρ(NaOH) = 150 g/l.

4.10  Dung dịch natri hydroxit, ρ(NaOH) = 200 g/l.

4.11  Kali hexaxyanoferat III, wíK₃[Fe(CN)₆]ý ≥ 99 %.

4.12  Dung dịch kali hexaxyanoferat III, ρíK₃[Fe(CN)₆]ý = 10 g/l.

4.13  Dung dịch kali hexaxyanoferat III kiềm (dẫn xuất trước cột), ρíK₃[Fe(CN)₆]ý = 0,4 g/l.

Pha loãng 2,0 ml dung dịch kali hexaxyanoferat III (4.12) bằng dung dịch natri hydroxit (4.9) đến 50 ml. Dung dịch nên được chuẩn bị trong ngày sử dụng.

4.14  Dung dịch kali hexaxyanoferat III kiềm (dẫn xuất sau cột), ρíK₃[Fe(CN)₆]ý = 0,5 g/l.

Pha loãng 2,5 ml dung dịch kali hexaxyanoferat III (4.12) bằng dung dịch natri hydroxit (4.10) đến 50 ml.

4.15  Enzym hoặc hỗn hợp enzym, có khả năng giải phóng vitamin B₁ từ thực phẩm không chứa thiamin tự do.

CHÚ THÍCH 1  Dữ liệu về độ chụm nêu trong Bảng B.1, sử dụng Taka-Diatase từ Pfaltz và Bauer1). Đối với độ chụm nêu trong Bảng B.2 và Bảng B.3, sử dụng kết hợp enzym β-amytase từ lúa mạch và Taka-Diataza1) từ Serva.

CHÚ THÍCH 2  Nếu xảy ra hiện tượng dephosphoryl hóa không đầy đủ, thì có thể tiến hành định lượng riêng TMP (Thiamin Mono Phosphat), xem [7].

4.16  Dung dịch natri axetat, c(CH₃COONa.3H₂O) = 2,5 mol/l.

4.17  Dung dịch natri axetat, c(CH₃COONa.3H₂O) = 0,5 mol/l.

4.18  Pha động HPLC

Các ví dụ về các hỗn hợp thích hợp với các phần thể tích ví dụ từ 10 % đến 50 % metanol (4.1) trong nước hoặc sử dụng dung dịch đệm phosphat hoặc dung dịch đệm axetat được nêu trong Phụ lục A và Phụ lục C. Khả năng sử dụng các tác nhân tạo cặp ion cũng được đưa ra.

4.19  Đệm phosphat (pH = 3,5), c(KH₂PO₄) = 9,0 mmol/l.

4.20  Tetraetylamoniclorua, w(C₈H₂₀NCl) ≥ 98 %.

4.21  Natri heptansulfonat, w(C₇H₁₅NaO₃S) ≥ 98 %.

4.22  Đệm axêtat (pH = 4,0), c(CH₃COOH) = 50 mmol/l.

4.23  Chất chuẩn

4.23.1  Thiamin clorua hydroclorua, w(C₁₂H₁₇ClN₄OS.HCl) ≥ 99 %.

Để hiệu chuẩn ngoài, xem 6.3.

4.23.2  Thiamin monophosphat clorua, w(C₁₂H₁₇ClN₄O₄PS) ≥ 98 %.

Để kiểm tra enzym, xem 6.2.2.

4.23.3  Thiamin pyrophosphat clorua (cocarboxylase), w(C₁₂H₁₉ClN₄O₇P₂S) ≥ 98 %.

Để kiểm tra enzym, xem 6.2.2.

4.24  Dung dịch gốc

4.24.1  Dung dịch gốc thiamin clorua hydroclorua, ρ(C₁₂H₁₇ClN₄OS.HCl) ≈ 0,1 mg/ml

Hòa tan một lượng chính xác chất chuẩn thiamin cloroa hydroclorua (4.23.1) trong một thể tích dung môi thích hợp đã xác định, ví dụ 10 mg chất chuẩn vitamin B₁ trong 100 ml dung dịch axit clohydric (4.6). Dung dịch này có thể bảo quản được bốn tuần ở nhiệt độ + 4 °C.

4.24.2  Dung dịch gốc thiamin monophosphat, ρ(C₁₂H₁₇ClN₄O₄PS) ≈ 0,1 mg/ml

Hòa tan một lượng chính xác thiamin monophosphat clorua (4.23.2) trong một thể tích dung môi thích hợp đã xác định, ví dụ 10 mg thiamin monophosphat clorua trong 100 ml dung dịch axit clohydric (4.6). Dung dịch này có thể bảo quản được bốn tuần ở nhiệt độ – 20 °C.

