TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8400-38:2015 VỀ BỆNH ĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 38: BỆNH TIÊU CHẢY Ở LỢN DO CORONAVIRUS

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8400-38:2015

BỆNH ĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 38: BỆNH TIÊU CHẢY Ở LỢN DO CORONAVIRUS

Animal diseases – Diagnostic procedure – Part 38: Porcine epidemic diarrhea

Lời nói đầu

TCVN 8400-38:2015 do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương – Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 8400 Bệnh động vật – Quy trình chẩn đoán gồm 38 phần:

– TCVN 8400-1 : 2010, phần 1: Bệnh lở mồm long móng;

– TCVN 8400-2 : 2010, phần 2: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus suis gây ra trên lợn;

– TCVN 8400-3 : 2010, phần 3: Bệnh giun xoắn;

– TCVN 8400-4 : 2010, phần 4: Bệnh Niu Cát Xơn;

– TCVN 8400-5 : 2011, phần 5: Bệnh tiên mao trùng;

– TCVN 8400-6 : 2011, phần 6: Bệnh xuất huyết thỏ;

– TCVN 8400-7 : 2011, phần 7: Bệnh đậu cừu và đậu dê;

– TCVN 8400-8 : 2011, phần 8: Bệnh nấm phổi do Aspergillus ở gia cầm;

– TCVN 8400-9 : 2011, phần 9: Bệnh viêm gan vịt type I;

– TCVN 8400-10 : 2011, phần 10: Bệnh lao bò;

– TCVN 8400-11 : 2011, phần 11: Bệnh dịch tả vịt;

– TCVN 8400-12 : 2011, phần 12: Bệnh bạch lị và thương hàn ở gà;

– TCVN 8400-13 : 2011, phần 13: Bệnh sảy thai truyền nhiễm do brucela;

– TCVN 8400-14 : 2011, phần 14: Bệnh tụ huyết trùng ở trâu bò;

– TCVN 8400-15 : 2011, phần 15: Bệnh xoắn khuẩn do Leptospira;

– TCVN 8400-16 : 2011, phần 16: Bệnh phù ở lợn do vi khuẩn E.coli;

– TCVN 8400-17 : 2011, phần 17: Bệnh do vi khuẩn staphylococcus aureus gây ra ở gà;

– TCVN 8400-18 : 2014, phần 18: Bệnh phù đầu gà (coryza);

– TCVN 8400-19 : 2014, phần 19: Bệnh phó thương hàn lợn;

– TCVN 8400-20 : 2014, phần 20: Bệnh đóng dấu lợn;

– TCVN 8400-21 : 2014, phần 21: Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS);

– TCVN 8400-22 : 2014, phần 22: Bệnh giả dại ở lợn;

– TCVN 8400-23 : 2014, phần 23: Bệnh ung khí thán;

– TCVN 8400-24 : 2014, phần 24: Bệnh viêm phế quản truyền nhiễm;

– TCVN 8400-25 : 2014, phần 25: Bệnh cúm lợn;

– TCVN 8400-26 : 2014, phần 26: Bệnh cúm gia cầm H5N1;

– TCVN 8400-27 : 2014, phần 27: Bệnh sán lá gan;

– TCVN 8400-28 : 2014, phần 28: Bệnh viêm ruột hoại tử do vi khuẩn Clostridium perfringens;

– TCVN 8400-29 : 2015, phần 29: Bệnh Lympho leuko ở gà;

– TCVN 8400-30 : 2015, phần 30: Bệnh Marek ở gà;

– TCVN 8400-31 : 2015, phần 31: Bệnh Tụ huyết trùng gia cầm;

– TCVN 8400-32 : 2015, phần 32: Bệnh Gumboro ở gia cầm;

– TCVN 8400-33 : 2015, phần 33: Bệnh Lê dạng trùng ở trâu bò;

– TCVN 8400-34 : 2015, phần 34: Bệnh Biên trùng ở trâu bò;

– TCVN 8400-35 : 2015, phần 35: Bệnh Theileria ở trâu bò;

– TCVN 8400-36 : 2015, phần 36: Hội chứng suy mòn ở lợn sau cai sữa do Circo virus typ 2;

– TCVN 8400-37 : 2015, phần 37: Bệnh viêm phổi địa phương ở lợn;

– TCVN 8400-38 : 2015, phần 38: Bệnh tiêu chảy ở lợn do Corona virus.

BỆNH ĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 38: BỆNH TIÊU CHẢY Ở LỢN DO CORONAVIRUS

Animal diseases – Diagnostic procedure – Part 38: Porcine epidemic diarrhea

CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn để an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định cho quy trình chẩn đoán bệnh tiêu chảy ở lợn do coronavirus gây ra.

2  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

Bệnh tiêu chảy ở lợn do coronavirus (Porcine epidemic diarrhea)

PED

Bệnh truyền nhiễm đường ruột do coronavirus gây ra, được phân loại là ARN virus, có tính lây lan mạnh, biểu hiện đặc trưng là triệu chứng nôn mửa và tiêu chảy cấp tính dẫn đến mất nước nặng và tử vong.

CHÚ THÍCH: Bệnh tiêu chảy ở lợn do coronavirrus còn được gọi là dịch tiêu chảy ở lợn con hay ở lợn.

