TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-37:2015 VỀ BỆNH ĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 37: BỆNH VIÊM PHỔI ĐỊA PHƯƠNG Ở LỢN

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8400-37:2015

BỆNH ĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 36: BỆNH VIÊM PHỔI ĐỊA PHƯƠNG Ở LỢN

Animal diseases – Diagnostic procedure – Part 37: Enzootic pneumonia in pigs

Lời nói đầu

TCVN 8400-37 : 2015 do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương – Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 8400 Bệnh động vật – Quy trình chẩn đoán gồm 38 phần:

– TCVN 8400-1 : 2010, phần 1: Bệnh lở mồm long móng;

– TCVN 8400-2 : 2010, phần 2: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra trên lợn;

– TCVN 8400-3 : 2010, phần 3: Bệnh giun xoắn;

– TCVN 8400-4 : 2010, phần 4: Bệnh Niu Cát Xơn;

– TCVN 8400-5 : 2011, phần 5: Bệnh tiên mao trùng;

– TCVN 8400-6 : 2011, phần 6: Bệnh xuất huyết thỏ;

– TCVN 8400-7 : 2011, phần 7: Bệnh đậu cừu và đậu dê;

– TCVN 8400-8 : 2011, phần 8: Bệnh nấm phổi do Aspergillus ở gia cầm;

– TCVN 8400-9 : 2011, phần 9: Bệnh viêm gan vịt typ I;

– TCVN 8400-10 : 2011, phần 10: Bệnh lao bò;

– TCVN 8400-11 : 2011, phần 11: Bệnh dịch tả vịt;

– TCVN 8400-12 : 2011, phần 12: Bệnh bạch lỵ và thương hàn ở gà;

– TCVN 8400-13 : 2011, phần 13: Bệnh sảy thai truyền nhiễm do Brucela;

– TCVN 8400-14 : 2011, phần 14: Bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò;

– TCVN 8400-15 : 2011, phần 15: Bệnh xoắn khuẩn do Leptospira;

– TCVN 8400-16 : 2011, phần 16: Bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E.coli;

– TCVN 8400-17: 2011, phần 17: Bệnh do Staphylococcus aureus ở gà;

– TCVN 8400-18 : 2014, phần 18: Bệnh phù đầu gà (coryza);

– TCVN 8400-19 : 2014, phần 19: Bệnh phó thương hàn lợn;

– TCVN 8400-20 : 2014, phần 20: Bệnh đóng dấu lợn;

– TCVN 8400-21 : 2014, phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS);

– TCVN 8400-22 : 2014, phần 22: Bệnh giả dại ở lợn;

– TCVN 8400-23 : 2014, phần 23: Bệnh ung khí thán;

– TCVN 8400-24 : 2014, phần 24: Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm;

– TCVN 8400-25 : 2014, phần 25: Bệnh cúm lợn;

– TCVN 8400-26 : 2014, phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1;

– TCVN 8400-27 : 2014, phần 27: Bệnh sán lá gan;

– TCVN 8400-28 : 2014, phần 28: Bệnh viêm ruột hoại tử do Clostridium perfringens;

– TCVN 8400-29 : 2015, phần 29: Bệnh Lympho leuko ở gà;

– TCVN 8400-30 : 2015, phần 30: Bệnh Marek ở gà;

– TCVN 8400-31 : 2015, phần 31: Bệnh tụ huyết trùng gia cầm;

– TCVN 8400-32 : 2015, phần 32: Bệnh gumboro ở gia cầm;

– TCVN 8400-33 : 2015, phần 33: Bệnh lê dạng trùng ở trâu bò;

– TCVN 8400-34 : 2015, phần 34: Bệnh biên trùng ở trâu bò;

– TCVN 8400-35 : 2015, phần 35: Bệnh theileria ở trâu bò;

– TCVN 8400-36 : 2015, phần 36: Hội chứng suy mòn ở lợn sau cai sữa do Circo virus typ 2;

– TCVN 8400-37 : 2015, phần 37: Bệnh viêm phổi địa phương ở lợn;

– TCVN 8400-38 : 2015, phần 38: Bệnh tiêu chảy ở lợn do Corona virus.

 

BỆNH ĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 37: BỆNH VIÊM PHỔI ĐỊA PHƯƠNG Ở LỢN

Animal diseases – Diagnostic procedure – Part 37: Enzootic pneumonia in pigs

CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh viêm phổi địa phương do Mycoplasma hyopneumoniae gây ra ở lợn.

2. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

2.1. Bệnh viêm phổi địa phương ở lợn (Enzootic pneumonia in pigs)

Bệnh suyễn ở lợn

Bệnh do vi khuẩn Mycoplasma hyopneumoniae gây ra, tác động chủ yếu lên đường hô hấp, gây viêm phế quản, viêm phổi.

CHÚ THÍCH: Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyopneumoniae): là vi khuẩn hiếu khí, không di động, không sinh nha bào, Gram dương nhưng không bắt màu thuốc nhuộm gram và dễ biến đổi qua từng bước nhuộm. Vi khuẩn có hình thái rất đa dạng (hình thoi, hình gậy ngắn hoặc hình cầu), phụ thuộc vào tuổi của canh trùng nuôi cấy và các yếu tố môi trường. Việc nuôi cấy vi khuẩn này khó, mất nhiều thời gian (từ 3 ngày đến 30 ngày) và ít thành công.

3. Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

3.1. Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp parafin

3.1.1. Formalin, dung dịch 10 % (thể tích)

Chuẩn bị từ dung dịch formaldehyde 38 % (thể tích) và dung dịch muối đệm phosphat (PBS) (xem Phụ lục A) với tỷ lệ 1 : 9.

3.1.2. Etanol 70 % (thể tích), 90 % (thể tích) và etanol tuyệt đối.

3.1.3. Xylen.

3.1.4. Haematoxylin.

3.1.5. Eosin.

3.1.6. Parafin, có độ nóng chảy từ 56 °C đến 60 °C.

3.1.7. Keo dán lamen.

3.2. Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho cho phương pháp realtime PCR (phản ứng chuỗi polymerase theo thời gian thực)

3.2.1. Kít tách chiết ADN (axit deoxyribonucleic).

3.2.2. Kít nhân gen.

3.2.3. Cặp mồi và mẫu dò (primers và probe).

3.2.4. Etanol tuyệt đối, dùng cho tách chiết mẫu ADN.

3.2.5. Dung dịch PBS, pH 7,0 (xem Phụ lục A).

3.2.6. Mẫu ADN kiểm chứng dương, tách chiết từ Mycoplasma hyopneumoniae, có giá trị Ct (chu kỳ ngưỡng đã biết trước).

3.2.7. Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic).

3.2.8. Nước, tinh khiết không có nuclease.

3.3. Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp ELISA (phép thử miễn dịch liên kết enzym)

Hiện nay các kít ELISA thương mại có sẵn trên thị trường dung để phát hiện kháng thể Mycoplasma hyopneumoniae. Khi sử dụng phương pháp ELISA cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất

4. Thiết bị và dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau:

4.1. Thiết bị và dụng cụ sử dụng chung

4.1.1. Tủ lạnh âm sâu, có thể duy trì nhiệt độ từ âm 20 °C đến âm 80 °C.

4.1.2. Tủ lạnh, có thể duy trì nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C.

4.1.3. Máy lắc trộn vortex, có thể hoạt động với tốc độ 200 r/min đến 2 500 r/min.

4.2. Thiết bị và dụng cụ dùng cho phương pháp parafin

4.2.1. Khuôn nhựa, loại chuyên dụng cho làm tiêu bản vi thể.

4.2.2. Máy xử lý mẫu mô tự động.

4.2.3. Nồi đun parafin, có thể duy trì nhiệt độ từ 56 °C đến 65 °C.

4.2.4. Khay sắt, loại chuyên dụng cho làm tiêu bản vi thể.

4.2.5. Máy làm lạnh, có thể duy trì nhiệt độ từ âm 10 °C đến 4 °C.

4.2.6. Máy cắt tiêu bản, cắt ở độ mỏng từ 3 µm đến 5 µm.

4.2.7. Nồi dãn tiêu bản, có thể duy trì nước ở nhiệt độ từ 35 °C đến 65 °C.

4.2.8. Phiến kính, vô trùng.

4.2.9. Lamen, vô trùng.

4.2.10. Bộ cốc nhuộm tiêu bản.

4.2.11. Kính hiển vi quang học, vật kính 4 X, 10 X, 20 X, 40 X, 60 X.

4.3. Thiết bị và dụng cụ dùng cho phương pháp realtime PCR.

4.3.1. Máy nhân gen, (realtime PCR).

4.3.2. Máy ly tâm, có thể tạo gia tốc ly tâm 3 000 g, 6 000 g và 20 000 g.

4.3.3. Cối chày sứ, vô trùng.

4.3.4. Máy spindown.

4.4. Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp ELISA

4.4.1. Máy đọc ELISA, có thể đọc được bước sóng 650 nm.

5. Chẩn đoán lâm sàng

5.1. Đặc điểm dịch tễ

– Lợn ở tất cả các lứa tuổi đều mẫn cảm nhưng triệu chứng viêm phổi thường thấy ở lợn trên 6 tuần tuổi. Lợn nái mang thai ở kỳ 2, lợn mẹ nuôi con. Lợn nuôi trong điều kiện vệ sinh chuồng trại và dinh dưỡng kém rất mẫn cảm với bệnh;