4.24.3  Dung dịch gốc thiamin pyrophosphat, ρ(C₁₂H₁₉ClN₄O₇P₂S) ≈ 0,1 mg/ml

Hòa tan một lượng chính xác thiamin pyrophosphat clorua (4.23.3) trong một thể tích dung môi thích hợp đã xác định, ví dụ 10 mg thiamin pyrophosphat clorua trong 100 ml dung dịch axit clohydric (4.6).

4.24.4  Kiểm tra nồng độ thiamin clorua hydroclorua

Pha loãng 10 ml dung dịch thiamin clorua hydrodorua (4.24.1) bằng dung dịch axit clohydric (4.6) trong bình định mức 100 ml đến vạch. Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng tối đa 247 nm (A₂₄₇) trong cuvet 1 cm dựa vào dung dịch axit clohydric (4.6) trong cuvet chuẩn, sử dụng máy đo phổ UV (5.1). Tính nồng độ khối lượng, ρ, bằng microgram trên mililit dung dịch thiamin clorua hydroclorua (4.24.1), sử dụng Công thức (1):

Trong đó

e	là hệ số hấp thụ phân tử của thiamin clorua hydroclorua ở bước sóng tối đa khoảng 247 nm. Giá trị là 14 200 l.mol-1.cm-1. Giá trị tính được từ hệ số tắt, = 421 trong HCl 0,1 mol/l [8], [7] và khối lượng phân tử M = 337,21. Giá trị lấy đến bốn chữ số thập phân.
M	là khối lượng phân tử, tính bằng gam trên mol (g/mol). Giá trị là 337,21.
A247	là giá trị hấp thụ của dung dịch thiamin clorua hydroclorua.

4.25  Dung dịch chuẩn

4.25.1  Dung dịch chuẩn thiamin clorua hydroclorua, ρ(C₁₂H₁₇ClN₄OS.HCl) ≈ 1 µg/ml đến 10 µg/ml

Dùng pipet lấy từ 1 ml đến 10 ml dung dịch thiamin clorua hydroclorua (4.24.1) cho vào bình định mức 100 ml và pha loãng đến vạch bằng dung môi thích hợp, ví dụ dung dịch axit clohydric (4.6). Dung dịch này có thể bảo quản được 1 tháng ở nhiệt độ 4 °C, ở nơi tối.

4.25.2  Dung dịch chuẩn thiamin monophosphat, ρ(C₁₂H₁₉ClN₄O₄PS) ≈ 1 µg/ml đến 10 µg/ml

Dùng pipet lấy từ 1 ml đến 10 ml dung dịch thiamin monophosphat (4.24.2) cho vào bình định mức 100 ml và pha loãng đến vạch bằng dung môi thích hợp, ví dụ dung dịch axit clohydric (4.6). Dung dịch này có thể bảo quản được 1 tháng ở nhiệt độ 4 °C, ở nơi tối.

4.25.3  Dung dịch chuẩn thiamin pyrophosphat, ρ(C₁₂H₁₉ClN₄O₇P₂S) ≈ 1 µg/ml đến 10 µg/ml

Dùng pipet lấy từ 1 ml đến 10 ml dung dịch thiamin pyrophosphat (4.24.3) cho vào bình định mức 100 ml và pha loãng đến vạch bằng dung môi thích hợp, ví dụ dung dịch axit clohydric (4.6). Dung dịch này có thể bảo quản được 1 tháng ở nhiệt độ 4 °C, ở nơi tối.

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.1  Máy đo phổ UV, có thể đo độ hấp thụ ở các bước sóng xác định (247 nm), với cuvet thích hợp, ví dụ chiều dài đường quang 1 cm.

5.2  Thiết bị hấp áp lực hoặc gia nhiệt

Dùng thiết bị hấp áp lực cho mục đích chiết, ví dụ như kiểu nồi hấp áp lực, có bộ phận ghi nhiệt độ và áp suất, bộ phận đốt nóng bằng điện hoặc nồi cách thủy.

5.3  Hệ thống HPLC

Hệ thống HPLC gồm có bơm, bộ phận bơm mẫu, detector huỳnh quang có các bước sóng phát xạ 366 nm và kích thích 435 nm đã cài đặt, (xem Phụ lục C) và hệ thống đánh giá như bộ tích phân.

5.4  Cột HPLC

5.4.1  Yêu cầu chung

Có thể sử dụng các cột hoặc cỡ hạt có kích cỡ khác với quy định trong tiêu chuẩn này. Các thông số tách phải phù hợp với vật liệu sử dụng để đảm bảo các kết quả tương đương. Tiêu chí vận hành đối với các cột phân tích thích hợp là độ phân giải đường nền của thiamin từ các chất gây nhiễu 2).

