TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 7787:2007 (ISO 14892 : 2002) VỀ SỮA BỘT GẦY – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN D BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 7787 : 2007

ISO 14892 : 2002

SỮA BỘT GẦY – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN D

BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Dried skimmed milk – Determination of vitamin D content using

high-performance liquid chromatography

Lời nói đầu

TCVN 7787 : 2007 hoàn toàn tương đương với ISO 14892:2002

TCVN 7787 : 2007 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

SỮA BỘT GẦY – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN D

BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Dried skimmed milk – Determination of vitamin D content using

high-performance liquid chromatography

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng vitamin D trong mẫu thử chứa ít nhất là 1mg vitamin D trên 100g [tương đương với 400 IU (đơn vị quốc tế) vitamin D trên 100 g] bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Các kết quả của phép xác định chỉ đáng tin cậy nếu, trong trường hợp xác định vitamin D₃ thì mẫu thử chỉ chứa vitamin D₃ và không chứa vitamin D₂ (được bổ sung vào làm chất chuẩn nội), còn trường hợp xác định vitamin D₂ thì mẫu chỉ chứa vitamin D₂ và không chứa vitamin D₃ (được bổ sung vào làm chất chuẩn nội). Điều này cần được xác định bằng qui trình không bổ sung chất chuẩn nội (vitamin D₂).

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm ban hành thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm ban hành thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi.

TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

3. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này áp dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

3.1 Hàm lượng vitamin D của sữa bột gầy (Vitamin D content of dried skimmed milk)

Phần khối lượng của các chất xác định được bằng qui trình qui định trong tiêu chuẩn này.

CHÚ THÍCH Hàm lượng vitamin D được biểu thị bằng microgam trên gam hoặc bằng đơn vị quốc tế (IU) của hoạt độ của vitamin D trên gam.

4. Nguyên tắc

Mẫu thử được xà phòng hóa và tách. Vitamin D được tách ra khỏi tạp chất bằng cách dùng HPLC pha chuẩn để làm sạch. Thu lấy vitamin D từ cột làm sạch. Hàm lượng này được xác định bằng cách sử dụng HPLC pha đảo có phát hiện bằng UV. Vitamin D₂ được dùng làm chất chuẩn nội trong phép xác định vitamin D₃ và ngược lại. Chất chuẩn nội được bổ sung vào từng phần mẫu thử trước khi xà phòng hóa.

5. Thuốc thử

Tất cả các thuốc thử được sử dụng phải thuộc loại phân tích, trừ khi có qui định khác.

5.1 Nước, phù hợp với loại 1 của TCVN 4851 (ISO 3696).

5.2 Etanol (C₂H₅OH), 95% (thể tích), không chứa aldehyt.

5.3 Dung dịch natri ascorbat, c(NaC₆H₅O₆.H₂O) = 200 g/l.

Nếu không có sẵn, thì chuẩn bị bằng cách hòa tan 3,5g axit ascorbic (C₆H₈O₆) trong 20 ml dung dịch natri hydroxit (NaOH) 1 mol/l. Chuẩn bị dung dịch mới trong ngày sử dụng.

5.4 Dung dịch kaly hydroxit, c(KOH) = 500 g/l.

Hòa tan 50g kali hydroxit (KOH) trong 50 ml nước vào bình định mức 100ml (6.6). Trộn và để nguội dung dịch thu được ở nhiệt độ phòng. Pha loãng bằng nước đến vạch và trộn đều. Chuẩn bị dung dịch mới trước khi sử dụng.

5.5 Dung dịch kali hydroxit trong cồn, c(KOH) = 30g/l.

Hòa tan 3g kali hydroxit (KOH) trong nước. Thêm 10 ml etanol (5.2) vào bình định mức 100 ml (6.6). Pha loãng bằng nước đến vạch 100 ml và trộn. Chuẩn bị dung dịch mới trước khi sử dụng.

5.6 Dầu nhẹ, có dải sôi từ 40⁰C đến 60⁰C hoặc từ 60⁰C đến 80⁰C.

5.7 Metanol (CH₃OH), loại dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPCL).

5.8 n-Hexan (C₆H₁₄), loại dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPCL).

5.9 n-Pentanol (C₅H₁₁OH), loại dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPCL).