– Bệnh thường xảy ra trong những điều kiện sức đề kháng của lợn giảm sút;

– Bệnh xảy ra quanh năm nhưng trầm trọng nhất là trời lạnh và ẩm. Mùa xuân và mùa đông dễ mắc bệnh hơn các mùa khác;

– Tỷ lệ mắc bệnh cao, tỷ lệ chết thấp khoảng 10 %;

– Đường lây lan: chủ yếu qua đường hô hấp, ngoài ra bệnh có thể truyền qua bào thai. Việc lây truyền vi khuẩn chủ yếu trực tiếp từ lợn ốm, lợn mang trùng sang lợn khỏe, từ lợn mẹ sang lợn con;

– Thời gian ủ bệnh từ 7 ngày đến 14 ngày;

– Thường kế phát các vi khuẩn khác như Pasteurella multocida, Streptococcus pyogenes, Diploccoccus pneumoniae, Salmonella…

5.2. Triệu chứng lâm sàng

5.2.1. Thể á cấp tính

– Lúc đầu triệu chứng rất nhẹ, khó phát hiện;

– Lợn bệnh thường tách đàn nằm ở góc chuồng, ăn ít, da nhợt nhạt, sốt nhẹ (từ 39 °C đến 39,5 °C);

– Lúc đầu hắt hơi từng hồi, chảy nước mũi, vài ngày sau con vật ho, ho liên tiếp từ 1 tuần đến 3 tuần. Bệnh thường chuyển sang thể mạn tính.

5.2.2. Thể mạn tính

– Lợn ho dai dẳng, ho khan, thường lúc sáng sớm, buổi tối, hay sau khi ăn xong. Con vật khó thở, thở nhanh, há mồm ra để thở, tư thế ngồi thở như chó ngồi để thở, đặc biệt là sau khi bị xua đuổi;

– Lợn chậm lớn, còi cọc; lông xù, cứng;

– Bệnh kéo dài trong vài tháng đến nửa năm, thỉnh thoảng có con chết.

5.3. Bệnh tích đại thể

– Phổi viêm, thường quan sát thấy ở thùy đỉnh, thùy tim, thùy hoành hai bên phổi. Bệnh tích có tính chất đối xứng, giới hạn rõ rệt giữa vùng phổi viêm và vùng phổi lành. Ở những ca bệnh nặng, bệnh tích có thể lan tràn khắp phổi. Màu sắc phổi tiến triển dần từ màu tím rồi chuyển màu xám nhạt, phổi cứng dần: bị gan hóa, nhục hóa. Khi cắt miếng phổi thả vào nước, miếng phổi chìm xuống;

– Trong các phế quản thường có dịch rỉ viêm;

– Hạch lâm ba phổi sưng rất to (từ 2 lần đến 5 lần so với bình thường). Nếu có vi khuẩn kế phát, bệnh tích trầm trọng hơn.

5.4. Chẩn đoán phân biệt về lâm sàng

Chẩn đoán phân biệt bệnh viêm phổi địa phương với một số bệnh khác trên lợn theo Bảng 1.

Bảng 1 – Chẩn đoán phân biệt

6. Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1. Phương pháp parafin phát hiện bệnh viêm phổi địa phương ở lợn

6.1.1. Lấy mẫu

Chọn lợn nghi bệnh mổ lấy các mẫu bệnh phẩm sau:

– Phổi: lấy phần phổi nghi có bệnh tích ở thùy tim, thùy đỉnh, thùy hoành hai bên với độ dày lát cắt khoảng 0,5 cm và độ rộng khoảng 1 cm đến 2 cm, độ dài khoảng 1 cm đến 2 cm;

– Hạch phổi: cắt một miếng với độ dày khoảng 0,5 cm.

Các mẫu bệnh phẩm trên cho vào lọ chứa formalin (3.1.1) sao cho thể tích mẫu bệnh phẩm và formalin có tỷ lệ khoảng 1 : 10, ghi ký hiệu mẫu trên thành lọ.

CHÚ THÍCH: Đồng thời kèm theo Phiếu gửi bệnh phẩm ghi rõ yêu cầu xét nghiệm và những thông tin về dịch tễ các biểu hiện triệu chứng, bệnh tích của bệnh.