5.4.2  Trường hợp ôxy hóa trước cột

Cột phân tích, ví dụ như Lichropher^® 60 RP Select B ²⁾, cỡ hạt 5 µm, đường kính từ 4,0 mm đến 4,6 mm, dài từ 100 mm đến 250 mm.

5.4.3  Trường hợp ôxy hóa sau cột

Cột phân tích, ví dụ như Supelco^® LC-18-DB ²⁾, cỡ hạt 5 µm, đường kính từ 4,0 mm đến 4,6 mm, dài từ 100 mm đến 250 mm.

5.5  Bộ lọc

Lọc pha động cũng như lọc dung dịch mẫu thử qua màng lọc, ví dụ cỡ lỗ 0,45 µm trước khi sử dụng hoặc bơm sẽ kéo dài tuổi thọ của cột.

5.6  Bơm phản ứng sau cột và ống dẫn xuất, hệ thống phân phối thuốc thử thích hợp là ống nối kiểu chữ T và ống dẫn xuất (ví dụ 10 m x 0,33 mm).

6  Cách tiến hành

6.1  Chuẩn bị mẫu thử

Đồng hóa mẫu thử. Nghiền nguyên liệu thô trong máy nghiền thích hợp và trộn lại. Cần thực hiện các biện pháp như làm nguội sơ bộ để tránh tiếp xúc với nhiệt độ cao trong thời gian dài.

6.2  Chuẩn bị dung dịch mẫu thử

6.2.1  Tách chiết

Cân một lượng mẫu thử thích hợp ví dụ từ 2 g đến 10 g, chính xác đến mg, cho vào bình nón. Thêm một thể tích xác định từ 60 ml đến 200 ml dung dịch axit clohydric (4.6) hoặc dung dịch axit sulfuric (4.7). pH của dung dịch này không được lớn hơn pH = 2,0. Đậy nắp bình bằng mặt kính đồng hồ và hấp áp lực phần mẫu thử ở 121 °C trong 30 min hoặc làm nóng ở 100°C trong 60 min.

Dữ liệu từ nghiên cứu BCR cho thấy rằng có thể áp dụng một dải rộng các điều kiện đối với việc thủy phân bằng axit (nhiệt độ từ 95 °C đến 130 °C, thời gian từ 15 min đến 60 min). Nhiệt độ cao hơn thì thời gian chiết ngắn hơn.

6.2.2  Xử lý bằng enzym

Sau khi làm nguội đến nhiệt độ phòng, chỉnh pH của dịch chiết tối ưu cho hoạt động của enzym bằng dung dịch natri axetat (4.16) hoặc (4.17) và thêm một lượng thích hợp enzym hoặc hỗn hợp enzym (4.15) vào mẫu. Ủ hỗn hợp trong một khoảng thời gian và nhiệt độ tối ưu đối với enzym sử dụng. Sau khi làm nguội đến nhiệt độ phòng, dùng nước cất hoặc dung môi thích hợp khác để chuyển dung dịch vào bình định mức và pha loãng đến thể tích xác định (V_ts).

Đối với mỗi enzym sử dụng, cần kiểm tra pH tối ưu, nhiệt độ ủ và thời gian ủ.

Để đảm bảo khử phosphoryl hóa tối ưu, bước xử lý bằng enzym cần được kiểm tra bằng cách phân tích các mẫu đã thêm thiamin monophosphat clorua (4.23.2) hoặc thiamin pyrophosphat clorua (4.23.3) và vật liệu tương tự với mẫu thử. Vật liệu này phải là mẫu chuẩn đã được chứng nhận.

Lượng thiamin có khả năng thêm vào từ enzym (4.15) cần được tính đến trong phần tính kết quả.

CHÚ THÍCH  Để xác định dữ liệu về độ chụm trong Bảng B.1, Bảng B.2 và Bảng B.3, Taka-Diastase và Taka-Diastase kết hợp¹⁾ với β-amylase từ lúa mạch đã được sử dụng đã khử phosphoryl dưới các điều kiện sau đây. Dịch chiết đã được điều chỉnh đến pH = 4,0 và pH = 4,5 tương ứng, với dung dịch natri axetat (4.16) hoặc (4.17) và đã bổ sung 100 mg Taka-Diastase và 10 mg β-amylase trên gam mẫu. Hỗn hợp này được ủ ở 37 °C đến 45 °C trong 4 h đến 24 h, xem [5], [10] và [16].

6.2.3  Dung dịch mẫu thử

Lọc dung dịch mẫu (6.2.2) qua giấy lọc hoặc bộ lọc màng cỡ lỗ 0,45 µm, nếu cần. Cũng có thể sử dụng ly tâm. Đây là dung dịch mẫu thử dùng cho quá trình oxy hóa (6.3.2 hoặc 6.3.3).

