TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 7900:2008 (ISO 8552 : 2004) VỀ SỮA – ƯỚC TÍNH VI SINH VẬT ƯA LẠNH – KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC Ở 21 ĐỘ C (PHƯƠNG PHÁP NHANH)

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 7900 : 2008

ISO 8552 : 2004

SỮA – ƯỚC TÍNH VI SINH VẬT ƯA LẠNH – KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC Ở 21 ⁰C (PHƯƠNG PHÁP NHANH)

Milk – Estimation of psychrotrophic microorganisms – Colony-count technique at 21 ⁰C (Rapid method)

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp ước tính nhanh số lượng vi sinh vật ưa lạnh bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 21⁰C.

Tiêu chuẩn này có thể áp dụng cho sữa nguyên liệu và sữa thanh trùng.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi.

TCVN 6261 (ISO 6730), Sữa – Định lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc từ các vi sinh vật ưa lạnh – Kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 6,5 ⁰C.

TCVN 6263 (ISO 8261), Sữa và sản phẩm sữa – Hướng dẫn chung về chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh.

TCVN 6404 : 2008 (ISO 7218 : 2007), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật.

ISO/TS 11133-1, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Guidelines on preparation and production of culture media – Part 1: General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media in the laboratory (Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Hướng dẫn chuẩn bị và tạo môi trường cấy – Phần 1: Các hướng dẫn chung về đảm bảo chất lượng cho việc chuẩn bị môi trường cấy trong phòng thử nghiệm)

ISO/TS 11133-2; Microbiology of food and animal feeding stuffs – Guidelines on preparation and production of culture media – Part 2: Practical guidelines on performance testing of culture media (Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Hướng dẫn chuẩn bị và tạo môi trường cấy – Phần 2: Các hướng dẫn thực hành về thử tính năng của môi trường cấy).

3. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này áp dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau đây:

3.1.

Vi sinh vật ưa lạnh (psychrotrophic microorganisms)

Các vi khuẩn, nấm men, nấm mốc hình thành các khuẩn lạc có thể đếm được khi được ủ trong điều kiện hiếu khí ở 6,5 ⁰C trong 10 ngày, dưới các điều kiện qui định trong TCVN 6261 (ISO 6730).

4. Nguyên tắc

4.1. Chuẩn bị các đĩa thạch, sử dụng môi trường cấy qui định và môi trường xác định của dung dịch pha loãng thích hợp từ mẫu thử.

4.2. Ủ ấm các đĩa trong điều kiện hiếu khí ở 21 ⁰C trong 25h.

4.3. Tính số lượng vi sinh vật trên mililit mẫu thử từ số lượng khuẩn lạc thu được trên các đĩa đã chọn ở các mức pha loãng thích hợp sao cho thu được kết quả có nghĩa.

5. Môi trường nuôi cấy và dịch pha loãng

5.1. Yêu cầu chung

Xem TCVN 6404 : 2008 (ISO 7218 : 2007) và ISO/TS 11133-1.

5.2. Dung dịch pha loãng

Xem TCVN 6263 (ISO 8261).

5.3. Môi trường nuôi cấy – Thạch sữa đếm đĩa

5.3.1 Thành phần

5.3.2 Chuẩn bị

5.3.2.1 Chuẩn bị từ môi trường khô có bán sẵn

Theo hướng dẫn của nhà sản xuất, nhưng trong mọi trường hợp nên bổ sung bột sữa gầy ngay cả khi nhà sản xuất cho rằng không cần thiết. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2 ở 25 ⁰C, nếu cần.

5.3.2.2 Chuẩn bị từ các thành phần cơ bản khô

Hòa tan trong nước theo thứ tự sau: dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein bằng enzym, glucoza và cuối cùng là bột sữa gầy. Để hòa tan nên đun nóng nước. Thêm thạch và đun đến sôi trong khi vẫn khuấy cho đến khi thạch tan hết.

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2 ở 25 ⁰C, nếu cần.

