TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 7731:2008 (EN 14573 : 2004) VỀ SẢN PHẨM THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH 3-MONOCLOPROPAN-1,2-DIOL BẰNG SẮC KÝ KHÍ/PHỔ KHỐI (GC/MS)

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 7731 : 2008

EN 14573 : 2004

SẢN PHẨM THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH 3-MONOCLOPROPAN-1,2-DIOL BẰNG SẮC KÝ KHÍ/PHỔ KHỐI (GC/MS)

Foodstuffs – Determination of 3-Monochloropropane-1,2-diol by GC/MS

Lời nói đầu

TCVN 7731 : 2008 hoàn toàn tương đương với EN 14573 : 2004;

TCVN 7731 : 2008 do Tiểu ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F4/SC1 Gia vị biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

SẢN PHẨM THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH 3-MONOCLOPROPAN-1,2-DIOL BẰNG SẮC KÝ KHÍ/PHỔ KHỐI (GC/MS)

Foodstuffs – Determination of 3-Monochloropropane-1,2-diol by GC/MS

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sắc ký khí đầu dò phổ để xác định hàm lượng 3-Monoclopropan-1,2-diol (3-MCPD) trong protein thực vật thủy phân và các sản phẩm thực phẩm khác [1]. Phương pháp này đã được đánh giá hiệu lực trong các nghiên cứu liên phòng thử nghiệm trên dịch chiết malt, bột xúp, bánh mỳ vụn, xúc xích, salami, phomat và protein thực vật thủy phân.

2. Nguyên tắc

Mẫu được trộn với chuẩn nội đồng vị với dung dịch natri clorua và chất nhồi rắn. Hỗn hợp được chuyển vào cột sắc ký và được chiết, đầu tiên bằng hỗn hợp n-hexan và ete dietyl để loại bỏ các cấu tử không phân cực. Sau đó 3-MCPD được giải hấp bằng ete dietyl, dịch rửa giải được cô và tạo dẫn xuất bằng heptaflobutirylimidazon. Dung dịch được phân tích bằng sắc ký khí dầu dò khối phổ [2].

3. Thuốc thử

3.1 Yêu cầu chung

Chỉ sử dụng các thuốc thử thuộc loại tinh khiết phân tích và nước được sử dụng là nước cất hoặc nước đã loại khoáng, trừ khi có các quy định khác.

Tránh nhiễm bẩn nước, các dung môi, muối vô cơ… khi sử dụng dụng cụ bằng chất dẻo và cao su. Chỉ sử dụng dụng cụ thủy tinh để đựng các thuốc thử và nước.

CẢNH BÁO – Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn để an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn qui định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

3.2 n-Hexan, được chưng cất bằng dụng cụ thủy tinh.

3.3 Ete dietyl, được chưng cất bằng dụng cụ thủy tinh.

3.4 2,2,4-Trimetylpentan.

3.5 Etyl axetat.

3.6 Hỗn hợp dung môi, n-hexan (3.2) và ete dietyl (3.3) 9+1 (phần thể tích).

3.7 Dung dịch Natri clorua, hòa tan 290 g natri clorua trong 1 l nước.

3.8 Natri sulfat, khan.

3.9 Heptaflobutyrylimidazon.

3.10 Chất nhồi cột, Extrelut^®[1], đã được đóng gói khoảng 20 g.

3.11 3-Monoclopropan-1,2-diol (3-MCPD).

3.12 d5-3-Monoclopropan-1,2-diol (d5-3-MCPD), độ tinh khiết đồng vị tối thiểu 98 %.

Độ ổn định của d5-3-Monoclopropan-1,2-diol (d5-3-MCPD) bị hạn chế nên cần được kiểm tra.

3.13 Dung dịch gốc 3-MCPD, ρ(3-MCPD) = 1 mg/ml

Cân 25 mg 3-MCPD (3.11) và pha loãng tới vạch bằng etyl axetat (3.5) trong bình định mức 25 ml.

3.14 Dung dịch chuẩn 3-MCPD

Pha loãng 10 ml dung dịch gốc 3-MCPD (3.13) trong bình định mức 100 ml bằng etyl axetat (3.5) tới vạch. Từ dung dịch này, chuyển lần lượt các thể tích 0 μl; 12,5 μl; 25 μl; 125 μl; 250 μl và 500 μl vào bình định mức 25 ml, pha loãng bằng 2,2,4-trimetylpentan (3.4) tới vạch, dung dịch thu được có nồng độ 3-MCPD tương ứng là 0 μg/ml; 0,05 μg/ml; 0,10 μg/ml; 0,50 μg/ml; 1,0 μg/ml và 2.0 μg/ml.