6.3  Oxy hóa thiamin thành thiocrom

6.3.1  Yêu cầu chung

Oxy hóa có thể được thực hiện trước cột (6.3.2) hoặc sau cột (6.3.3).

6.3.2  Oxy hóa trước cột

6.3.2.1  Quy trình oxi hóa

Dùng pipet lấy 1 ml mẫu thử đã xử lý bằng enzym (6.2.3), dung dịch chuẩn (4.25.1) hoặc dung dịch trắng ví dụ dung dịch axit clohydric (4.6) hoặc dung dịch axit sulfuric (4.7) tùy thuộc vào việc sử dụng trong 6.2.1 cho vào bình cầu hoặc lọ thích hợp, thêm 1 ml dung dịch hexaxyanoferat kiềm (4.13). Lắc dung dịch mẫu thử trong thời gian quy định (ví dụ: 10 s), để yên trong khoảng thời gian quy định (ví dụ: 1 min).

Để loại bỏ các hợp chất gây nhiễu và bảo vệ cột HPLC thì nên trung hòa dung dịch mẫu thử (ví dụ bằng H₃PO₄) hoặc tiến hành làm sạch bằng chiết pha rắn (xem thêm thông tin trong [5]).

Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 µm. Dung dịch mẫu thử được bơm vào hệ thống HPLC pha đảo (6.3.2.2).

Cách khác, dung dịch đã oxy hóa có thể được chiết vào 1,5 ml isobutanol (4.2.3) và có thể bơm dịch chiết.

CHÚ THÍCH  Việc chuyển hóa thiamin thành thiocrom có thể bị ức chế trong một số loại thực phẩm. Hiện tượng này thường gặp trong các thực phẩm chứa cacao, cũng có thể thấy trong một số thực phẩm khác. Nếu nghi ngờ có hiện tượng này thì nên kiểm tra độ thu hồi của phương pháp bằng cách xử lý dịch chiết mẫu bằng một thể tích thích hợp dung dịch chuẩn thiamin trước phản ứng oxy hóa.

6.3.2.2  Nhận dạng bằng HPLC sau khi oxy hóa trước cột

Bơm các thể tích thích hợp giống nhau các dung dịch chuẩn (6.3.2.1), mẫu và mẫu trắng vào hệ thống HPLC. Nhận dạng thiocrom bằng so sánh thời gian lưu của các pic riêng lẻ trong sắc ký đồ thu được từ dung dịch mẫu thử và dung dịch thử chuẩn. Việc thêm các chất chuẩn vào dung dịch mẫu thử cũng có thể nhận dạng được pic.

Việc tách và định lượng cho thấy thỏa đáng nếu thực hiện theo các điều kiện thực nghiệm sau đây (xem thêm Hình A.1 và Phụ lục C về các điều kiện HPLC thay thế và ví dụ về sắc kí đồ).

6.3.3  Trường hợp ôxy hóa sau cột

6.3.3.1  Quy trình oxi hóa

Oxy hóa thiamin thành thiocrom sử dụng phản ứng sau cột với dung dịch kali hexaxyanoferat kiềm III (4.14). Thêm liên tục (ví dụ: 0,3 ml/min) thuốc thử dẫn xuất qua ống nối kiểu chữ T cho vào dịch rửa giải HPLC để tạo thành thiocrom.

CHÚ THÍCH  Việc oxy hóa sau cột bị ảnh hưởng ví dụ bởi nồng độ natri hydroxit. Các nồng độ cao hơn trong dung dịch dẫn xuất có thể được bù bởi tốc độ bơm thấp hơn và ngược lại.

6.3.3.2  Nhận dạng bằng HPLC sau oxy hóa sau cột

Bơm các thể tích thích hợp giống nhau của các chuẩn thiamin chlorua hydrochlorua (4.23.1) cũng như các dung dịch mẫu (6.2.3) vào hệ thống HPLC. Xác định thiamin bằng cách so sánh thời gian lưu của các pic riêng trong sắc ký đồ thu được với dung dịch mẫu thử và với chuẩn (4.23.1). Thêm thiamin chlorua hydrochlorua vào dung dịch mẫu thử cũng có thể nhận diện pic.

Việc tách và định lượng được cho thấy là thỏa đáng nếu tuân theo các điều kiện thí nghiệm sau (xem Phụ lục C và Hình A.2 đối với các hệ thống HPLC thay thế và các ví dụ về sắc ký đồ).

CHÚ THÍCH  Việc phân tích một số mẫu, ví dụ như thịt lợn nguyên liệu có thể có thêm pic của 2(1-hydroxyetyl) thiamin trong sắc ký đồ xem Phụ lục D.