6.1.2. Bảo quản mẫu

Mẫu bệnh phẩm đảm bảo ngập trong formalin (3.1.1), tránh đổ vỡ, rơi vãi formalin ra ngoài môi trường; khi gửi mẫu đến phòng thí nghiệm, bao gói lọ chứa mẫu bằng túi nilon dán kín. Trong trường hợp mẫu chuyển đến phòng thí nghiệm chưa được xét nghiệm ngay, phải được bổ sung hoặc thay mới formalin đảm bảo thể tích mẫu bệnh phẩm và formalin đạt tỷ lệ khoảng 1 : 10.

6.1.3. Chuẩn bị mẫu

– Mẫu bệnh phẩm được cố định trong dung dịch formalin (3.1.1) thời gian 24 h;

– Cắt các bệnh phẩm đã cố định trên thành miếng nhỏ dày khoảng 1 mm, dài khoảng 1 cm rồi đặt vào khuôn nhựa (4.2.1).

6.1.4. Cách tiến hành

6.1.4.1. Đúc khuôn

– Rửa khuôn nhựa (6.1.3) dưới vòi nước chảy, thời gian từ 2 h đến 3 h;

– Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 2 h đến 3 h;

– Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.2) thời gian từ 2 đến 3 h;

– Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;

– Ngâm khuôn nhựa vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;

– Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.1.3) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;

– Ngâm khuôn nhựa vào cốc xylen (3.1.3) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;

– Ngâm khuôn nhựa vào cốc parafin (3.1.6) lần thứ 1, thời gian từ 2 h đến 3 h;

– Ngâm khuôn nhựa vào cốc parafin (3.1.6) lần thứ 2, thời gian từ 2 h đến 3 h;

CHÚ THÍCH: Nếu sử dụng máy chuyển mẫu mô tự động (4.1.2) thì tiến hành tiếp theo từ bước ngâm etanol.

– Đúc khuôn: rót parafin (3.1.6) nóng chảy từ nồi đun parafin (4.2.3) vào khay sắt (4.2.4), gắp bệnh phẩm từ khuôn nhựa vào khay sắt, đặt khuôn nhựa (4.2.1) lên trên. Để nguội, tách lấy khối parafin.

6.1.4.2. Cắt tiêu bản

– Cắt gọt khối parafin (6.1.4.2) cho bằng phẳng, đặt trên mặt máy làm lạnh tiêu bản (4.2.5);

– Đặt khối parafin lên máy cắt tiêu bản (4.2.6) sao cho mặt khối parafin song song với mép lưỡi dao, cắt bỏ những lát đầu đến khi lát cắt có đủ các bệnh phẩm, điều chỉnh độ dày của lát cắt từ 3 µm đến 5 µm, cắt một vài lát;

– Chọn lát cắt phẳng thả vào nồi dãn tiêu bản (4.2.7) với nhiệt độ nước từ 35 °C đến 40 °C. Dùng phiến kính (4.2.8) vớt lát cắt. Dựng nghiêng tiêu bản và để khô.

6.1.4.3. Nhuộm tiêu bản

– Ngâm tiêu bản (6.1.4.2) vào cốc xylen (3.1.3) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min;

– Ngâm tiêu bản vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 3 min đến 5 min;

– Ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 3 min đến 5 min;

– Ngâm tiêu bản vào cốc etanol 70 % (thể tích) (3.1.2), thời gian từ 3 min đến 5 min;

– Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;

– Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm haematoxylin (3.1.4), thời gian từ 3 min đến 5 min;

– Rửa tiêu bản dưới với nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;

– Ngâm tiêu bản vào cốc thuốc nhuộm eosin (3.1.5), thời gian từ 60 s đến 90 s;

– Rửa dưới vòi nước chảy, thời gian từ 3 min đến 5 min;

– Loại bỏ nước còn bám trên tiêu bản bằng cách ngâm tiêu bản vào cốc etanol 90 % (thể tích) (3.1.2) trong thời gian từ 3 s đến 5 s, sau đó ngâm tiêu bản vào cốc etanol tuyệt đối (3.1.2) 3 lần, thời gian mỗi lần từ 3 s đến 5 s; chuyển tiêu bản ngâm trong cốc xylen (3.1.3) 2 lần, thời gian mỗi lần từ 2 min đến 3 min; gắn lamen (4.2.9) vào tiêu bản bằng keo dán lamen (3.1.7). Để khô, soi tiêu bản dưới kính hiển vi quang học (4.2.11).