5.10 Axetonitril (CH₃CN), loại dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPCL).

5.11 Propan-2-ol (C₃H₇OH), loại dùng cho sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPCL).

5.12 Nitơ, tinh khiết (không chứa oxi).

5.13 Hydroxytoluen đã butylat hóa (BHT), tinh khiết.

5.14 Dung dịch chống oxi hóa, 10 mg BHT (5.13) trên mililit n-hexan (5.8).

5.15 Giấy bọc, đường kính 9cm.

5.16 Dung dịch chuẩn vitamin D₃

5.16.1 Dung dịch chuẩn gốc vitamin D₃, ví dụ: Ph Eur hoặc USP1) cholecanxiferol chuẩn đối chứng.

Cân chính xác 20mg cholecanxiferol cho vào bình định mức một vạch 100 ml (6.6). Pha loãng bằng etanol (5.2) đến vạch và trộn.

Dung dịch này có thể bảo quản được 1 tháng trong tủ đông lạnh ở nhiệt độ -18⁰C±1⁰C.

5.16.2 Dung dịch I chuẩn làm việc vitamin D₃

Dùng pipet (6.7) lấy 10 ml dung dịch chuẩn gốc vitamin D₃ (5.16.1) cho vào bình định mức một vạch 100 ml (6.6). Pha loãng đến vạch bằng etanol (5.2) và trộn.

5.16.3 Dung dịch II chuẩn làm việc vitamin D₃

Dùng pipet (6.7) lấy 1 ml dung dịch I chuẩn làm việc vitamin D₃ (5.16.2) cho vào bình định mức một vạch 100 ml (6.6) thứ hai. Pha loãng bằng etanol (5.2) đến vạch và trộn. Dung dịch này chứa 0,2mg/ml (=8 IU/ml).

5.17 Dung dịch chuẩn vitamin D₂

5.17.1 Dung dịch chuẩn gốc vitamin D₂, ví dụ: Ph Eur hoặc USP¹ ergocanxiferol chuẩn đối chứng.

Cân chính xác 20 mg ergocanxiferol cho vào bình định mức một vạch 100 ml. Pha loãng bằng etanol (5.2) đến vạch và trộn.

Dung dịch này có thể bảo quản được 1 tháng trong tủ đông lạnh.

5.17.2 Dung dịch I chuẩn làm việc vitamin D₂

Dùng pipet (6.7) lấy 10 ml dung dịch chuẩn gốc vitamin D₂ (5.17.1) cho vào bình định mức một vạch 100ml (6.6). Pha loãng bằng etanol (5.2) đến vạch và trộn.

5.17.3 Dung dịch II chuẩn làm việc vitamin D₂

Dùng pipet (6.7) lấy 1 ml dung dịch I chuẩn làm việc vitamin D₂ (5.17.2) cho vào bình định mức một vạch 100 ml (6.6) thứ hai. Pha loãng bằng etanol (5.2) đến vạch và trộn. Dung dịch này chứa 0,2mg/ml (=8 IU/ml).

5.18 Dung dịch đối chứng

Chuẩn bị dung dịch đối chứng bằng cách trộn 1,00 ml dung dịch làm việc I chuẩn vitamin D₃ (5.16.2) và 1,00 ml dung dịch chuẩn làm việc I vitamin D₂ (5.17.2) trong bình định mức 100 ml và pha loãng bằng metanol (5.7) đến vạch. Dung dịch đối chứng này chứa 0,2mg/ml cholecanxiferol và 0,2 mg/ml ergocanxiferol (8 IU/ml vitamin D₃ và 8 IU/ml vitamin D₂).

5.19 Pha động dùng cho cột làm sạch

Loại khí n-hexan (5.8) dưới áp suất giảm. Trộn 3 ml n-pentanol (5.9) với 997 ml n-hexan vừa được loại khí (xem 6.3 và A.2.1).

5.20 Pha động dùng cho cột phân tích

Dùng hỗn hợp axetonitril/propan-2-ol/nước (tỷ lệ 90:7:3); ví dụ: trộn các lượng 900ml axetonitril (5.10), 70ml propan-2-ol (5.11) và 30 ml nước (5.1) (xem 6.4 và A.3.1).

6. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

6.1 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1mg, có thể đọc được đến 0,01mg.

