TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 6189-1:2009 (ISO 7899-1 : 1998) VỀ CHẤT LƯỢNG NƯỚC – PHÁT HIỆN VÀ ĐẾM KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT – PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP THU NHỎ (SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT) ĐỐI VỚI NƯỚC MẶT VÀ NƯỚC THẢI

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 6189-1 : 2009

ISO 7899-1 : 1998

CHẤT LƯỢNG NƯỚC – PHÁT HIỆN VÀ ĐẾM KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT –  PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP THU NHỎ (SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT) ĐỐI VỚI NƯỚC MẶT VÀ NƯỚC THẢI

Water quality – Detection and enumeration of intestinal enterococci – Part 1: Miniaturized method (Most Probable Number) for surface and waste water

Lời nói đầu

TCVN 6189-1 : 2009 thay thế TCVN 6189-1 : 1996.

TCVN 6189-1 : 2009 hoàn toàn tương đương với ISO 7899-1 : 1998/Cor 1 : 2000.

TCVN 6189-1 : 2009 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn Quốc gia TCVN/TC 147 Chất lượng nước biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ cộng bố.

TCVN 6189 (ISO 7899) Chất lượng nước – Phát hiện và đếm khuẩn đường ruột gồm hai phần sau đây:

– TCVN 6189-1 : 2009 (ISO 7899-1 : 1998/Cor 1 : 2000) Phần 1: Phương pháp thu nhỏ (số có xác suất lớn nhất) đối với nước mặt và nước thải;

– TCVN 6189-2 : 2009 (ISO 7899-1 : 2000) Phần 2: Phương pháp lọc màng.

Lời giới thiệu

Mục đích của tiêu chuẩn này là để đếm số vi khuẩn đường ruột chính E.faecalis, Ε.faecium, Ε.durans và Ε.hirae thường xuất hiện trong phân người và động vật. Một số loài vi khuẩn Entorococcus như Ε.avium, Ε.columbae và Ε.gallinarum và đặc biệt chủng Streptococcus bovist/equinus có thể xuất hiện nhưng rất ít khi gặp trong mẫu môi trường. Độ phát hiện các vi khuẩn này là thấp. Enterococcus casseliflavus và Ε.mundtii là loài không có nguồn gốc từ phân nhưng khi xuất hiện trong mẫu nước (ví dụ do ảnh hưởng của vật liệu và một số loại nước thải công nghiệp) thì được đếm như vi khuẩn đường ruột có nguồn gốc từ phân. Các loài này và số ít các loài khác không có nguồn gốc từ phân có xu hướng sinh ra sắc tố màu vàng trên môi trường nuôi cấy không chọn lọc. Do vậy, phải xét đến cản trở của các loài Enterococcus không có nguồn gốc từ phân khi diễn giải kết quả.

 

CHẤT LƯỢNG NƯỚC – PHÁT HIỆN VÀ ĐẾM KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT –  PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP THU NHỎ (SỐ CÓ XÁC SUẤT LỚN NHẤT) ĐỐI VỚI NƯỚC MẶT VÀ NƯỚC THẢI

Water quality – Detection and enumeration of intestinal enterococci – Part 1: Miniaturized method (Most Probable Number) for surface and waste water

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp thu nhỏ để phát hiện và đếm khuẩn đường ruột chính trong nước mặt và nước thải bằng cách nuôi cấy trong môi trường lỏng. Phương pháp này có thể áp dụng cho tất cá các loại nước mặt và nước thải, đặc biệt là nước có chứa một lượng lớn các chất lơ lửng.

Phương pháp này không thích hợp cho nước uống và các loại nước có số đếm theo hướng dẫn nhỏ hơn 15 trên 100 ml.

2 Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 5992 : 1995 (ISO 5667-2 : 19911)) Chất lượng nước – Lấy mẫu – Phần 2: Hướng dẫn kỹ thuật lấy mẫu;

TCVN 6663-1 : 2002 (ISO 5667-1 : 19802)) Chất lượng nước – Lấy mẫu – Phần 1: Hướng dẫn lập chương trình lấy mẫu;

TCVN 6450 : 2007 (ISO/IEC Guide 2 : 2004) Tiêu chuẩn hóa và các hoạt động có liên quan – Thuật ngữ chung và định nghĩa;

TCVN 6663-3 : 2008 (ISO 5667-3 : 2003) Chất lượng nước – Lấy mẫu – Phần 3: Hướng dẫn bảo quản và xử lý mẫu;

ISO 8199 : 19883) Water quality – General guide to the enumeration of microorganism by culture (Chất lượng nước – Hướng dẫn chung để đếm vi sinh vật bằng nuôi cấy);

ISO 3951 : 1989 Sampling procedures and charts for inspection by variables for percent nonconforming (Qui trình lấy mẫu và biểu đồ để thanh tra dùng biến thiên theo phần trăm không phù hợp).

3 Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này, áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa trong TCVN 6450 (ISO/IEC Hướng dẫn 2) và các thuật ngữ sau:

3.1

Khuẩn đường ruột (Intestinal enterococci)

Vi khuẩn có khả năng phát triển hiếu khí ở 44 ^oC và thủy ngân 4-metylbeliferyl--D-glucosi (MUD) khi có tali axetat, axit nalidic và 2,3,5-triphenyltetrazolium clorua (TTC) trong môi trường lỏng xác định.