6.1.5. Đọc kết quả^[3]

Đặc điểm bệnh tích vi thể của bệnh là viêm phổi ở thể mạn tính với đặc trưng các tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân xâm nhập vùng xung quanh phế quản, tiểu phế quản và mạch quản. Bệnh tích lan rộng tới cả các nang lympho xung quanh phế quản. Các nang lympho có dạng trung tâm sinh trưởng.

– Giai đoạn đầu của bệnh: thường thấy các tế bào bạch cầu đơn nhân lớn tập trung trong lòng phế quản;

– Có thể quan sát thấy viêm kẽ phổi, vách phế nang dày do xâm lấn của số lượng lớn các tế bào đơn nhân và đa nhân;

– Trong lòng phế nang có chứa các mảnh tế bào;

– Các phế nang có thể chứa dịch phù màu hồng, hoặc xẹp xuống hoặc khí thũng.

6.2. Phương pháp realtime PCR phát hiện Mycoplasma hyopneumoniae

6.2.1. Lấy mẫu

Chọn lợn nghi bệnh mổ lấy từ 3 g đến 5 g phổi cho vào túi hoặc lọ đựng mẫu vô trùng, ghi ký hiệu mẫu trên thành lọ.

CHÚ THÍCH: Đồng thời kèm theo Phiếu gửi bệnh phẩm ghi rõ yêu cầu xét nghiệm và những thông tin về dịch tễ, các biểu hiện triệu chứng, bệnh tích của bệnh.

6.2.2. Bảo quản mẫu

Mẫu bệnh phẩm (6.2.1) được bảo quản trong thùng lạnh (nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C). Mẫu được gửi đến phòng thí nghiệm không quá 48 h. Trong phòng thí nghiệm, nếu mẫu chưa xét nghiệm ngay phải được bảo quản trong tủ âm 20 °C (4.1.1).

6.2.3. Chuẩn bị mẫu

Mẫu bệnh phẩm phổi: lấy khoảng 1 g phổi (6.2.1), cắt nhỏ rồi nghiền thành huyễn dịch với dung dịch PBS (3.2.5) theo tỉ lệ 1 : 10 (thể tích) trong cối chày sứ (4.3.3). Ly tâm huyễn dịch bằng máy ly tâm (4.3.2) ở gia tốc 3 000 g trong 5 min. Hút lấy dịch nổi để tiến hành tách chiết ADN cho phản ứng realtime PCR.

6.2.4. Cách tiến hành

6.2.4.1. Tách chiết ADN

Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.1) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: sử dụng kít tách chiết QIAGEN RNeasy Blood tissue (Cat. No. 69506)[1]⁾ (xem Phụ lục B).

6.2.4.2. Chuẩn bị mồi

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.3.1) theo phương pháp realtime PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của Mycoplasma hyopneumoniae sử dụng cặp mồi và mẫu dò (primers và probe) (3.2.3) được nêu trong Bảng 2.

Bảng 2 – Cặp mồi, mẫu dò^[4]

Mồi và mẫu dò được chuẩn bị như sau:

– Chuẩn bị mồi gốc và mẫu dò gốc: mồi và mẫu dò ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.3.4) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.7) để hoàn nguyên mồi và mẫu dò ở nồng độ 100 µM làm mồi gốc và mẫu dò gốc;

– Chuẩn bị mồi sử dụng ở nồng độ 20 µM: pha loãng mồi gốc bằng nước (3.2.8) (20 µl mồi gốc và 80 µl nước (3.2.8));

– Chuẩn bị mẫu dò sử dụng ở nồng độ 6 µM: pha loãng mẫu dò gốc bằng nước (3.2.8) (6 µl mẫu dò gốc và 94 µl nước (3.2.8)).

6.2.4.3. Tiến hành phản ứng realtime PCR

Sử dụng cặp mồi và mẫu dò đã được chuẩn bị (6.2.4.2).

Sử dụng kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: dùng kít nhân gen của Bảng Invitrogen Platinum One – Step qPCR SuperMix – UDG (Cat. No. 11730-017) [2]⁾ thành phần cho 1 phản ứng được nêu trong bảng 3.

Bảng 3 – Thành phần phản ứng realtime PCR

Thành phần	Thể tích
	µl
Nước tinh khiết không có nuclease	6,0
PCR SuperMix	12,5
Mồi xuôi (20 µM)	0,5
Mồi ngược (20 µM)	0,5
Mẫu dò (6 µM)	0,5
Tổng thể tích	20,0

Chuyển 20 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng.

– Mẫu kiểm chứng dương: cho 5 µl mẫu ADN có giá trị Ct đã biết trước vào ống phản ứng.