3.15 Dung dịch gốc d5-3-MCPD, ρ(d5-3-MCPD) = 1 mg/ml

Cân 25 mg d5-3-MCPD (3.12) cho vào bình định mức 25 ml và pha loãng bằng etyl axetat (3.5) tới vạch.

3.16 Dung dịch chuẩn d5-3-MCPD, ρ(d5-3-MCPD) = 10 μg/ml

Pha loãng 1,0 ml dung dịch gốc d5-3-MCPD (3.15) trong bình định mức 100 ml bằng etyl axetat (3.5) tới vạch.

3.17 Nitơ

4. Thiết bị, dụng cụ

4.1 Yêu cầu chung

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.2 Thiết bị siêu âm.

4.3 Máy lắc vortex.

4.4 Máy trộn tốc độ cao.

4.5 Máy ly tâm, có vận tốc tối thiểu 3500 vòng/min, các ống ly tâm dung tích 100 ml.

4.6 Giấy lọc nhanh.

4.7 Cột sắc ký, đường kính trong 2 cm, dài 40 cm, có đĩa thủy tinh thiêu kết và khóa vặn.

4.8 Bộ cất quay, có nồi cách thủy và các bình cô dung tích 250 ml.

4.9 Xyranh, dung tích 1 ml, kín khí.

4.10 Hộp nhôm gia nhiệt.

4.11 Lọ thủy tinh nhỏ, dung tích 2 ml và 4 ml có nắp vặn.

4.12 Máy sắc ký khí, có bộ phận bơm mẫu chia dòng/ khôn chia dòng được nối với phổ khối, có khả năng kiểm soát chọn lọc ion hoặc quét toàn phần với độ nhạy cao.

5. Cách tiến hành

5.1 Chuẩn bị mẫu thử

Nghiền các mẫu khô như các loại hạt nêm và ngũ cốc đến mịn. Xay hoặc thái các mẫu bánh mỳ, phomat, xúc xích salami và thủy sản thành hỗn hợp đồng nhất. Trộn kỹ tất cả các mẫu trước khi phân tích.

Nếu không tiến hành phân tích ngay thì phải bảo quản các mẫu trong bao bì kín, làm lạnh đông nếu cần.

5.2 Chiết mẫu

5.2.1 Protein thực vật thủy phân, nước tương, bột xúp và dịch chiết malt

Cân 5 g bột xúp, 8 g mẫu protein thực vật thủy phân hoặc nước tương hoặc 10 g dịch chiết malt chính xác tới 0,01 g và thêm 100 μl dung dịch chuẩn nội d5-3-MCPD (3.16). Thêm dung dịch natri clorua (3.7) để thu được tổng khối lượng là 20 g (mẫu đã thêm dung dịch natri clorua). Trộn đều thành hỗn hợp đồng nhất, dùng dao trộn tán mịn tất cả các cục nhỏ. Đặt hỗn hợp vào thiết bị siêu âm (4.2) trong 10 min.

5.2.2 Bột, tinh bột, ngũ cốc và bánh mỳ

Cân 10 g mẫu thử chính xác tới 0,01 g và thêm 100 μl dung dịch chuẩn nội d5-3-MCPD (3.16). Thêm dung dịch natri clorua (3.7) để thu được tổng khối lượng là 40 g (mẫu đã thêm dung dịch natri clorua). Trộn tất cả các thành phần tới khi thu được hỗn hợp đồng nhất, dùng dao trộn nghiền mịn tất cả các cục nhỏ. Đặt hỗn hợp vào thiết bị siêu âm (4.2) trong 10 min. Đậy hỗn hợp bằng mặt kính đồng hồ và ngâm qua đêm.

5.2.3 Xúc xích salami và phomat

Cân 20 g mẫu thử chính xác tới 0,01 g và thêm 100 μl dung dịch chuẩn nội d5-3-MCPD (3.16). Thêm dung dịch natri clorua (3.7) để thu được tổng khối lượng là 70 g (mẫu đã thêm dung dịch natri clorua). Trộn tất cả các thành phần tới khi thu được hỗn hợp đồng nhất, có thể thêm tiếp 10 g dung dịch natri clorua, nếu cần. Chuyển hỗn hợp vào ống ly tâm (4.5) và ly tâm ở tốc độ 3500 vòng/min trong 20 min. Gạn lớp dịch nổi phía trên vào cốc có mỏ, tránh chuyển các thành phần rắn và chất béo thấy được. Cân 20 g phần dịch nổi vào cốc có mỏ 250 ml.