4 Nguyên tắc

Mẫu đã pha loãng được nuôi cấy trong các giếng cấy của đĩa microtit có chứa môi trường cấy đã loại nước.

Phiến giếng cấy được kiểm tra trong tối có ánh sáng cực tím ở 366 nm sau khi ủ trong khoảng thời gian từ 36 h đến 72 h tại 44 ^oC ± 0,5 ^oC. Sự có mặt của khuẩn đường ruột được chỉ thị bằng huỳnh quang là kết quả của sự thủy phân MUD. Kết quả được đưa ra là số có xác suất lớn nhất trên 100 ml (MNP).

5 Thiết bị, dụng cụ

Ngoại trừ các dụng cụ, thiết bị vô khuẩn được cấp, tất cả các dụng cụ thủy tinh phải được khử khuẩn theo ISO 8199.

Các thiết bị của phòng thí nghiệm phân tích vi sinh thông thường và cụ thể:

5.1 Thiết bị để khử khuẩn bằng sấy nhiệt (lò) hoặc bằng hơi (nồi hấp).

5.2 Tủ ủ có nhiệt độ ổn định, đặt ở nhiệt độ 44 ^oC ± 0,5 ^oC.

5.3 Hầm sấy (lò sấy kiểu hầm) hoặc phòng sấy bằng luồng khí (nên dùng loại II).

5.4 Buồng quan sát lắp đèn UV (Đèn Wood 366 nm).

CẢNH BÁO – Ánh sáng UV có thể gây kích ứng da và mắt. Sử dụng găng và kính bảo vệ.

5.5 Máy đo khúc xạ cầm tay (tùy chọn).

5.6 pH mét, với độ chính xác = 0,1.

5.7 Ống nghiệm, 16 mm x 160 mm và 20 mm x 200 mm, hoặc bình có dung tích tương tự.

5.8 Pipet nhiều đầu điều chỉnh được hoặc pipet có sẵn 8 đầu điều chỉnh được, hoặc hệ thống phù hợp để đo và phân chia 200 l trên một giếng cấy.

5.9 Ống chóp vô khuẩn lắp vào đầu pipet dùng cho multipipet.

5.10 Thiết bị lọc màng, phù hợp với ISO 8199, kể cả cái lọc màng có cỡ lỗ danh nghĩa 0,2 m, để khử khuẩn môi trường lỏng.

5.11 Phiến giếng cấy vô khuẩn, 96 giếng cấy, 350 l, đáy phẳng, không cản ánh sáng huỳnh quang.

5.12 Băng dính vô khuẩn để bọc kín đĩa cấy microtit.

5.13 Đĩa Petri vô khuẩn, đường kính 90 mm.

6 Lấy mẫu

Lấy mẫu và đưa đến phòng thí nghiệm theo TCVN 6663-1 (ISO 5667-1), TCVN 5992 (ISO 5667-2) và TCVN 6663-3 (ISO 5667-3).

7 Môi trường nuôi cấy và dung dịch pha loãng

7.1 Hướng dẫn chung

Để đảm bảo có kết quả, chuẩn bị môi trường nuôi cấy và dung dịch pha loãng, sử dụng các thành phần có chất lượng đồng nhất và hóa chất phân tích hoặc dung dịch pha loãng đã loại nước hoặc môi trường hoàn chỉnh được chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Chuẩn bị các chất này với nước cất hoặc nước đã loại khoáng, không chứa các chất có khả năng gây ức chế hoặc thúc đẩy sự phát triển vi khuẩn trong các điều kiện thử nghiệm. Nếu chưa sử dụng môi trường ngay, có thể lưu giữ môi trường này đến một tháng trong tối ở (5 ± 3) ^oC và trong các điều kiện tránh mọi sự thay đổi thành phần của chúng.

CHÚ THÍCH       Có thể sử dụng các hóa chất có chất lượng khác nếu các hóa chất này cho tính năng như nhau trong phép thử.

7.2 Dung dịch pha loãng

7.2.1 Dung dịch pha loãng đặc biệt (SD)

Muối biển tổng hợp4)                                         22,5 g

Dung dịch bromophenol xanh (tùy chọn)                        10 ml

Nước đã loại khoáng hoặc nước cất (7.2.2)        1000 ml

Tiệt trùng trong nồi hấp (5.1) ở 121 ^oC ± 3 ^oC trong 15 min đến 20 min.

Dung dịch bromophenol xanh được chuẩn bị bằng cách thêm 0,04 g vào 100 ml etanol 50 %. Dung dịch này chỉ dùng để tạo màu xanh cho SD và để tránh nhầm lẫn với nước đã loại khoáng hoặc nước cất.

7.2.2 Nước đã loại khoáng hoặc nước cất

Nước được dùng để pha loãng cần được loại khoáng hoặc nước cất không chứa các chất gây ức chế sự phát triển dưới các điều kiện thử nghiệm.

Tiệt trùng trong nồi hấp (5.1) trước khi dùng ở 121 ^oC ± 3 ^oC trong 15 min đến 20 min.