6.2 Sắc ký lỏng, được gắn với detector cực tím.

Các điều kiện thao tác điển hình như sau:

detector UV loại có thể điều chỉnh độ hấp thụ ở bước sóng 265 nm hoặc ở bước sóng sẵn có gần nhất với detector cố định bước sóng;

hai cột, cột làm sạch và cột phân tích;

độ nhạy của detector là 0,128 AUFS (đơn vị hấp thụ trên toàn thang đo);

tốc độ vẽ đồ thị 10mm/min;

nhiệt độ môi trường xung quanh.

6.3 Cột sắc ký làm sạch, bằng thép không gỉ, dài 250mm và đường kính trong 4,6mm, được nhồi bằng silica có cỡ hạt 5mm (vật liệu pha chuẩn), đã qua thử kiểm tra ổn định hệ thống (A.2.1); tốc độ rửa giải 3 ml/min; thể tích bơm 600ml.

6.4 Cột sắc ký phân tích, bằng thép không gỉ, dài 250mm và đường kính trong 4,6mm, được nhồi bằng silica có cỡ hạt 5mm [C-18 hoặc ODS (octadexyldimetylsilan)], (vật liệu pha đảo)], đã qua thử kiểm tra ổn định hệ thống (A.3.1); tốc độ rửa giải 2ml/min; thể tích bơm 200ml.

6.5 Cốc có mỏ hoặc bình nón, dung tích 250ml.

6.6 Bình định mức một vạch, dung tích 100ml và 250ml.

6.7 Pipet một vạch, dung tích 1ml, 4ml, 5ml, 10ml, 20ml và 50ml.

6.8 Bình xà phòng hóa, dung tích khoảng 200ml, được gắn với bộ sinh hàn.

6.9 Nồi hơi, nồi cách thủy hoặc bếp đun bằng điện.

6.10 Phễu chiết, dung tích 500 ml, có nút đậy kín bằng polytetrafloetylen (PTFE).

6.11 Bình có đáy hình côn, dung tích 20ml và 250 ml.

6.12 Nồi cách thủy, có thể làm việc ở nhiệt độ 40⁰C±1⁰C và ở nhiệt độ đến 39⁰C.

6.13 Bộ cất quay, được gắn với bộ phận chân không.

6.14 Máy khuấy, ở phía trên.

7. Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707).

Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

8. Chuẩn bị mẫu thử

Trộn kỹ mẫu thử bằng cách liên tục xoay và lật ngược vật chứa mẫu nhiều lần. Chuyển hết mẫu thử sang vật chứa kín có dung tích vừa đủ, nếu cần.

9. Cách tiến hành

9.1 Khái quát

Đối với tất cả các thao tác, thực hiện trong ánh sáng dịu hoặc sử dụng dụng cụ thủy tinh có độ quang hóa thấp hoặc bảo vệ dụng cụ thủy tinh bằng lá nhôm.

Tất cả các dung môi bay hơi phải được thực hiện dưới áp suất giảm ở nhiệt độ nhỏ hơn 40⁰C. Không để bay hơi đến khô hẳn dưới áp suất giảm. Khôi phục lại áp suất khí quyển bằng dòng khí nitơ. Cho bay hơi các giọt cuối cùng bằng dòng khi nitơ.

Xem phụ lục A về các chi tiết bổ sung cho qui trình sắc ký.

9.2 Phần mẫu thử

Cân khoảng 50g (m₁) mẫu thử, chính xác đến 0,01g cho vào cốc có mỏ hoặc bình nón (6.5). Hòa tan mẫu trong 50ml nước nóng (60⁰C đến 80⁰C). Dùng dao trộn phá vỡ các cục bị vón thành tảng. Thêm tiếp 50 ml nước nóng (60⁰C đến 80⁰C) và trộn cho đến đồng nhất. Làm nguội hỗn hợp thu được đến nhiệt độ phòng. Cân cốc có mỏ (hoặc trong bình nón) chính xác đến 0,01 g và tính lượng chứa trong bình (m₂). Đồng hóa và cân khoảng 20 g (m₃) của mẫu vừa được chuẩn bị, chính xác đến 0,01g, cho vào bình xà phòng hóa (6.8).