6.4  Phép xác định

Tiến hành xác định bằng ngoại chuẩn sử dụng tích phân diện tích pic (nếu có thể) hoặc xác định chiều cao pic (tùy chọn) của mẫu và so sánh các kết quả với các giá trị tương ứng đối với thiocrom bằng cách sử dụng đường chuẩn. Kiểm tra độ tuyến tính của việc hiệu chuẩn.

7  Tính kết quả

Sử dụng đường chuẩn hoặc sử dụng chương trình thích hợp của bộ tích phân hoặc sử dụng quy trình đã đơn giản hóa dưới đây. Tính khối lượng vitamin B₁, w, biểu thị theo thiamin clorua hydroclorua, bằng mg/100 g mẫu, sử dụng Công thức (2):

Trong đó

Báo cáo kết quả vitamin B₁ bằng mg/100 g được biểu thị theo thiamin clorua hydroclorua (M = 337,28). Nếu cần phải biểu thị kết quả theo thiamin (C₁₂H₁₇N₄OS, M = 265,37) thì nhân kết quả với hệ số 0,787, theo thiamin clorua (C₁₂H₁₇ClN₄OS, M = 300,82) thì nhân kết quả với hệ số 0,892.

8  Độ chụm

8.1  Yêu cầu chung

Dữ liệu về độ chụm của phương pháp này dựa trên các phương pháp HPLC khác nhau áp dụng để xác định thiamin trong nghiên cứu so sánh quốc tế được tổ chức bởi Chương trình của Ủy ban Châu Âu về Thử nghiệm và Đo chuẩn thực hiện trên mẫu bột mì (CRM 121)/ sữa bột/sữa bột sấy phun (CRM 421), rau hỗn hợp đông khô (CRM 485) và gan lợn đông lạnh (CRM 487). Nghiên cứu cung cấp thông tin thống kê nêu trong Phụ lục B, Bảng B.1. Hơn nữa, dữ liệu về độ chụm bao gồm các kết quả nghiên cứu cộng tác của Pháp đối với mẫu thức ăn dùng bằng đường xông, thức ăn trẻ em bổ sung rau, sữa bột, thức ăn bổ sung hoa quả, men, ngũ cốc, bột sô cô la và thực phẩm bổ sung. Kết quả của nghiên cứu này được nêu trong Phụ lục B, Bảng B.2 và Bảng B.3.

8.2  Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giũa hai kết quả thử riêng rẽ, thu được khi tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại r.

Các giá trị đối với thiamin clorua hydroclorua là:

Bột mì nguyên cám	= 0,452 mg/100 g	r = 0,043 mg/100 g
Sữa bột/sữa bột sấy phun	= 0,645 mg/100 g	r = 0,071 mg/100 g
Rau hỗn hợp đông khô	= 0,295 mg/100 g	r = 0,039 mg/100 g
Gan lợn đông lạnh	= 0,807 mg/100 g	r = 0,088 mg/100 g
Thức ăn dùng bằng đường xông	= 0,11 mg/100 g	r = 0,02 mg/100 g
Thức ăn cho trẻ có bổ sung rau	= 0,20 mg/100 g	r = 0,05 mg/100 g
Sữa bột	= 0,56 mg/100 g	r = 0,1 mg/100 g
Thức ăn có bổ sung hoa quả	= 1,04 mg/100 g	r = 0,2 mg/100 g
Nấm	= 1,31 mg/100 g	r = 0,34 mg/100 g
Ngũ cốc	= 1,42 mg/100 g	r = 0,16 mg/100 g
Ngũ cốc	= 2,95 mg/100 g	r = 0,49 mg/100 g
Bột socola	= 1,55 mg/100 g	r = 0,36 mg/100 g
Thực phẩm bổ sung	= 486 mg/100 g	r = 111 mg/100 g

8.3  Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ, thu được khi tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau được phân tích bởi hai phòng thử nghiệm, không quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn tái lập R.

Các giá trị đối với thiamin clorua hydroclorua là:

Bột mì nguyên cám	= 0,452 mg/100 g	R = 0,190 mg/100 g
Sữa bột sữa bột sấy phun	= 0,645 mg/100 g	R = 0,243 mg/100 g
Rau hỗn hợp đông khô	= 0,295 mg/100 g	R = 0,178 mg/100 g
Gan lợn đông lạnh	= 0,807 mg/100 g	R = 0,623 mg/100 g
Thức ăn dùng bằng đường xông	= 0,11 mg/100 g	R = 0,1 mg/100 g
Thức ăn cho trẻ có bổ sung rau	= 0,20 mg/100 g	R = 0,12 mg/100 g
Sữa bột	= 0,56 mg/100 g	R = 0,25 mg/100 g
Thức ăn có bổ sung hoa quả	= 1,04 mg/100 g	R = 0,55mg/100 g
Nấm	= 1,31 mg/100 g	R = 0,48 mg/100 g
Ngũ cốc	= 1,42 mg/100 g	R = 0,75 mg/100 g
Ngũ cốc	= 2,95 mg/100 g	R = 1,16 mg/100 g
Bột socola	= 1,55 mg/100 g	R = 0,8 mg/100 g
Bột socola	= 1,55 mg/100 g	R = 0,8 mg/100 g
Thực phẩm bổ sung	= 486 mg/100 g	R = 212 mg/100 g