7.3 Môi trường nuôi cấy: Môi trường MUD/SF

7.3.1 Thành phần

7.3.1.1 Dung dịch A

Tryptoza                                                           40 g

KH₂PO₄                                                             10 g

D(+)-galactoza                                                  2 g

Polyoxyetylensorbitan moncoleat (Tween® 805))  1,5 ml

Nước đã loại khoáng hoặc nước cất (7.2.2)        900 ml

Cho tryptoza, KH₂PO₄, galactoza, và Tween® 80 vào 900 ml nước, trong khi làm nóng nhẹ và khuấy bằng khuấy từ, sau đó đun sôi đến khi tan hoàn toàn. Để nguội.

7.3.1.2 Dung dịch B

NaHCO₃                                                            4 g

Axit nalidixic                                                     250 mg

Nước đã loại khoáng hoặc nước cất (7.2.2)        50 ml

Cho cả hai hóa chất trên vào 50 ml nước trong khi đun nóng nhẹ và khuấy bằng khuấy từ. Để nguội.

7.3.1.3 Dung dịch C

Thalium axetat                                                   2 g

2,3,5-triphenyltetrazolium clorua                         0,1 g

Nước đã loại khoáng hoặc nước cất (7.2.2)        50 ml

Cho cả hai hóa chất trên vào 50 ml nước trong khi đun nóng nhẹ và khuấy bằng khuấy từ. Để nguội.

7.3.1.4 Dung dịch D

MUD (4-metylbeliferyl--D-glucosi)                    150 mg

N,N-dimetylfomamid                                          2 ml

CẢNH BÁO – Talium axetat và N,N-dimetylfomamid là các chất độc. Sử dụng các hóa chất này trong tủ hút.

7.3.2 Chuẩn bị

Trộn các dung dịch A + B + C + D với nhau.

Điều chỉnh pH đến 7,5 ± 0,2.

Tiệt trùng bằng cách lọc qua màng có cỡ lỗ trung bình 0,2 m (5.10).

Phân bổ dung dịch vào đĩa microtit 96 giếng cấy (5.11) với thể tích 100 l môi trường cho mỗi giếng cấy (dung tích giếng cấy tối thiểu là 350 l) và loại nước ngay trong tủ sấy kiểu hầm hoặc hộp sấy bằng dòng khí (5.3).

Sản xuất môi trường nuôi cấy cần đáp ứng được các tiêu chí về chất lượng đưa ra ở Phụ lục Ε.

8 Cách tiến hành

8.1 Lựa chọn số lần pha loãng

Số lần pha loãng để cấy thay đổi theo mức nhiễm bẩn dự kiến của nước được thử. Bảng 1 đưa ra một số ví dụ.

Bảng 1

8.2 Chuẩn bị sự pha loãng

CHÚ THÍCH       Qui trình này phải được thực hiện trong tủ an toàn sinh học về pha loãng và hút bằng pipet, do sợi khí có thể tạo ra.

8.2.1 Nước ngọt và nước lợ (thải) [độ muối < 30 g/kg, đo bằng máy đo khúc xạ (5.5) hoặc phương pháp tương đương].

Chuẩn bị số lượng ống nghiệm vô khuẩn (5.7) tương ứng theo số lần pha loãng đã chọn, đặt trên một cái giá, cho 9 ml dung dịch pha loãng đặc biệt (7.2.1) vào mỗi ống.

Khấy nhẹ mẫu (xem điều 6) để thu được sự phân bổ các loài vi sinh vật đồng nhất và sử dụng pipet vô khuẩn, chuyển ngay 9 ml dung dịch mẫu đồng nhất này vào ống thứ nhất có chứa 9 ml dung dịch pha loãng (7.2.1) (Pha loãng 1/2).

Dùng pipet mới, chuyển 1 ml dung dịch này (đã đồng nhất) vào ống thứ hai (pha loãng 1/20).

Từ ống thứ hai (đã được đồng nhất và pha loãng 1/20) nếu cần, pha loãng tiếp 1/10 để đạt độ pha loãng 1/200.

Tiếp tục như trên tới khi tất cả pha loãng đã được chuẩn bị.

8.2.2 Nước biển (độ muối  30 g/kg)

Chuẩn bị số lượng ống nghiệm vô khuẩn (5.7) đặt lên giá, theo số lần pha loãng đã chọn, cho 9 ml nước đã loại khoáng hoặc nước cất (7.2.2) vào ống đầu tiên và 9 ml dung dịch pha loãng đặc biệt (7.2.1) vào các ống khác.

Khấy nhẹ mẫu (xem điều 6) để thu được sự phân bổ các loài vi sinh vật đồng nhất và sử dụng pipet vô trùng, chuyển ngay 9 ml dung dịch mẫu đồng nhất này vào ống thứ nhất có chứa 9 ml nước cất (7.2.2) (Pha loãng 1/2).

Dùng pipet mới, chuyển 1 ml dung dịch này (đã đồng nhất) vào ống thứ hai (pha loãng 1/20).

Từ ống thứ hai (đã đồng nhất và pha loãng 1/20) nếu cần, pha loãng tiếp 1/10 để đạt độ pha loãng 1/200.

Tiếp tục như trên tới khi tất cả dung dịch pha loãng đã được chuẩn bị.

8.3 Nuôi cấy và ủ phiến giếng cấy

8.3.1 Nuôi cấy

Chuyển toàn bộ các thành phần trong ống thứ nhất vào đĩa Petri đã khử khuẩn có đường kính tối thiểu 90 mm.