5.2.4 Kem, bơ, magarin và các loại chất béo màu vàng khác

Cân 20 g mẫu thử chính xác tới 0,01 g và thêm 100 μl dung dịch chuẩn nội d5-3-MCPD (3.16). Thêm dung dịch natri clorua (3.7) để thu được tổng khối lượng là 50 g (mẫu đã thêm dung dịch natri clorua). Đun nóng hỗn hợp đến 45^oC cho đến khi chất béo tan chảy hoàn toàn. Trộn 2 min trong máy trộn tốc độ cao (4.4) và để yên trong tủ lạnh 1 h hoặc để cho đến khi lớp chất béo đông lại. Gạn dung dịch natri clorua phía trên và cân 20 g phần dung dịch này vào cốc có mỏ 250 ml.

5.3 Cột sắc ký

Lấy 20 g hỗn hợp thu được trong 5.2.1 hoặc 5.2.2 hoặc dung dịch thu được trong 5.2.3 hoặc 5.2.4, thêm chất nhồi Extrelut trong các gói (3.10) và trộn kỹ tất cả các thành phần bằng dao trộn. Cho hỗn hợp vào cột sắc ký (4.7), lắc cột nhanh bằng tay để nhồi chặt, đổ lên trên cùng một lớp natri sulfat (3.8) 1 cm và để yên từ 15 min đến 20 min.

Chiết các thành phần không phân cực bằng 80 ml hỗn hợp dung môi (3.6) với tốc độ dòng không hạn chế, ngoại trừ với mẫu xúp đã chuyển thành bột, với loại sản phẩm này thì tốc độ dòng được hạn chế trong khoảng 8 ml/min đến 10 ml/min. Đậy nắp cột khi dung môi chạm tới lớp natri sulfat và loại bỏ dịch rửa thu được. Tiếp theo, rửa giải cột bằng 250 ml ete dietyl (3.3) với tốc độ dòng khoảng 8 ml/min và thu dịch rửa giải vào bình định mức 250 ml. Pha loãng dịch rửa giải tới vạch bằng ete dietyl và thêm 15 g natri sulfat (3.8) vào bình và để yên trong khoảng từ 10 min đến 15 min.

Lọc dịch rửa giải qua giấy lọc (4.6) vào bình cầu đáy tròn dung tích 250 ml. Cô dịch chiết tới khoảng 5 ml bằng bộ cất quay (4.8) với nhiệt độ của nồi cách thủy khoảng 35^oC. Không được để đến khô. Chuyển dịch chiết đã cô vào bình định mức 10 ml, tránh bình cầu đáy tròn và pha loãng bằng ete dietyl. Thêm 1 lượng nhỏ natri sulfat (dùng đầu dao trộn), lắc kỹ và để yên từ 5 min đến 10 min.

5.4 Tạo dẫn xuất

5.4.1 Tạo dẫn xuất dung dịch mẫu

Dùng xyranh kín khí (4.9) chuyển 1 ml dịch chiết thu được từ 5.3 vào lọ thủy tinh 4 ml (4.11) và cho bay hơi dung dịch vừa tới khô bằng dòng khí nitơ nhẹ (3.17).

CHÚ THÍCH: Một số người sử dụng phương pháp này cho thấy rằng việc sử dụng 2,2,4-trimetylpentan (3.4) làm chất giữ có thể tránh được thất thoát.

Thêm ngay 1 ml 2,2,4-trimetylpentan (3.4) và 0,05 ml heptaflobutyryllimidazon (3.9) vào lớp cặn và gắn kín nắp lọ. Lắc lọ trong vài giây bằng máy lắc vortex(4.3) và làm nóng lọ 20 min trong hộp gia nhiệt bằng nhôm (4.10) ở 70^oC. Để hỗn hợp nguội tới dưới 40^oC. Thêm 1 ml nước cất, lắc bằng máy lắc vortex trong 30 s, để các pha phân tách và sau đó lắc lại. Chuyển pha 2,2,4-trimetylpentan phía trên vào lọ nhỏ 2 ml (4.11), thêm một lượng nhỏ natri sulfat (dùng đầu dao trộn),lắc rồi để yên từ 2 min đến 5 min. Chuyển dung dịch này vào một lọ nhỏ (2 ml) mới để phân tích sắc ký khí.