9  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm nên phù hợp với TCVN/ISO/IEC 17025 và ít nhất bao gồm các thông tin sau:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu;

b) phương pháp thử đã sử dụng hoặc viện dẫn tiêu chuẩn này;

c) ngày và thời gian lấy mẫu (nếu biết);

d) ngày nhận mẫu;

e) ngày thử nghiệm;

f) kết quả và các đơn vị kết quả biểu thị;

g) bất kỳ điểm đặc biệt nào quan sát được trong quá trình thử nghiệm;

h) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn cùng với các có thể ảnh hưởng tới kết quả.

Phụ lục A

(tham khảo)

Các ví dụ về sắc đồ HPLC

CHÚ DẪN

Hình A1 – Ví dụ về tách thiamin bằng HPLC theo chuẩn thiocrom sử dụng dẫn xuất trước cột

CHÚ DẪN

CHÚ THÍCH  Sắc ký đồ bổ sung đối với thịt/gan nêu trong Phụ lục D

Hình A.2 – Ví dụ về tách chuẩn thiamin bằng HPLC sử dụng dẫn xuất sau cột trong rau diếp (a), cơm (b) và thịt lợn luộc (c)

Phụ lục B

(tham khảo)

Dữ liệu về độ chụm

Theo những chỉ dẫn nghiên cứu chứng nhận EU SMT, các dữ liệu đưa ra trong Bảng B.1 đã được xác định trong một phép thử liên phòng thử nghiệm [10]. Viện nghiên cứu thực phẩm, Norwich, UK thay mặt cho Ủy ban EU tham gia nghiên cứu này. Các dữ liệu đưa ra trong Bảng B.2 và Bảng B.3 đã được xác định trong một phép thử liên phòng thử nghiệm của Pháp [5].

Bảng B.1 – Dữ liệu về độ chụm đối với bột mì thô, sữa bột/sữa bột sấy phun, rau hỗn hợp đông khô và gan lợn đông khô

Mẫu	CRM 121 Bột mì thô	CRM 421 Sữa bột/sữa bột sấy phun	CRM 485 Rau hỗn hợp đông khôa	CRM 487 Gan lợn đông khô
Năm thử nghiệm liên phòng	1996	1996	1996	1996
Số phòng thử nghiệm	13	14	12	15
Số lượng mẫu	2	2	2	2
Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ	13	14	12	15
Số ngoại lệ	0	0	0	0
Số kết quả được chấp nhận	65	70	58	72
Giá trị trung bình , mg/100 g	0,452	0,645	0,295	0,807
Độ lệch chuẩn lặp lại, sr, mg/100 g	0,015	0,025	0,012	0,031
Hệ số biến thiên lặp lại, %	3,2	3,8	4,2	3,9
Giá trị lặp lại r [r = 2,83 x sr], mg/100 g	0,043	0,071	0,039	0,088
Độ lệch chuẩn tái lập, sR, mg/100 g	0,053	0,085	0,063	0,182
Hệ số biến thiên tái lập, %	11,8	13,2	13,3	22,6
Giá trị tái lập R [R = 2,83 x sR], mg/100g	0,190	0,243	0,178	0,623
Giá trị HorRat, theo [13]	0,9	1,1	1,0	1,9
a Hỗn hợp của ngô ngọt, cà rốt và cà chua khô (10:1:1)

CHÚ THÍCH  Dữ liệu thu được trong nghiên cứu so sánh quốc tế này đã được tạo ra bằng cách sử dụng các phương pháp đã được xác định giống với các quy trình kiểm định định kỳ tại nhà của các phòng thí nghiệm tham gia với các hệ thống HPLC được mô tả trong Phụ lục C.