Dùng pipet nhiều đầu hút (5.8) với 8 ống chóp đã khử khuẩn (5.9), phân phối 200 l vào mỗi giếng của phiến giếng cấy (5.11) tương ứng với sự pha loãng thứ nhất này.

Các lần pha loãng sau đó (1/20, 1/200, …) tiến hành như trên nhưng thay đĩa petri và đầu 8 ống chóp pipet giữa mỗi lần pha loãng.

Cách khác, có thể dùng hệ thống phù hợp khác để (5.8) để phân chia 200 l của từng dung dịch pha loãng vào giếng cấy theo bảng 1.

CHÚ Ý – Cần chú ý sự nhiễm bẩn do tràn từ giếng cấy này sang giếng cấy khác.

8.3.2 Ủ

Mỗi lần đem phiến giếng cấy để ủ phải bọc lại bằng băng dính vô trùng dùng một lần dùng cho mục đích nuôi cấy.

Ủ phiến giếng cấy (5.2) ở 44 ^oC ± 0,5 ^oC ít nhất là 36 h và tối đa là 72 h.

CHÚ THÍCH       Phiến giếng cấy cần được giữ cẩn thận để không bị nghiêng.

8.4 Đọc kết quả

Đặt từng phiến giếng cấy, kể cả băng dính, vào buồng quan sát có lắp đèn UV (5.4).

Tất cả các giếng quan sát thấy màu xanh huỳnh quang được coi là dương tính.

CHÚ THÍCH       Việc đọc có thể tiến hành bất cứ lúc nào sau 36 h, vì ánh sáng huỳnh quang không làm biến đổi kết quả theo thời gian.

9 Thể hiện kết quả

9.1 Xác định số lượng đặc tính

Đối với mỗi lần pha loãng đã chọn, ghi lại số lượng giếng cấy dương tính (+).

VÍ DỤ 1: Nước bể bơi

1/2                    32 + của 64

1/20                  5 + của 32

Ghi 32/5 là số lượng đặc tính.

VÍ DỤ 2: Nước mặt khác

1/2                    24 + của 24

1/20                  18 + của 24

1/200                5 + của 24

1/2 000             1 + của 24

Ghi 18/5/1 là số lượng đặc tính

VÍ DỤ 3: Nước thải

1/2                    16 + của 16

1/20                  16 + của 16

1/200                12 + của 16

1/2 000             5 + của 16

1/20 000            0 + của 16

1/200 000          0 + của 16

Ghi 12/5/0 là số lượng đặc tính

Khi ba hoặc nhiều dung dịch pha loãng đã được cấy, cần phải ghi lại số lượng đặc tính bằng ba chữ số, kết thúc 0 nếu có thể theo ISO 8199.

9.2 Tính toán MPN và khoảng tin cậy của chúng

MPN là ước lượng thống kê của mật độ vi sinh vật, coi là tương ứng với sự phân bố Poisson trong thể tích đã cấy. Khoảng tin cậy được kèm với MPN này.

Phần mềm đưa ra ở Phụ lục A hoặc B có thể tính toán MPN của khuẩn đường ruột trên mililit nước đối với từng cấu hình nuôi cấy và khoảng tin cậy 95 %.

VÍ DỤ 1: Cho rằng CN là số đặc tính, LO giới hạn dưới và UP giới hạn trên:

Nếu CN = 32/5, phần mềm trong Phụ lục A sẽ cho 7,56 khuẩn đường ruột trên mililit.

[LO = 5,42 – UP = 10,54],

nghĩa là 756/100 ml (542 đến 1054)

VÍ DỤ 2:

Nếu CN = 18/5/1, phần mềm trong Phụ lục A sẽ cho 159,08/ml.

[LO = 101,99 – UP = 248,11]

VÍ DỤ 3:

Nếu CN = 12/5/0, phần mềm trong Phụ lục A sẽ cho 1 724,61/ml.

[LO = 1 003,98 – UP = 2962,50]

Nếu không có giếng cấy nào cho kết quả dương tính, thể hiện kết quả như sau:

< n/100 ml

Trong đó n là MPN đối với 1 giếng cấy dương tính trong điều kiện pha loãng đã dùng.

10 Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm cần bao gồm tất cả chi tiết cần thiết để nhận dạng đầy đủ mẫu, viện dẫn đến phương pháp đã dùng và kết quả.

Báo cáo thử nghiệm cũng cần đề cập đến mọi hiện tượng đặc biệt quan sát được trong thử nghiệm và mọi thao tác không qui định hoặc tùy chọn trong phương pháp mà có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm.

11 Dữ liệu đặc tính của phương pháp

Thông tin liên quan đến độ lặp lại và độ tái lập của qui trình, thu được từ phép thử liên phòng thí nghiệm được đưa ra ở Phụ lục D.