5.3.2.3 Phân phối, khử trùng và bảo quản

Phân phối môi trường đã chuẩn bị vào các ống nghiệm (6.6) với các lượng từ 12 ml đến 15 ml hoặc vào các bình cầu hoặc chai (6.7) có dung tích không quá 500 ml. Khử trùng 15 min trong nồi hấp áp lực (6.10) ở 121 ⁰C.

Nếu môi trường được sử dụng ngay, thì làm nguội trên nồi cách thủy (6.4) ở nhiệt độ từ 44 ⁰C đến 47 ⁰C.

Nếu không, bảo quản môi trường ở nơi tối ở 30 ⁰C ± 2 ⁰C không qua ba tháng [xem TCVN 6404 : 2008 (ISO 7218 ; 2007)]. Trước khi kiểm tra vi sinh và để tránh chậm trễ khi rót môi trường, nên làm tan chảy hoàn toàn môi trường đã bảo quản, rồi làm nguội nồi cách thủy (6.4) ở nhiệt độ từ 44 ⁰C đến 47 ⁰C trước khi sử dụng (xem 8.2.4).

Về việc kiểm tra nhiệt độ của môi trường và các yêu cầu khác, xem TCVN 6404 : 2008 (ISO 7218 : 2007).

5.3.3 Kiểm tra hiệu năng của việc đảm bảo chất lượng môi trường cấy

Kiểm tra hiệu năng của môi trường theo ISO/TS 11133-2.

6. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN 6404 : 2008 (ISO 7218 : 2007)], cụ thể như sau:

6.1. Dụng cụ thủy tinh

Có thể dùng dụng cụ sử dụng một lần thay thế cho các dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiểu lần nếu đáp ứng được các yêu cầu tương tự. Dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần phải chịu được việc khử trùng nhiểu lần và phải trơ về mặt hóa học.

6.2. Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ ở 21 ⁰C ± 1 ⁰C.

6.3. Máy đo pH, có độ chính xác hiệu chuẩn ± 0,1 đơn vị pH ở 25 ⁰C.

6.4. Nồi cách thủy, có khả năng duy trì nhiệt độ từ 44 ⁰C đến 47 ⁰C.

6.5. Dụng cụ đếm khuẩn lạc, ví dụ: gồm có nền được chiếu sáng với phông đen, được gắn với thấu kính khuếch đại với độ phóng đại hai lần và bộ đếm cơ hoặc đếm điện tử, tùy chọn.

6.6. Ống nghiệm, dung tích khoảng 20 ml, có nắp đậy thích hợp.

6.7. Bình cầu hoặc chai, có dung tích thích hợp nhưng không lớn hơn 500 ml, có nắp đậy thích hợp.

6.8. Pipet chia vạch, dung tích danh định 1 ml.

6.9. Đĩa Petri, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo, đường kính từ 90 mm đến 100 mm.

6.10. Thiết bị khử trùng khô (tủ sấy) hoặc thiết bị khử trùng ướt (nồi hấp áp lực).

Xem TCVN 6404 : 2008 (ISO 7218 : 2007).

7. Lấy mẫu

Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thử nghiệm đúng là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707).

8. Cách tiến hành

8.1. Chuẩn bị dung dịch pha loãng ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo

Chuẩn bị dung dịch pha loãng ban đầu (10^-1) và các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo của mẫu thử, theo TCVN 6263 (ISO 8261).

Các mẫu lạc thu được bằng phương pháp nhanh này là loài rất nhỏ và không dễ dàng phát hiện trong đĩa không pha loãng vì sự mờ đục hoặc không rõ ràng của môi trường. Do đó, cần pha loãng mẫu thử ít nhất 10 lần (tốt nhất là 100 lần hoặc lớn hơn) để có thể quan sát các khuẩn lạc rất nhỏ.

8.2. Nuôi cấy và ủ ẩm

8.2.1 Lấy hai đĩa Petri vô trùng (6.9). Dùng pipet vô trùng (6.8) lấy 1 ml dung dịch pha loãng ban đầu (8.1) cho vào mỗi đĩa.