Bảng B.2 – Dữ liệu về độ chụm đối với thức ăn dùng bằng đường xông, thức ăn cho trẻ em bổ sung rau, sữa bột, thức ăn bổ sung hoa quả và nấm

Mẫu	Dung dịch thức ăn trong chai	Thức ăn cho trẻ em	Sữa bột	Bột trộn trái cây	Nấm
Năm nghiên cứu	1995	1995	1995	1995	1995
Số phòng thử nghiệm	10	10	10	10	10
Số lượng mẫu	1	1	1	1	1
Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ	8	10	10	10	10
Số ngoại lệ	2	0	0	0	0
Số kết quả được chấp nhận	16	20	20	20	20
Giá trị trung bình , mg/100 g	0,11	0,20	0,56	1,04	1,31
Độ lệch chuẩn lặp lại, sr,	0,01	0,02	0,04	0,07	0,12
Hệ số biến thiên lặp lại, %	7 %	8 %	7 %	7 %	9 %
Giá trị lặp lại r [r = 2,83 x sr], mg/100 g	0,02	0,05	0,1	0,2	0,34
Độ lệch chuẩn tái lập, sR, mg/100 g	0,04	0,04	0,08	0,19	0,17
Hệ số biến thiên tái lập	32 %	21 %	16 %	19 %	13 %
Giá trị tái lập R [R = 2,83 x sR], mg/100 g	0,1	0,12	0,25	0,55	0,48
Giá trị HorRat, theo [13]	1,0	1,5	1,3	1,7	1,2

Bảng B.3 – Dữ liệu về độ chụm đối với ngũ cốc, bột sôcôla và thức ăn bổ sung

Mẫu	Ngũ cốc	Ngũ cốc	Bột sôcôla	Thức ăn bổ sung
Năm nghiên cứu	1995	1995	1995	1995
Số phòng thử nghiệm	10	10	10	10
Số lượng mẫu	1	1	1	1
Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ	9	9	9	9
Số ngoại lệ	1	1	1	1
Số kết quả được chấp nhận	18	18	18	18
Giá trị trung bình , mg/100 g	1,42	2,95	1,55	486
Độ lệch chuẩn lặp lại, sr	0,06	0,18	0,13	39
Hệ số biến thiên lặp lại	4 %	6 %	8 %	8 %
Giá trị lặp lại r [r = 2,83 x sr], mg/100 g	0,16	0,49	0,36	111
Độ lệch chuẩn tái lập, sR, mg/100 g	0,27	0,41	0,28	75
Hệ số biến thiên tái lập	19 %	14 %	19 %	15 %
Giá trị tái lập R [R = 2,83 x sR], mg/100g	0,75	1,16	0,8	212
Giá trị HorRat, theo [13]	1,8	1,5	1,8	3,4 a
a Năm 1980, Horwitz et al, xuất bản đánh giá của 1000 so sánh liên phòng. Từ những nghiên cứu này, kết luận rằng giá trị HorRat là 1, với giới hạn chấp nhận được trong khoảng 0,5 đến 2,0, cho thấy độ chính xác liên phòng là phù hợp. Sự tương ứng trong độ lệch chuẩn tương đối của phòng thí nghiệm cho thấy khoảng một nửa đến hai phần ba so với độ lệch chuẩn tương đối giữa các phòng thí nghiệm. Độ lệch liên tục từ tỷ lệ ở mặt dưới (giá trị < 0,3 hoặc 0,5) có thể cho thấy mức trung bình không được báo cáo hoặc được đào tạo tốt và có kinh nghiệm.

Phụ lục C

(tham khảo)

Hệ thống HPLC thay thế

Việc tách và định lượng được chứng minh là thích hợp nếu áp dụng các điều kiện về sắc ký như sau [10]:

Bảng C.1 – Điều kiện HPLC thay thế

Phụ lục D

(tham khảo)

Hợp chất vitamin B1: 2-(1-hydroxyetyl)thiamin (HET) thực hiện dẫn xuất sau cột

Thông thường, hàm lượng vitamin B₁ được coi là thiamin và các dẫn xuất phosphat của nó. Tuy nhiên, việc sử dụng phương pháp dẫn xuất sau cột có thể cho thấy hai pic cho thiamin và xác nhận chất chuyển hóa phụ 2- (1-hydroxyetyl) thiamin (HET) đã được hiển thị, xem [11] và [12] và xem hình D.1. Nếu sử dụng kỹ thuật dẫn xuất trước cột, thì hai hợp chất thiamin và HET đồng rửa giải

Hàm lượng tương đối của HET được so sánh với thiamin phụ thuộc vào loại mẫu. Hàm lượng HET trong thịt và gan là 7% đến 23% hàm lượng thiamin. Trong nấm men, hàm lượng 3,8 %, trong khi ở bắp cải trắng, bông cải xanh, bột yến mạch, thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh, sữa bột, bột sữa và bột mì, hàm lượng không dưới 2 %, xem [7].

Phép xác định định lượng vitamin B₁ trong thực phẩm bằng dẫn xuất sau cột được khuyến nghị bao gồm việc xác định định lượng riêng thiamin và HET khi phân tích các mẫu thịt và để kiểm tra các mẫu khác cho sự xuất hiện của HET trên sắc ký đồ.