9.3 Xà phòng hóa và tách chiết

9.3.1 Cho 20 ml dung dịch kali hydroxit (5.4), 10ml dung dịch natri ascorbat (5.3), 50 ml etanol (5.2) và 4,00ml dung dịch làm việc II chuẩn vitamin D₂ (5.16.3) làm chất chuẩn nội, vào phần mẫu thử trong bình xà phòng hóa (9.2). Trộn đều.

9.3.2 Cho đối lưu dung dịch thu được (9.3.1) trong 30 min trên nồi hơi (6.9) trong khi vẫn xoay bình. Làm nguội nhanh dưới vòi nước.

9.3.3 Chuyển dung dịch đã nguội (9.3.2) sang phễu chiết (6.10) dùng hai lần: mỗi lần 30ml nước, 10ml etanol (5.2) và 40ml dầu nhẹ (5.6). Lắc mạnh dung dịch 30 s và để yên cho đến khi tách hai lớp rõ. Chuyển pha phía dưới (thấp hơn) sáng phễu chiết (6.10) thứ hai và lắc trộn với hỗn hợp của 10ml etanol (5.2) và 40ml dầu nhẹ (5.6). Để cho tách lớp.

9.3.4 Chuyển pha lỏng thu được sang phễu chiết thứ ba và pha dầu nhẹ thu được sang phễu chiết thứ nhất (9.3.3) đã sử dụng. Rửa phễu chiết thứ hai đã sử dụng hai lần mỗi lần bằng 10ml dầu nhẹ (5.6). Cho nước rửa vào phễu chiết thứ nhất.

9.3.5 Lắc pha lỏng với 40ml dầu nhẹ (5.6) và 10ml etanol (5.2). Cho pha dầu nhẹ vào phễu chiết thứ nhất. Rửa dịch chiết bằng dầu nhẹ đã gộp ba lần, mỗi lần sử dụng 40 ml dung dịch kali hydroxit trong dung dịch etanol (5.5) mới chuẩn bị, lắc mạnh. Sau đó rửa bằng nước, mỗi lần dùng 40ml nước cho đến khi rửa trung tính với phenolphtalein. Để ráo nước, cho hai tấm giấy lọc (5.15) đã cắt thành dải, cho vào phễu chiết và lắc.

9.3.6 Chuyển chất chiết bằng dầu nhẹ đã được làm khô như trên vào bình đáy côn 250 ml (6.11). Tráng phễu chiết và giấy bằng dầu nhẹ. Cho nước tráng vào bình. Cho thêm từ 10mg đến 20mg BHT (5.13) vào bình.

9.3.7 Cho bay hơi lượng chứa trong bình đáy côn (9.3.6) đến gần khô dưới chân không bằng cách xoay bình trên nồi cách thủy (6.12) ở nhiệt độ tối đa là 39⁰C. Làm nguội dưới dòng nước chảy và phục hồi lại áp suất không khí bằng khí nitơ (5.12). Cho bay hơi các giọt dầu nhẹ cuối cùng bằng dòng khí nitơ. Hòa tan ngay cặn trong 2,00 ml n-hexan (5.8).

9.4 Tinh sạch

Bơm 600ml dung dịch thử được hòa tan lại (9.3.7) qua van phân phối mẫu vào cột làm sạch. Chỉnh các điều kiện hoạt động của detector để có được các pic lớn nhất có thể của vitamin D₂ và D₃ trên thang đo. Thu lấy các phân đoạn pic của vitamin D trong bình đáy côn 20ml (6.11) trong khoảng thời gian trước 3 min và sau 3 min. Thêm 1 ml dung dịch chống oxy hóa (5.14) và cho bay hơi đến khô dưới dòng khí nitơ. Hòa tan ngay dung dịch thử được làm sạch này trong 2,0ml methanol (5.7). Sử dụng dung dịch này để bơm lên cột phân tích.

9.5 Xác định

Bơm 200ml dung dịch thử đã tinh sạch (9.4) qua van phân phối mẫu vào cột phân tích. Chỉnh các điều kiện hoạt động của detector để có được các pic lớn nhất có thể của vitamin D₂ và D₃ trên thang đo. Đo pic của vitamin D₂ và D₃ trong dung dịch thử đã tinh sạch.

Bơm 200ml dung dịch đối chứng (5.18). Sử dụng các điều kiện thao tác tương tự đối với dung dịch thử như trên. Đo pic của vitamin D₂ và D₃ trong dung dịch đối chứng.