8.2.2 Nếu cần, lặp lại quy trình với các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo, sử dụng mỗi pipet vô trùng mới cho mỗi độ pha loãng.

8.2.3 Nếu thích hợp và nếu có thể, chỉ chọn các bước pha loãng tới hạn (ít nhất hai dung dịch pha loãng thập phân liên tiếp) để cấy lên các đĩa Petri mà sẽ cho các số đếm khuẩn lạc từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc trên một đĩa.

8.2.4 Rót vào mỗi đĩa Petri khoảng 12 ml đến 15 ml môi trường đếm đĩa (5.3.2.3) ở 44 ⁰C đến 47 ⁰C. Thời gian tính từ khi kết thúc chuẩn bị dung dịch pha loãng ban đầu đến khi rót môi trường ra đĩa không được quá 15 min.

8.2.5 Trộn cẩn thận dịch cấy với môi trường bằng cách xoay đĩa Petri. Để hỗn hợp đông đặc bằng cách để các đĩa Petri trên mặt phẳng nằm ngang, mát.

8.2.6 Lật úp các đĩa đã chuẩn bị và đặt vào tủ ấm (6.2) ở 21 ⁰C trong 25 h ± 1 h. Không chồng cao quá sáu đĩa. Để các chồng đĩa cách xa nhau và cách xa thành và đỉnh tủ.

8.3. Đếm khuẩn lạc

8.3.1 Sau thời gian ủ ấm qui định (8.2.6), sử dụng bộ đếm khuẩn lạc (6.5) để đếm các khuẩn lạc trên các đĩa.

Kiểm tra các đĩa dưới ánh sáng dịu. Xác định chính xác các khuẩn lạc, nhưng người thực hiện tránh đếm nhầm các hạt không hòa tan hoặc chất kết tủa trên đĩa với các khuẩn lạc đích thực. Kiểm tra cẩn thận các đối tượng nghi ngờ, nếu cần thì sử dụng độ phóng đại lớn hơn để phân biệt các khuẩn lạc với chất lạ.

8.3.2 Các khuẩn lạc mọc lan được coi là các khuẩn lạc đơn lẻ. Nếu có ít hơn một phần tư đĩa mọc quá dày do khuẩn lạc mọc lan, thì đếm các khuẩn lạc trên phần đĩa không bị ảnh hưởng và tính số lượng tương ứng với toàn bộ đĩa. Nếu có nhiều hơn một phần bốn đĩa có các khuẩn lạc mọc lan thì loại bỏ đĩa đó không đếm.

9. Tính toán và biểu thị kết quả

Tính toán và biểu thị kết quả theo TCVN 6404 : 2008 (ISO 7218 : 2007).

10. Độ chụm

10.1. Yêu cầu chung

Thông tin về các giới hạn tin cậy đối với việc ước tính các số lượng nhỏ vi sinh vật, xem TCVN 6404 : 2008 (ISO 7218 : 2007).

CHÚ THÍCH: Không có sẵn số liệu chi tiết về độ chụm thu được nghiên cứu liên phòng thử nghiệm. Các con số đưa ra kết quả thực nghiệm.

10.2. Độ lặp lại

Kinh nghiệm cho thấy rằng khi hai kết quả thử nghiệm độc lập riêng lẻ trên mẫu thử cao hơn 1000 CFP/ml, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên vật liệu thử giống hệt nhau, tiến hành trong cùng một phòng thử nghiệm, do cùng một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, nếu kết quả cao hơn thường xuyên vượt quá kết quả thấp hơn 50 %, thì người phân tích cần kiểm tra lại quy trình để xác định nguồn gốc sai đó.

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi chi tiết thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn, cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

e) các kết quả thử nghiệm thu được.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] OLIVERIA, J.s., PARMELEE, C.E. Rapid enumeration of psychrotrophic bacteria in raw milk and pasteurized milk. J.Milk Food Tchnol. 39, 1976, pp.269-272.

[2] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa – Hướng dẫn lấy mẫu.

[3] TCVN 7904 (ISO 17410), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Phương pháp định lượng vi sinh vật ưa lạnh.