CHÚ DẪN

Y  huỳnh quang

X  thời gian (min)

1  thiamin mono phosphat(TMP) trong gan lợn ở 4,034 min

2  thiamin trong gan lợn ở 10,138 min

3   2-(1-Hydroxy Etyl) Thiamin (HET) trong gan lợn ở 11,741 min

4  TMP trong chuẩn 4,034 min

5  thiamin trong chuẩn ở 10,044 min

6  HET trong chuẩn ở 11,613 min

CHÚ THÍCH  Thông tin về HPLC nêu trong [7].

Hình D.1 – Sắc ký đồ của chất chiết CRM 487 gan lợn (a) và chuẩn 0,1 µg/ml TMP (thiamin mono phosphat), 0,1 µg/ml thiamin và 0,01 µg/ml HET (2-(1-hydroxyetyl)thiamin) (b)

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] BOGNAR A. Bestimmung von Riboflavin und Thiamine in Lebensmitteln mit Hilfe der Hochleistungsflussigkeitschromatographie (HPLC). Dtsch. Lebensmitt. Rundsch. 1981, 77 pp. 431-436

[2] HASSELMANN C., FRANCK D., GRIMM P., DIOP P.A., SOULES C. High-performance liquid chromatographic analysis of thiamine and riboflavin in dietetic foods. J. Micronutr. Anal. 1989, 5 pp. 269-279

[3] BOGNAR A. Determination of vitamin B1 in food by High-Performance-Liquid-Chromatography and postcolumn derivatization. FreseniusJ. Anal. Chem. 1992, 343 pp. 155-156

[4] HAGG M., KUMPULAINEN J. Thiamine and riboflavin contents in domestic and imported cereal products in Finland. J. Food Compos. Anal. 1993, 6 pp. 299-306

[5] ARELLA F., LAH£LY S., BOURGUIGNON J.B., HASSELMANN C. Liquid chromatographic determination of vitamin B1 and B2 in foods. A collaborative study. Food Chem. 1996, 56 pp. 81-86

[6] EITENMILLER R.R., LANDEN W.O. Vitamin Analysis for the Health and Food Sciences. CRC Press, Boca Raton, London, New York, Washington, D.C., 1999, pp. 271-97.

[7] JAKOBSEN J. Optimisation of the determination of thiamin, 2-(1-hydroxyethyl)thiamine, riboflavin in food samples by use of HPLC. Food Chem. 2008, 106 pp. 1209-1217

[8] DAWSON R.M.C., ELLIOTT D.C., ELLIOT W.H., JONES K. Data for Biochemical Research. Oxford Science Publication 3rd. ISBN 0 19 855299 8,1989

[9] HAGG M. Effect of various commercially available enzymes in the liquid chromatographic determination with external standardization of thiamine and riboflavin in foods. J. AOAC Int. 1994, 77 pp. 681-686

[10] FINGLAS P.M., SCOTT K.J., WTTTHOFT C.M., VAN DEN BERG H., DE FROIDMONT-GORTZ I. The certification of the mass fractions of vitamins in four reference materials: Wholemeal flour (CRM 121), milk powder (CRM 421), lyophilised mixed vegetables (CRM 485) and lyophilised pig’s liver (CRM 487). EUR-report 18320. Office for Official Publications of the European Communities, Luxembourg, 1999

[11] TAKASHI U., YUKIKO T., KOHEI M., MARI T., KANAME K. Simultaneous determination of 2(1-hydroxyethyl)thiamine and thiamine in foods by high performance liquid chromatography with post-column derivatisation. Vitamins (Japan). 1990, 64 pp. 379-385

[12] TAKASHI U., YUKIKO T., KOHEI M., MASAKO M., KANAME K. Distribution and stability of 2(1-hydroxyethyl)thiamine and thiamine in foods. Vitamins (Japan). 1991,65 pp. 249-256

[13] HORWITZ W., ALBERT R. The Horwitz Ratio (HorRat): A useful Index of Method Performance with Respect to Precision. J. AOAC Int. 2006, 89 pp. 1095-1109

[14] THOMPSON M. Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb concentrations in relation to fitness for purpose criteria in proficiency testing. Analyst (Lond.). 2000,125 pp. 385-386

[15] HORWITZ W., KAMPS L.R., BOYER K.W. Quality assurance in the analysis of foods and trace constituents. J. AOAC Int. 1980, 63 pp. 1344-1354

[16] OLLILAINEN V., FINGLAS P.M., VAN DEN BERG H., DE FROIDMONT-GORTZ I. Certification of B-Group Vitamins (B1, B2, B6, and B12) in Four Food Reference Materials. J. Agric. Food Chem. 2001,49 pp. 315-321

[17] TCVN ISO/IEC 17025:2007 (ISO/IEC 17025:2005), Yêu cầu chung về năng lực của phòng thử nghiệm và hiệu chuẩn