10. Tính toán và biểu thị kết quả

10.1 Tính toán

10.1.1 Hệ số độ nhạy tương đối

Tính hệ số độ nhạy tương đối, R_f, sử dụng công thức sau đây:

trong đó

là giá trị bằng số về diện tích pic (hoặc chiều cao) đối với ergocanxiferol trong sắc đồ thu được với dung dịch đối chứng (9.5);

là khối lượng của ergocanxiferol trong 1ml dung dịch đối chứng, tính bằng microgam;

là giá trị bằng số về diện tích pic (hoặc chiều cao) đối với cholecanxiferol trong sắc đồ thu được với dung dịch đối chứng (9.5);

là khối lượng của cholecanxiferol trong 1ml dung dịch đối chứng, tính bằng microgam.

10.1.2 Hàm lượng vitamin D

Tính hàm lượng vitamin D, w, bằng microgam cholecanxiferol trên gam hoặc hoạt độ của vitamin D, biểu thị bằng đơn vị quốc tế (IU) trên gam, sử dụng công thức sau:

trong đó

 là giá trị bằng số về diện tích pic (hoặc chiều cao) đối với cholecanxiferol trong sắc đồ thu được bằng dung dịch thử (9.5);

là khối lượng của ergocanxiferol (chất chuẩn nội) được bổ sung vào dung dịch thử (9.3.1) tính bằng microgam;

 là giá trị bằng số về diện tích pic (hoặc chiều cao) đối với ergocanxiferol trong sắc đồ thu được bằng dung dịch thử (9.5);

 là khối lượng của phần mẫu thử thu được tính bằng gam, sử dụng công thức sau đây:

10.2 Biểu thị kết quả

Biểu thị kết quả đến hai chữ số thập phân.

11. Độ chụm

11.1 Phép thử liên phòng thử nghiệm

Các chi tiết của liên phòng thử nghiệm tiến hành theo TCVN 6910-1 (ISO 5725-1) và TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) về độ chụm của phương pháp đã được công bố (xem [4]). Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và chất nền khác với các giá trị đã nêu.

Chý ý rằng khi vitamin ở dạng hỗn hợp khô, thì độ chụm bị ảnh hưởng lớn do tính đồng nhất của sản phẩm.

11.2 Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ độc lập, thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau trong một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5% các trường hợp lớn hơn 14% (tương đối) trung bình cộng của hai kết quả.

11.3 Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ, thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành thử trên vật liệu giống nhau trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do các người phân tích khác nhau sử dụng các thiết bị khác nhau, không quá 5% các trường hợp lớn hơn 17% trung bình cộng của hai kết quả.

12. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

– mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

– phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

– phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này.

– tất cả các chi tiết thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

– kết quả thử nghiệm thu được; và

– nếu đáp ứng được yêu cầu về độ lặp lại thì nêu kết quả cuối cùng thu được.

Phụ lục A

(qui định)

Chú thích về qui trình

A.1 Khái quát

Các chi tiết về qui trình sắc ký phụ thuộc vào thiết bị, kiểu loại, tuổi thọ và nhà cung cấp cột, cách hướng dẫn thử nghiệm và dung dịch đối chứng, cỡ mẫu và detector. Có thể sử dụng các cột có chiều dài khác nhau và do các hãng khác nhau sản xuất, lượng thể tích bơm có thể khác nhau, nếu các phép thử (A.2.1 và A.3.1) thỏa mãn về tính ổn định của hệ thống.

A.2 Sắc ký pha chuẩn

A.2.1 Kiểm tra tính ổn định của cột làm sạch

Bơm 600ml hỗn hợp vitamin D₂ và D₃. Chuẩn bị hỗn hợp này bằng cách trộn 1ml dung dịch chuẩn gốc vitamin D₃ (5.16.1) và 1ml dung dịch chuẩn gốc vitamin D₂ (5.17.1) vào bình định mức một vạch 100ml (6.6). Pha loãng bằng n-hexan (5.8) đến vạch 100ml. Sắc đồ của vitamin D₂ và vitamin D₃ không được tách biệt.

Tỷ lệ của n-pentanol và n-hexan ảnh hưởng đến hoạt động của sắc ký; tăng hàm lượng rượu của pha động sẽ làm giảm thời gian lưu.