– Mẫu kiểm chứng âm: cho 5 µl nước tinh khiết không có nuclease vào ống phản ứng.

– Mẫu bệnh phẩm: cho 5 µl mẫu ADN (phụ lục B) vào ống phản ứng.

CHÚ Ý:

– Phản ứng realtime PCR phải bao gồm: mẫu bệnh phẩm, mẫu kiểm chứng dương, mẫu kiểm chứng âm.

– Mẫu và nguyên vật liệu cho phản ứng realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

Tiến hành phản ứng bằng máy realtime PCR (4.3.1) đã được cài đặt chu trình nhiệt nêu trong Bảng 4.

Bảng 4 – Chu trình nhiệt phản ứng realtime PCR

Nhiệt độ	Thời gian	Số chu kỳ
50 °C	2 min	1 vòng
95 °C	5 min
95 °C	10 s	40 vòng
60 °C	50 s	40 vòng

6.2.5. Đọc kết quả

Đọc kết quả bằng máy reatime PCR (4.3.1) dựa trên giá trị Ct (Ct là thời điểm máy đọc realtime PCR ghi nhận tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền)

Điều kiện phản ứng được công nhận: mẫu kiểm chứng dương tính có giá trị Ct biết trước (± 2 Ct), mẫu kiểm chứng âm tính không có Ct;

Với điều kiện như trên, mẫu có giá trị Ct ≤ 35 được coi là dương tính; mẫu không có Ct được coi là âm tính; mẫu có giá trị 35 < Ct ≤ 40 được coi là nghi ngờ;

Những mẫu nghi ngờ cần được xét nghiệm lại theo quy trình hoặc bằng phương pháp khác để khẳng định.

6.3. Phát hiện kháng thể Mycoplasma hyopneumoniae bằng phương pháp ELISA

6.3.1. Lấy mẫu

Sử dụng xylanh 5 ml và kim tiêm 22G (hoặc 20G) vô trùng, lấy từ 1,5 ml đến 2 ml máu của lợn nghi mắc bệnh viêm phổi địa phương nhưng chưa tiêm phòng vắc xin. Sau khi lấy, rút pittong lùi ra để tạo khoảng trống (hoặc bơm máu vào ống nghiệm vô trùng), ghi ký hiệu mẫu trên xylanh hoặc ống nghiệm rồi đặt nằm nghiêng 45° trong hộp đựng mẫu, để đông máu trong 1 h đến 2 h ở nhiệt độ bình thường, tránh ánh nắng trực tiếp.

CHÚ THÍCH: Không lấy mẫu huyết thanh lợn đã được tiêm vắc xin Mycoplasma hyopneumoniae để xét nghiệm kháng thể vì phương pháp trong tiêu chuẩn này không phân biệt được kháng thể nhiễm tự nhiên và kháng thể do tiêm vắc xin.

6.3.2. Bảo quản mẫu

Mẫu bệnh phẩm là huyết thanh của lợn nghi mắc bệnh (6.3.1) được bảo quản trong thùng lạnh (nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C) và gửi đến phòng thí nghiệm không quá 48 h. Trong trường hợp mẫu đến phòng thí nghiệm chưa được xét nghiệm ngay, phải được ly tâm bằng máy ly tâm (4.3.2), chắt lấy phần huyết thanh sang ống khác, bảo quản trong tủ lạnh (4.1.2).

6.3.3. Chuẩn bị mẫu

Chắt huyết thanh từ xy lanh (6.3.1) sang ống nghiệm vô trùng, kể từ lúc lấy máu đến lúc chắt huyết thanh không quá 24 h, ghi ký hiệu của mẫu lên ống chứa huyết thanh.

6.3.4. Cách tiến hành

VÍ DỤ: dùng bộ kít phát hiện kháng thể Mycoplasma hyopneumoniae ở lợn của hãng IDEXX[3]⁾

6.3.4.1. Chuẩn bị nguyên liệu

– Nguyên liệu: các nguyên liệu của bộ kit được bảo quản ở nhiệt độ 4 °C, trước khi tiến hành phản ứng phải được đem ra để cân bằng với nhiệt độ phòng (từ 18 °C đến 26 °C);

– Mẫu huyết thanh (6.3.3): được pha loãng thành 1/40 với Sample Dilution (dung dịch pha loãng mẫu). (Lấy 10 µl huyết thanh pha với 390 µl dung dịch pha loãng mẫu);

– Pha loãng dung dịch Wash Concentrate 10 X (dung dịch rửa): lấy 1 phần dung dịch rửa 10 X pha với 9 phần nước cất;

– Tính thể tích dung dịch nước rửa cần pha: 300 µl/giếng x 3 lần rửa x 2 bước rửa x số giếng sử dụng;

– Sơ đồ bố trí mẫu: trong sơ đồ bố trí mẫu phải có mẫu trắng (Blank), kiểm chứng âm (Negative Control – NC), kiểm chứng dương (Positive Control – PC).