5.4.2 Tạo dẫn xuất của dung dịch chuẩn

Chuyển 100 μl từng dung dịch chuẩn 3-MCPD (3.14), 10 μl chuẩn nội d5-3-MCPD (3.16), và 0,9 ml 2,2,4-trimetylpentan (3.4) vào một dãy sáu lọ nhỏ 4 ml (4.11). Thêm 0,05 ml heptaflobutyryllimidazon và gắn kín nắp lọ. Lắc lọ trong vài giây bằng máy lắc vortex (4.3) và làm nóng lọ 20 min trong hộp gia nhiệt bằng nhôm (4.10) ở 70^oC. Để hỗn hợp nguội tới dưới 40^oC. Thêm 1 ml nước cất, lắc bằng máy lắc vortex trong 30 s, để tách pha và lắc lại. Chuyển pha 2,2,4-trimetylpentan phía trên vào lọ nhỏ (2 ml) (4.11), thêm một lượng nhỏ natri sulfat (dùng đầu dao trộn),lắc lọ và để yên từ 2 min đến 5 min. Chuyển dung dịch vào một lọ nhỏ (2 ml) mới để phân tích sắc ký khí.

Tiến hành thử mẫu trắng gồm 20 g dung dịch natri clorua (3.7) đồng thời với mỗi loạt mẫu.

5.5 Sắc ký khí/phổ khối

Tiêm các thể tích bằng nhau của các dung dịch mẫu thử thu được từ 5.4.1 và các dung dịch chuẩn thu được trong 5.4.2 vào máy sắc ký khí (4.12). Các điều kiện vận hành sắc ký khí thích hợp được nêu trong Phụ lục A.

Để định lượng, cho chạy máy sắc ký ở chế độ SIM và sử dụng 253 m/z cho 3-MCPD và 257 m/z cho d5-3-MCPD.

Để khẳng định, sử dụng 453 m/z, 291 m/z, 289 m/z, 275 m/z và 253 m/z cho 3-MCPD.

CHÚ THÍCH 1: Khối lượng phân tử M là 502 g/mol đối với 3-MCPD-diheptanflobutiryl-este và 507 g/mol đối với dẫn xuất d5-3-MCPD. Đối với các phân mảnh, thì 453 m/z là từ [M-CH₂Cl], 289 m/z và 291 m/z là từ [M-C₃F₇COO, Cl-35/Cl-37], 275 m/z là từ [M-C₃F₇COOCH₂] và 253 m/z là từ [M-C₃F₇COO-HCl]. Với dẫn xuất d5-3-MCPD, 257 m/z là từ [M-C₃F₇COO-DCl].

CHÚ THÍCH 2: Có thể dùng 456 m/z đối với d5-3-MCPD.

Nếu chỉ để khẳng định việc nhận dạng pic, thì chạy sắc đồ của dung dịch chuẩn có nồng độ thích hợp ở chế độ quét phổ toàn phần với dải từ 100 m/z đến 500 m/z.

CHÚ THÍCH 3: GC-MS/MS cũng thích hợp để định lượng và khẳng định việc nhận dạng pic.

6. Đánh giá kết quả

6.1 Tính toán

Từ các sắc đồ của các dung dịch chuẩn ở chế độ SIM, đo diện tích pic của 3-MCPD (253 m/z) và d5-3-MCPD (257 m/z) và tính tỷ số giữa diện tích pic 253 m/z và 257 m/z. Dựng đường chuẩn biểu thị tỷ số giữa diện tích pic với khối lượng theo microgam của 3-MCPD trong lọ. Tính độ dốc của đường chuẩn.

Tính phần khối lượng w_(3-MCPD) của 3-MCPD, theo miligam trên kilogam mẫu, sử dụng công thức (1):

W_(3-MCPD) =              (1)

trong đó

A   là diện tích pic của 3-MCPD ở 253 m/z thu được từ dung dịch mẫu thử;

A’   là diện tích pic của d5-3-MCPD ở 257 m/z thu được từ dung dịch mẫu thử;

b    là độ dốc của đường chuẩn;

m   là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam;

10  là hệ số pha loãng.

Độ thu hồi của chất chuẩn nội và 3-MCPD cần được kiểm tra thường xuyên.