 

Phụ lục A

(tham khảo)

Ví dụ về phần mềm phân tích thống kê MPN

10         REM**************************************************************************

20         REM GENERAL PURPOSE PROGRAM FOR MPN, ITS S.E., C.I.

30         REM AND HOMOGENEITY TEST STATISTICS

40         REM**************************************************************************

50         REM

60         DIM A(10,6),X2(3,9)

70         REM SET PROGRAM LIMITS

80         D9=10

90         U9=50

100       L9=0

110       A1=.0005

120       E1=85

130       REM SET CHI-SQUARED SIGNIFICANCE LEVELS

140       GOSUB 1000

150       REM READ IN RESULTS OF A DILUTION SERIES

160       GOSUB 2000

170       REM CALC AND PRINT THE MPN

180       GOSUB 3000

190       REM CALC AND PRINT S.E. OF LOG10(MPN)

200       GOSUB 4000

210       REM CALC AND PRINT 95 PERCENT C.I. FOR MPN

220       GOSUB 5000

230       REM CALC AND PRINT DEVIANCE

240       GOSUB 6000

250       STOP

1000     REM SET CHI-SQUARE SIGNIFICANCE LEVELS

1010     FOR I=1 TO 3

1020     FOR J=1 TO 9

1030     READ X2(I.J)

1040     NEXT J

1050     NEXT I

1060     REM 5 PERCENT LEVELS DF=1…9

1070     DATA 3.84, 5.99, 7.81, 9.49, 11.07

1080     DATA 12.59, 14.07, 15.51, 16.92

1090     REM 1 PERCENT LEVELS

1100     DATA 6.63, 9.21, 11.34, 13.28, 15.09

1110     DATA 16.81, 18.48, 20.09, 21.67

1120     REM .1 PERCENT LEVELS

1130     DATA 10.83, 13.81, 16.27, 18.47, 20.52

1140     DATA 22.46, 24.32, 26.12, 27.88

1150     RETURN

2000     REM READ IN RESULTS OF A DILUTION SERIES

2010     PRINT “MPN GENERAL PURPOSE PROGRAM”

2020     PRINT “*******************************************”

2030     PRINT ” ”

2040     PRINT “M.A. HURLEY AND M.E. ROSCOE”

2050     PRINT ” ”

2060     PRINT “NUMBER OF DILUTION LEVELS……K=”:

2070     INPUT N

2080     IF N<1 THEN GOTO 2060

2090     IF N<=D9 THEN GOTO 2120

2100     PRINT “ERROR *** LEVELS EXCEED MAXIMUM”

2110     STOP

2120     S1=0

2130     FOR I=1 TO N

2140     PRINT ” ”

2150     PRINT “LEVEL NUMBER………………………I=”:|

2160     PRINT “DILUTION FACTOR………………….D=”:

2170     INPUT A(I,2)

2180     PRINT “SUBSAMPLE VOLUME………………V=”:

2190     INPUT A(I,1)

2200     PRINT “NUMBER OF SUBSAMPLES………..N=”:

2210     INPUT A(I,3)

2220     PRINT “NUMBER OF POSITIVE SUBSAMPLES..P=”:

2230     INPUT A(I,4)

2240     PRINT “IS THE DATA CORRECT FOR LEVEL”:|:”(Y OR N)”:

2250     INPUT R$

2260     IF R$=”Y” THEN 2280

2270     GOTO 2140

2280     A(I,5)=A(I,1)*A(I,2)

2290     A(I,6)=A(I,5)*A(I,4)

2300     S1=S1+A(I,5)*A(I,3)

2310     NEXT I

2320     RETURN

3000     REM CALCULATES AND PRINTS MPN

3010     B1=0

3020     S3=0

3030     FOR J=1 TO N

3040     E2=A(J,5)*U9

3050     IF E2<E1 GOTO 3080

3060     E2=0

3070     GOTO 3090

3080     E2=EXP(-E2)

3090     S3=S3+A(J,6)/(1-E2)

3100     NEXT J

3110     IF S3-S1>=0 THEN 3130

3120     GOTO 3200

3130     FOR I=1 TO N

3140     A(I,5)=A(I,5)*2

3150     A(I,6)=A(I,6)*2

3160     NEXT I

3170     S1=S1*2

3180     B1=B1+1

3190     GOTO 3020

3200     X3=L9

3210     X4=U9

3220     X=(X3+X4)/2

3230     S=0

3240     FOR I=1 TO N

3250     E2=A(I,5)*X

3260     IF E2<E1 GOTO 3290

3270     E2=0

3280     GOTO 3300

3290     E2=EXP(-E2)

3300     S=S+A(I,6)/(1-E2)

3310     NEXT I

3320     IF ABS(S-S1)<A1 THEN 3380

3330     IF S-S1>0 THEN 3360

3340     X4=X

3350     GOTO 3220

3360     X3=X

3370     GOTO 3220

3380     X5=X*(2^B1)

3390     PRINT ” ”

4000     REM CALCS AND PRINTS S.E OF LOG10 (MPN)

4010     S2=0

4020     FOR I=1 TO N

4030     X3=A(I,5)

4040     E2=X3*X

4050     IF E2<E1 GOTO 4080

4060     X4=0

4070     GOTO 4090

4080     X4=EXP(-E2)

4090     S3=X3*X3*A(I,3)*X4

4100     S3=S3/(1-X4)

4110     S2=S2+S3

4120     NEXT I

4130     V=1/(X*X*S2)