6.3.4.2. Tiến hành phản ứng ELISA

Bước 1: Nhỏ huyết thanh

– Nhỏ 100 µl dung dịch pha loãng mẫu vào giếng mẫu trắng;

– Nhỏ 100 µl mẫu kiểm chứng âm vào giếng kiểm chứng âm;

– Nhỏ 100 µl mẫu kiểm chứng dương vào giếng kiểm chứng dương;

– Nhỏ 100 µl mẫu huyết thanh (6.3.4.1) đã pha loãng 1/40 vào các giếng thích hợp;

– Để dĩa ở nhiệt độ phòng trong 30 min;

– Đổ bỏ dung dịch trong đĩa;

– Nhỏ 300 µl dung dịch rửa vào các giếng, rồi đổ bỏ đi. Lặp lại 3 lần.

Bước 2: Nhỏ kháng kháng thể

– Nhỏ 100 µl dung dịch kết hợp vào các giếng;

– Để đĩa ở nhiệt độ phòng trong 30 min;

– Đổ bỏ dung dịch trong đĩa;

– Nhỏ 300 µl dung dịch rửa vào các giếng, rồi đổ bỏ đi. Lặp lại 3 lần.

Bước 3: Nhỏ cơ chất

– Nhỏ 100 µl dung dịch cơ chất TMB (Tetramethylbenzidine) vào các giếng;

– Để đĩa ở nhiệt độ phòng trong 15 min.

Bước 4: Dừng phản ứng

– Nhỏ 100 µl dung dịch dừng phản ứng (Stop solution) vào các giếng;

– Đo giá trị mật độ quang học (OD) bằng máy đọc ELISA (4.4.1) ở bước sóng 650 nm.

6.3.5. Đọc kết quả

Điều kiện phản ứng được công nhận khi:

– Giá trị OD của kiểm chứng dương trừ giá trị OD của kiểm chứng âm phải lớn hơn hoặc bằng 0,15;

– Giá trị OD của kiểm chứng âm lớn hơn hoặc bằng 0,15.

Tính kết quả:

– Trung bình của kiểm chứng âm: (NC1 + NC2) / 2= NCx tb

– Trung bình của kiểm chứng dương: (PC1 + PC2) / 2 = PCx tb

– Tỷ lệ S/P = (giá trị OD của mẫu – NCx tb) / (PCx tb – NCx tb)

– Hiệu giá của mẫu: Log₁₀ Titer = 1.09 (log₁₀ S/P) + 3.36

CHÚ THÍCH: S/P là tỉ lệ được tính toán giữa giá trị OD của mẫu bệnh phẩm so với giá trị OD của mẫu kiểm chứng dương.

Đánh giá kết quả đối với mẫu bệnh phẩm:

– Mẫu huyết thanh dương tính với kháng thể Mycoplasma hyopneumoniae có S/P lớn hơn 0,40;

– Mẫu huyết thanh âm tính với kháng thể Mycoplasma hyopneumoniae có S/P nhỏ hơn 0,30;

– Mẫu huyết thanh nghi ngờ có kháng thể Mycoplasma hyopneumoniae có S/P trong khoảng từ 0,30 đến 0,40 và phải được kiểm tra lại.

7. Kết luận

Lợn được xác định mắc bệnh viêm phổi địa phương khi có các đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, triệu chứng bệnh tích đặc trưng của bệnh và dương tính với một trong các phương pháp xét nghiệm quy định trong tiêu chuẩn này.

 

Phụ lục A

(Quy định)

Chuẩn bị dung dịch muối đệm phosphat (PBS)

A.1. Thành phần

Natri hydrophosphat (Na2HPO4)	9,47 gm
Kali dihydrophosphat (KH2PO4)	9,08 gm
Nước cất	900 ml

A.2. Chuẩn bị

Hòa tan natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 900 ml nước cất. Chỉnh pH đến 7,0 bằng axit clohydric.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng PBS thương mại và pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

 

Phụ lục B

(Tham khảo)

Quy trình tách chiết ADN

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

Quy trình tách chiết ADN sử dụng kít QIAGEN RNeasy Blood & Tissue kit (Cat. No. 69506) như sau:

B.1. Pha dung dịch

– Dung dịch AW1: thêm 125 ml etanol tuyệt đối (3.2.4) vào 95 ml dung dịch AW1 đậm đặc;

– Dung dịch AW2: thêm 160 ml etanol tuyệt đối (3.2.4) vào 66 ml dung dịch AW2 đậm đặc.