A.2.2 Thời gian lưu

Thời gian lưu gần đúng của vitamin D₂ và vitamin D₃ trong sắc ký pha chuẩn với n-pentan-2-ol/n-hexan (3ml + 997ml) làm pha động và cột Partisil PAC 5mm là 8min.

A.3 Sắc ký pha đảo

A.3.1 Kiểm tra tính ổn định của cột phân tích

Bơm 200ml dung dịch đối chứng (5.18). Độ phân giải giữa các pic vitamin D₂ và vitamin D₃ ít nhất là 1,5.

Tính hệ số phân tách hoặc phân giải, R, bằng công thức sau đây:

trong đó

D là khoảng cách giữa các pic cực đại của vitamin D₂ và vitamin D₃, tính bằng centimet;

B là chiều rộng pic của vitamin D₂, tính bằng centimet;

C là chiều rộng pic của vitamin D₃, tính bằng centimet.

CHÚ THÍCH Hàm lượng nước trong pha động ảnh hưởng đến hoạt động của sắc ký; tăng hàm lượng nước sẽ làm tăng thời gian lưu.

A.3.2 Thời gian lưu

Thời gian lưu gần đúng của vitamin D₂ và vitamin D₃ trong sắc ký pha đảo với axetonitril/propanol-2-ol/nước tỉ lệ 90:7:3 làm pha động và cột Zorbax ODS 10mm là 13,5 min và 15 min tương ứng.

Để đảm bảo được độ nét pic của chất phân tích và chất chuẩn nội, sử dụng bước sóng kép ở 265nm và 280nm tương ứng.

A.4 Giới hạn phát hiện

Giới hạn phát hiện là 2,5mg trên 100g bằng 100 IU/100g.

Phụ lục B

(tham khảo)

Hoạt độ được biểu thị bằng đơn vị quốc tế (IU)

B.1 Hoạt độ của vitamin D

Hoạt độ của vitamin D được biểu thị bằng đơn vị quốc tế (IU). Người ta đã xác định được rằng 1 IU vitamin D tương đương với hoạt độ vitamin D của 0,025mg cholecanxiferol (vitamin D₃).

Nghĩa là hoạt độ vitamin D của 1 g cholecanxiferol tinh khiết, được biểu thị bằng IU, bằng 4 x 10⁷ IU.

B.2 Phân tích chuẩn vitamin D (cholecanxiferol tinh khiết)

Cân 50 mg cholecanxiferol, chính xác đến 0,1mg, cho vào bình định mức một vạch 100ml (6.6). Hòa tan ngay cholecanxiferol và không phải làm nóng trong etanol không chứa aldehyt. Pha loãng bằng etanol không chứa aldehyt đến vạch 100ml và trộn dung dịch thu được (dung dịch A). Dùng pipet lấy 5,0ml dung dịch (A) cho vào bình định mức một vạch 250ml (6.6). Pha loãng bằng etanol không chứa aldehyt đến vạch 250 ml và trộn dung dịch (dung dịch B). Nồng độ của vitamin D phải ở khoảng 400 IU/ml.

Đo độ hấp thụ của dung dịch B trong vòng 30 min kể từ khi bắt đầu chuẩn bị dung dịch A.

Kiểm tra độ hấp thụ tối đa của dung dịch B, A_m, ở bước sóng 265nm ± 1nm, dùng etanol làm dung dịch bù. Đo độ hấp thụ, A_n, ở bước sóng 265nm. Giá trị độ hấp thụ thu được phải nằm trong khoảng từ 0,46 đến 0,50.

CHÚ THÍCH Giá trị độ hấp thụ điển hình của cholecanxiferol trong etanol là 480 tại bước sóng 265nm.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 6400 (ISO 707) Sữa và sản phẩm sữa – Lấy mẫu.

[2] TCVN 6910-1:2001 (ISO 5725-1:1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo. Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa.

[3] TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2:1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo. Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lặp của phương pháp đo tiêu chuẩn.

[4] FINGLAS, P.M., BERG van den, H., FROIDMONT-GORTZ de, I. European commission, BCR Information Reference Materials: The certification of the mass fractions of vitamins in three reference materials: Margarine (CRM 122), Milk powder (CRM 421) and Lyophilized Brussels sprouts powder (CRM 431), EUR report 18039, 1997 (ISSN 1018-5593).

[5] European Pharmacopoeia, Monograph vitamin D.