4140     S1=SQR(V)/LOG(10)

4150     PRINT ” ”

4160     PRINT “S.E. OF LOG10 (MPN)=”:S1

4170     RETURN

5000     REM CALCS 95 PERCENT C.I. FOR MPN

5010     X3=LOG(X)+B1*LOG(2)

5020     S2=SQR(V)

5030     U=EXP(X3+1.96*S2)

5040     L=EXP(X3-1.96*S2)

5050     PRINT ” ”

5060     PRINT “95 PERCENT C.I. =”:L:”TO”:U

5070     RETURN

6000     REM CALCS. AND PRINTS DEVIANCE

6010     S3=0

6020     FOR I=1 TO N

6030     S4=0

6040     IF A(I,4)<=0 GOTO 6110

6050     E2=A(I,5)*X

6060     IF E2<E1 GOTO 6090

6070     E2=0

6080     GOTO 6100

6090     E2=EXP(-E2)

6100     S4=A(I,4)*LOG(A(I,4)/(A(I,3)*(1-E2)))

6110     S3=S3+S4

6120     S4=0

6130     IF A(I,4)>=A(I,3) GOTO 6160

6140     S4=A(I,3)-A(I,4)

6150     S4=S4*(LOG(S4/A(I,3))+A(I,5)*X)

6160     S3=S3+S4

6170     NEXT I

6180     D=2*S3

6190     REM CHI-SQUARED TEST OF DEVIANCE

6200     V=N-1

6210     PRINT ” ”

6220     PRINT “DEFIANCE =”:D:”ON”:V:”D.F.”

6230     PRINT ” ”

6240     PRINT “CHI-SQUARED SIGNIFICANCE LEVELS FOR”:V:”D.F.”

6250     PRINT ” 5 PERCENT “:X2(1,V)

6260     PRINT ” 1 PERCENT “:X2(2,V)

6270     PRINT ” .1 PERCENT “:X2(3,V)

6280     RETURN

7000     END

 

Phụ lục B

(tham khảo)

Ví dụ về phần mềm ước tính MPN

10         DIM T (20)

20         DIM M (20)

30         DIM P (20)

40         L = 0

45         CLS : L = L + 1

50         PRINT “CALCULATION OF MPN N     “:L

60         PRINT “……………………………….”

70         A = 1

80         PRINT

90         INPUT “NB OF DILUTIONS”:DI:PRINT : PRINT

110       PRINT

120       P = 0; S = : U = 0

130       FOR I = 1 TO DI

140       PRINT “DILUTION”:I

150       INPUT “NB OF POSITIVE WELLS..”: P(I)

155       INPUT “NB OF WELLS………………”: T(I)

160       INPUT “WATER VOLUME/WELL (ML)…”:M(I):PRINT

170       P = P(I) + P

180       S = ((T(I) – P(I))*M(I)) + S

190       U = (M(I) * T(I)) + U

200       NEXT I

280       K = 1

290       NP = (P/U) * 2 ^ (K + K/2 + K/4 + K/8 + K/16 + K/32 + K/64 + K/128 + K/256 + K/512)

300       PM = 0

310       FOR I = 1 TO DI

320       PM = PM + ((P(I) * M(I) * EXP (-M(I) * NP)) / (1 – EXP(-M(I) * NP)))

330       NEXT I

340       IF PM < S THEN 370

350       K = K + A

360       GOTO 290

370       DT= S – PM

380       IF ABS (DT) <= .000005 GOTO 702

390       K = K – A

400       A = A / 10

410       GOTO 290

702       FOR I = 1 TO DI:ES = ES + P(I):NEXT I

710       FOR I = 1 TO DI

720       K(I) = (T(I) * (M(I)^2))

730       NEXT I

740       FOR I = 1 TO DI

745       IF (NP * M(I) > 88 THEN E(I) = 1.65E38:GOTO 760

750       E(I) = (EXP (M(I) * NP) -1)

760       NEXT I

770       LL = 0

780       FOR I = 1 TO DI

790       LL = LL + (K(I) / E(I))

800       NEXT I

810       CL = (LOG (NP) – (1.96 * (1 / (NP * SQR (LL)))))

817       CU = (LOG (NP) + (1.96 * (1 / (NP * SQR (LL)))))

840       NP = INT (NP * 100 + .5) / 100

850       PRINT : PRINT ” NPP = “:NP:”/ ML”

860       PRINT : PRINT

870       PRINT “LIMITS INF=”:INT (EXP (CL)*100 + .5)/100:” / ML SUP=”:INT (EXP (CU)*100 + .5)/100:” / ML”

880       PRINT : PRINT : INPUT “DO YOU WANT ANOTHER MPN (Y/N)?”:RE$

890       IF RE$ = “N” THEN END

900       GOTO 45

 

Lệnh

Sau khi hiển thị số chạy (L, dòng 50)

Nhập số pha loãng (dòng 90)

Đối với mỗi dung dịch pha loãng

– hiển thị số lần pha loãng (dòng 140),

– nhập số giếng hoặc ống phản ứng dương tính (dòng 150),

– nhập số giếng cấy dung dịch pha loãng (dòng 155),

– nhập thể tích nước đã cấy trên một giếng, tính bằng mililit (dòng 160).

Tính toán MPN theo De Man [2] (dòng 280-410).

Tính toán giới hạn dưới và giới hạn trên của khoảng tin cậy theo De Man [2] (dòng 770-817).

Hiển thị

– MPN (trên ml) (dòng 850),

– giới hạn dưới (trên ml) (dòng 870),

– giới hạn (trên ml) (dòng 870).

Câu hỏi: “Có chạy tiếp không?:”

Nếu không: END.