B.2. Cách tiến hành

– Cho 20 µl protease vào ống 1,5 ml;

– Chuyển 200 µl dịch mẫu (dịch nổi xử lý ở 6.2.3) vào ống 1,5 ml;

– Thêm 200 pl dung dịch AL (lysis buffer) vào ống. Lắc bằng máy lắc (4.1.3) trong 15 s, sau đó ly tâm (4.3.2) với gia tốc 3 000 g trong 1 min;

– Ủ ấm ở 56 °C trong 10 min, sau đó ly tâm (4.3.2) với gia tốc 3 000 g trong 1 min;

– Cho 200 µl etanol tuyệt đối (3.2.4) vào ống. Lắc bằng máy lắc (4.1.3) trong 15 s, sau đó ly tâm (4.3.2) với gia tốc 3 000 g trong 1 min;

– Chuyển 620 µl dung dịch mẫu đã tách chiết vào cột lọc (spin column) với ống thu (collection tube);

– Ly tâm (4.3.2.) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng;

– Thêm 500 µl dung dịch AW1 vào cột lọc có ống thu ở dưới;

– Ly tâm (4.3.2) với gia tốc 6 000 g trong 1 min ở nhiệt độ phòng;

– Cho cột lọc vào ống thu mới;

– Thêm 500 µl dung dịch AW2 vào cột lọc có ống thu ở dưới;

– Ly tâm (4.3.2) với gia tốc 20 000 g trong 3 min ở nhiệt độ phòng;

– Chuyển cột lọc sang ống ly tâm 1,5 ml;

– Nhỏ 200 µl dung dịch AE vào cột ly tâm và giữ ở nhiệt độ phòng 1 min;

– Ly tâm (4.3.2) với gia tốc 6 000 g trong 1 min;

– Chuyển ADN đã thu được sang ống 1,5 ml mới

– Bảo quản mẫu ADN ở 4 °C trong ngày nếu chạy phản ứng realtime PCR ngay và giữ ở âm 20 °C để lưu mẫu trong thời gian dài.

 

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] JICA, 2003. Standard Diagnostic Manual for livestock diseases in Thailand. Third edition, p.110–111

[2] J.Quinn, M.E.Carter, B.Markey, G.R.Carter, 2004. Veterinary Clinical Microbiology. 6th Edition. Printed in Spain, p.320-326.

[3] Eileen L. Thacker, 2006. Chapter 42: Mycoplasmal Disease. Diseases of Swine. 9th Edition. Blackwell Publishing, p.701-707.

[4] Steven B. Kleiboeker, 2004. Development of Real-time, multiplex PCR/RT-PCR assays for improved PRDC pathogen detection – NPB. Available at: http://www.pork.org/FileLibrary/ResearchDocuments/03-114-KLEIBOEKER.6-28-04.pdf.

[5] IDEXX Laboratories, Herd Chek^® Mycoplasma hyopneumoniae Antibody Test Kit.

[6] Nguyễn Vinh Phước, 1978. Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc.

[7] Lê Văn Lãnh và cs, 2012. Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y.

[8] Barbara E. Straw và cs, 2006. Diseases of swine.

[9] Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Lê Văn Lãnh, Đỗ Ngọc Thúy, 2012. Giáo trình bệnh truyền nhiễm thú y. NXB Đại Học Nông Nghiệp.

[10] Paula R. Almeida et al, “Nested-PCR for the detection of Mycoplasma hyopneumoniae in bronchial alveolar swabs, frozen tissues and formalin-fixed paraffin-embedded swine lung samples: comparative evaluation with immunohistochemical findings and histological features”, Pesq. Vet. Bras, vol.32 no.8 Rio de Janeiro Aug. 2012. Available at: http://www.merckmanuals.com/vet/respiratory_system/respiratory_diseases_of_pigs/mycoplasmal_pneumonia_in_pigs.html.

[11] Mycoplasmal Pneumonia in Pigs. Available at: http://www.thepigsite.com/pighealth/article/323/enzootic-pneumonia-ep-or-mycoplasma-hyopneumoniae-infection.

[12] M. Kobisch and N.F. Friis, “Swine mycoplasmoses”, Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 1996, 15 (4), 1569-1605. Available at: http://www.oie.int/doc/ged/D9110.PDF.

---