6.2 Khẳng định việc nhận dạng pic

Từ sắc đồ thu được của dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu thử, tính tỷ số diện tích pic của cộng hưởng ở 291 m/z, 289 m/z, 275 m/z, 253 m/z và 453 m/z tương ứng với pic nền. Tối thiểu hai trong bốn tỷ số làm giàu ion của mẫu phân tích phải nằm trong khoảng ± 20 % của trung bình các tỷ số làm giàu ion của mẫu chuẩn.

Trong trường hợp phổ quét toàn phần và phổ quét đã trừ nền, thì phải đảm bảo rằng sự tách ra vừa khớp với chuẩn.

7. Độ chụm

7.1 Khái quát

Chi tiết phép thử nghiệm liên phòng về độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục B. Giá trị thuđược từ phép thử nghiệm liên phòng có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và các chất nền khác với dải nồng độ và chất nền đã nêu trong Phụ lục B.

7.2 Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm của hai phép thử đơn lẻ, độc lập thu được khi sử dụng cùng một phương pháp trên cùng vật liệu thử, do cùng một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bi, thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn nhất, không quá 5 % trường hợp vượt quá giới hạn độ lặp lại r.

Các giá trị đó là:

Protein thực vật thủy phân             = 0,029 mg/kg                         r = 0,006 mg/kg

Dịch chiết malt                              = 0,055 mg/kg                         r = 0,008 mg/kg

Bột xúp                                        = 0,045 mg/kg                         r = 0,011 mg/kg

Vụn bánh mỳ khô                          = 0,030 mg/kg                         r = 0,007 mg/kg

Xúc xích salami                             = 0,016 mg/kg                         r = 0,005 mg/kg

Một số loại phomat                       = 0,043 mg/kg                         r = 0,013 mg/kg

7.3 Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả của hai phép thử đơn lẻ, độc lập thu được trên cùng vật liệu thử, được báo cáo bởi hai phòng thử nghiệm, không quá 5 % trường hợp vượt quá giới hạn độ tái lập R.

Các giá trị đó là:

Protein thực vật thủy phân             = 0,029 mg/kg                         R = 0,010 mg/kg

Dịch chiết malt                              = 0,055 mg/kg                         R = 0,021 mg/kg

Bột xúp                                        = 0,045 mg/kg                         R = 0,022 mg/kg

Vụn bánh mỳ khô                          = 0,030 mg/kg                         R = 0,018 mg/kg

Xúc xích salami                             = 0,016 mg/kg                         R = 0,017 mg/kg

Một số loại phomat                       = 0,043 mg/kg                         R = 0,027 mg/kg

8. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm các thông tin sau đây:

– mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

– viện dẫn tiêu chuẩn này;

– các kết quả và đơn vị tính;

– ngày lấy mẫu và phương pháp lấy mẫu, nếu biết;

– ngày nhận mẫu của phòng thử nghiệm;

– ngày thử nghiệm;

– mọi điểm đặc biệt quan sát được trong quá trình thử nghiệm;

– mọi chi tiết thao tác không được quy định trong phương pháp này hoặc những điều được coi là tùy chọn có thể ảnh hưởng đến kết quả.

Phụ lục A

(tham khảo)

Ví dụ về các điều kiện vận  hành GC/MS thích hợp

Kích thước của cột           Dài 30 cm, đường kính trong 0,25 mm

Pha tĩnh của cột               DB 5-MS hoặc tương đương (metyl silicon có 5 % là các nhóm phenyl), độ dày màng phim 0,25 μm

Nhiệt độ của cột               50^oC trong min, được đặt chương trình để tăng nhiệt từ 50^oC đến 90^oC với vận tốc 2^oC/min và từ 90^oC đến 270^oC ở tốc độ gia nhiệt tối đa, duy trì nhiệt độ ở 270^oC trong 10 min

Nhiệt độ đầu tiêm             270^oC

Thể tích tiêm                    1 μl ở chế độ không chia dòng với thời gian không chia dòng là 40 s

Khí mang                         Heli, 1 ml/min

Nhiệt độ chuyển đổi         270^oC

Ion hóa                            Va đập điện tích dương

Quét                                Chế độ SIM (kiểm tra ion chọn lọc) 453 m/z, 291 m/z, 289 m/z, 275 m/z và 253 m/z (3-MCPD) và 257 m/z (d5-3-MCPD)

Chú giải

Y chiều cao pic

t   thời gian (min)

Hình A.1 – Sắc ký dòng ion tổng của d5-3-MCPD và 3-MCPD

Chú giải

Y chiều cao pic

t   các phân mảnh (m/z)

Hình A.2 – Khối phổ của d5-3-MCPD và 3-MCPD