 

Phụ lục C

(tham khảo)

Muối biển tổng hợp

C.1 Thành phần ion chính của muối biển tổng hợp

C.2 Ví dụ về chuẩn bị các dung dịch từ các chất đã định

Ba dung dịch cơ bản được làm như sau:

Dung dịch A

CaCl₂.2H₂O                                83,6 g

KCl                                           43,5 g

SrCl₂.6H₂O                                0,07 g

Nước cất                                  đến 1 000 ml

Dung dịch B

NaHCO₃                                    15,15 g

Na₂B₄O₂                                    3,0 g

Nước cất                                  đến 1 000 ml

Dung dịch C

MgSO₄.7H₂O                             190,0 g

MgCl₂.6H₂O                               147,0 g

Nước cất                                  đến 1 000 ml

Pha loãng dung dịch được pha bằng cách thêm đến 960 ml nước cất, 10 ml dung dịch A, 10 ml dung dịch B, 20 ml dung dịch C và 14,9 g natri clorua, trộn đều đến khi tan hoàn toàn và điều chỉnh pH đến 7,5 ± 0,2. Dung dịch pha loãng được chia vào các bình chứa có thể tích yêu cầu và khử khuẩn bằng nồi hấp ở (121 ± 3) ^oC trong 15 min.

 

Phụ lục D

(tham khảo)

Đặc tính của phương pháp

Độ lặp lại (r) và độ tái lập (R) được tính theo TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) đã nêu dưới đây là phần của phép thử liên phòng thí nghiệm:

Nước bể bơi

(mẫu thêm, 100 phòng thí nghiệm ở Pháp, làm 3 đợt vào năm 1995 và 1996) (một nước biển và hai nước ngọt, không có sự sai khác đáng kể):

i)          Tại mức 100 khuẩn đường ruột/100 ml   r = 1,5

R = 2,7

ii)          Tại mức 400 khuẩn đường ruột/100 ml   r = 2,1

R = 3,7

Và thời gian thử nghiệm (trong 1993 và 1994) của chín phòng thí nghiệm và bốn mẫu (nhiễm bẩn tự nhiên):

b) Nước sông có chứa

từ 2,2 x 10³ đến 1,5 x 10⁴ khuẩn đường ruột/100 ml        r = 1,5

R = 2,7

c) Nước cống có chứa

từ 1,9 x 10⁴ đến 5,1 x 10⁵ khuẩn đường ruột/100 ml        r = 2,6

R = 3,9

 

Phụ lục E

(tham khảo)

Chuẩn cứ chất lượng để sản xuất môi trường trong phiến giếng cấy

Ε.1 Khái quát

Đối với mỗi chuẩn cứ sau đây, kiểm soát chất lượng cần phải được thực hiện trên từng mẻ phiến giếng cấy được sản xuất. Phiến giếng cấy được thử nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên hoặc hệ thống để cấu thành nên mẫu theo ISO 3951, tương ứng với mức kiểm soát chung No.II của kiểm soát thông thường.

Ngưỡng dương tính của phiến giếng cấy được định rõ do bị mức huỳnh quang dẫn đến kết quả đọc dương tính không bị mờ, tới mắt nhìn, dưới ánh sáng Wood (366 nm). Mức này được đo khi áp dụng điều khoản của phụ lục F.

Chuẩn cứ chất lượng chú ý được đưa ra từ Ε.2 đến Ε.5. Mẻ cần được loại bỏ nếu bất cứ chuẩn cứ nào không được đáp ứng.

Ε.2 Ngưỡng

Không có giếng cấy dương tính trong mỗi phiến giếng cấy mẫu, sau khi cấy dung dịch pha loãng tiệt trùng đặc biệt và ủ trong 48 h ở (44 ± 0,5) ^oC. Số giếng cấy chứa môi trường nuôi cấy có phản ứng dương tính phải dưới 25 % ngưỡng dương tính đã quy định ở trên và hệ số phương sai phải dưới 10 %.

Ε.3 Mức huỳnh quang trung bình

Đây là trung bình hình học của dấu hiệu huỳnh quang thu được từ 96 giếng của phiến giếng cấy đã cấy đồng nhất 200 l cho mỗi giếng huyền phù Ε.faecalis CCM 2541 chứa 500 vi sinh vật trên ml. Dung dịch pha loãng đặc biệt (7.2.1), và ủ ở 48 h tại (44 ± 0,5) ^oC. Dấu hiệu trung bình thu được như vậy cần phải ít nhất là hai lần ngưỡng dương tính và hệ số phương sai phải dưới 10 %.

Ε.4 Độ sinh sản

Độ sinh sản được tính là tỉ số của số lượng các loài quan sát được với mẻ của phiến giếng cấy thử nghiệm với số vi sinh vật dự đoán với vật liệu chuẩn bền vững (giá trị mục tiêu). Mức nồng độ cần phải xung quanh độ chính xác tối đa của phương pháp, nghĩa là khoảng một vi sinh vật trên giếng (500/100 ml). Độ bền và độ đồng nhất (giá trị mục tiêu và khoảng tin cậy) của mẫu chuẩn cần phải được xác định với một (hoặc một vài) mẻ phiến giếng cấy đã chấp nhận. Ngưỡng chấp nhận của phiến giếng cấy được thử ở 0,66 đến 1,5 giá trị quan tâm. Hệ số phương sai cần phải thấp hơn 10 %.

Các chủng được thử nghiệm là:

Ε.faecium WR63         Có thể lấy từ RIVM, Bilthoven, Hà Lan

Có thể lấy từ Bộ sưu tập vi sinh vật của Séc, Brno, Cộng hòa Séc

Thời gian ủ là 48 h ở (44 ± 0,5) ^oC.

Ε.5 Cản trở

Khả năng chọn lọc của phiến giếng cấy được thử nghiệm bằng cách cấy vi sinh vật giống với các loại mục tiêu:

 Có thể lấy từ Viện Pasteur, Pari, Pháp

Huyền phù có chứa từ 10⁴ đến 10⁵ các vi sinh vật này trên 100 ml được cấy vào từng phiến giếng cấy thử nghiệm dựa trên 32 giếng trên một chủng. Sau khi ủ khoảng 48 h tại (44 ± 0,5) ^oC, không giếng nào cho thấy huỳnh quang rõ ràng hơn chuẩn cứ đã qui định về ngưỡng nền (25 % của ngưỡng phản ứng dương tính) hoặc kết tủa formazan.

 

Phụ lục F

(qui định)

Chuẩn bị phiến giếng cấy hiệu chuẩn

F.1 Vật liệu và thuốc thử

Thiết bị phòng thí nghiệm hiện có (cân chính xác, pH mét, dụng cụ thủy tinh) và:

F.1.1 4-metylumbeliferon.

F.1.2 Etanol.

F.1.3 0,8 % dung dịch natri clorua.

F.1.4 Glyxin.

F.1.5 Natri hydroxyt.

F.1.6 Phiến giếng cấy 96 giếng.

F.2 Chuẩn bị dung dịch gốc

Chuẩn bị dung dịch gốc 4-metylumbeliferon trong etanol bằng cách hỗn hợp như sau:

4-metylumbeliferon        0,044 g

Etanol   10 ml

F.3 Chuẩn bị dung dịch đệm

F.3.1 Chuẩn bị các dung dịch sau

Dung dịch glyxin: Hòa tan 7,507 g glyxin và 5,84 g natri clorua trong 1000 ml nước cất.

Dung dịch natri hydroxit: Hòa tan 4 g natri hydroxit trong 1000 ml nước cất.

F.3.2 Cho 56,5 ml dung dịch glyxin [F.e.1a)] vào 43,5 ml dung dịch natri hydroxit [F.3.1 b)] vào cốc mỏ và máy khuấy. Kiểm tra giá trị pH là 10,3 bằng pH mét.

F.4 Chuẩn bị bản hiệu chuẩn

Tất cả các thao tác sau cần phải tiến hành ở nhiệt độ phòng.

Tất cả các dung dịch pha loãng cần được chuẩn bị sử dụng dung dịch natri clorua 0,8 % (F.1.3).

Chuẩn bị ngay dung dịch 1/100 dung dịch gốc (F.2). Từ dung dịch thu được này, hàng ngày chuẩn bị các dung dịch sau.

ST 1: 100 l dung dịch vừa chuẩn bị  + 0,9 ml dung dịch NaCl 0,8 %.

ST2: 0,5 ml dung dịch ST1                  + 0,5 ml dung dịch NaCl 0,8 %.

ST3: 0,5 ml dung dịch ST2                  + 0,5 ml dung dịch NaCl 0,8 %.

ST4: 0,5 ml dung dịch ST3                  + 0,5 ml dung dịch NaCl 0,8 %.

ST5: 0,5 ml dung dịch ST4                  + 0,5 ml dung dịch NaCl 0,8 %.

Hiển thị các dung dịch khác nhau trong các cột lẻ của phiến giếng cấy (F.1.6), như trong hình F.1 dưới đây (các cột chẵn không sử dụng).

Hình F.1

Cho vào từng giếng 100l dung dịch đệm có pH 10,3 (F.3.2). Do vậy thu được trong khoảng từ 0 pg đến 1 500 pg 4-metylumbeliferon trên microlit.

CHÚ THÍCH – Thực nghiệm cho thấy ngưỡng có phản ứng dương tính với 4-metylumbeliferon SIGMA (mẻ số M-1381) và phiến giếng cấy trong suốt có đáy bằng NUNC (ref. 1352) là 367 pg/l nếu phiến giếng cấy được đổ đầy dung dịch ST3 như mô tả trong phụ lục này.

 

Phụ lục G

(tham khảo)

Thư mục tài liệu tham khảo

[1]  TCVN 6910-1 (ISO 5725-2 : 1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập lại của phương pháp đo tiêu chuẩn.

[2]  DE MAN J.C. The probability of most probable numbers. Eur. J. Appl. Microbiol., 1. 1975, pp. 67-78.

[3]  DEVRIESE L.A., COLLINS M.D. and WIRTH R. The Genus Enterococcus. In : A. Balows et al. (Ed.) The Prokaryotes. 2nd edn., Vol. ii. 1992, pp. 1485-1481, Springer, NY.

[4]  HURLEY M. A. and ROSCOE M.E. Automated statistical analysis f microbial enumeration by dilution series.

[5]  KLEE A.J. A computer program for the determination of most probable numbers and its confidence limits, Microbiol. Methods, 18, 1993, pp. 91-98.

 

---