3  Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết để phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

3.1  Nguyên liệu sử dụng chung

3.1.1  Etanol, từ 70 % (thể tích) đến etanol tuyệt đối.

3.1.2  Dung dịch muối đệm phosphat (PBS), pH 7,2 ± 0,2 (xem A.2).

3.1.3  Dung dịch kháng khuẩn, bao gồm các loại penicillin, kanamycin, streptomycin.

3.2  Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho Realtime – RT PCR

3.2.1  Kit tách chiết RNA, ví dụ: Qiagen® Rneasy Extraction cat # 74104.

3.2.2  Kit nhân gen, ví dụ: Superscript 3 platinum one-step qRT-PCR kit cat # 11732-020

3.2.3  Mồi xuôi, mồi ngược và mẫu dò.

3.2.4  Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic).

3.2.5  Nước tinh khiết, không có nuclease

3.3  Nguyên liệu và vật liệu thử dùng cho phương pháp ELISA (phép thử miễn dịch liên kết enzym)

Hiện nay các kit ELISA thương mại có sẵn trên thị trường dùng để phát hiện kháng thể PED khi sử dụng phương pháp ELISA cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau:

4.1  Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp realtime RT-PCR

4.1.1  Máy nghiền mẫu hoặc cối chày sứ.

4.1.2  Tủ lạnh âm sâu, có thể duy trì nhiệt độ từ âm 20 °C đến âm 80 °C.

4.1.3  Tủ lạnh, có thể duy trì nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C.

4.1.4  Máy nhân gen (realtime- PCR).

4.1.5  Máy ly tâm, có thể đạt gia tốc ly tâm 900 g; 6 000 g và 20 000 g.

4.1.6  Máy lắc trộn vortex.

4.1.7  Máy spindown.

4.2  Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp ELISA

4.2.1  Máy đọc ELISA, có thể đọc đĩa ở bước sóng 650 nm.

4.2.2  Tủ ấm hoặc bàn sấy mẫu, có thể duy trì nhiệt độ ở 37 °C.

5  Chẩn đoán lâm sàng

5.1  Đặc điểm dịch tễ

– Bệnh tiêu chảy ở lợn do virus corona xảy ra quanh năm đối với lợn ở tất cả các lứa tuổi, tuy nhiên trên 90 % ca bệnh xảy ra ở lợn con 1 đến 2 tuần tuổi và thường xảy ra vào mùa đông;

– Tỷ lệ chết của lợn mắc bệnh tùy thuộc vào lứa tuổi mắc bệnh của lợn:

+ Lợn con mắc bệnh ở độ tuổi từ 1 ngày tuổi đến 5 ngày tuổi tỷ lệ chết 100 %;

+ Lợn con mắc bệnh ở độ tuổi từ 6 ngày tuổi đến 7 ngày tuổi tỷ lệ chết khoảng 50 %;

+ Lợn con mắc bệnh ở độ tuổi lớn hơn 7 ngày tuổi tỷ lệ chết khoảng 30 %.

– Nguồn lây nhiễm: lợn khỏe tiếp xúc với virus PED trong phân, dụng cụ chăn nuôi, xe vận chuyển hoặc do việc nhập đàn (lợn mang trùng, lợn nhiễm bệnh);

– Thời gian ủ bệnh từ 1 ngày đến 14 ngày.

5.2  Triệu chứng lâm sàng

– Triệu chứng tiêu chảy xuất hiện sau 18 h đến 24 h khi mầm bệnh xâm nhập, bệnh lây nhanh đến tất cả các đàn lợn trong trại;

– Vào đầu ổ dịch lợn nái ốm trước, sau đến lợn con, sốt từ 40 °C đến 40,7 °C. Lợn con nôn dữ dội, kèm theo tiêu chảy phân toàn nước và bọt trắng, sau đó chuyển dần sang màu tro xám, sền sệt như bùn đất, mùi hôi rất khó chịu;

– Lợn con theo mẹ: lười bú, ói mửa, ỉa chảy có sữa không tiêu. Lợn con sụt cân nhanh do mất nước, nằm chồng đống lên nhau và thích nằm lên bụng mẹ (triệu chứng điển hình).

5.3  Triệu chứng bệnh tích

– Lợn bị tiêu chảy do virus corona có bệnh tích ruột non trương phồng, màu vàng, niêm mạc bong tróc, thành ruột mỏng, tích nhiều nước.

– Dạ dày chứa nhiều thức ăn không tiêu, tá tràng tích nước, không tràng xuất huyết, hồi tràng sưng to.

– Virus corona nhân lên trong tế bào thượng bì của ruột non lợn làm tuyến hạch bẹn sưng, hạch lympho màng treo ruột sung huyết, viêm nặng.

6  Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1  Phương pháp realtime RT-PCR

6.1.1  Lấy mẫu

Lấy 5 g đến 10 g ruột non, hạch lâm ba của lợn nghi mắc bệnh cho vào ống vô trùng có thể tích 15 ml.

CHÚ THÍCH: không lấy mẫu từ lợn đã được tiêm phòng vắc xin nhược độc PED trong thời gian từ 3 tháng đến 6 tháng đề xét nghiệm bệnh.

6.1.2  Bảo quản mẫu

Tất cả các mẫu bệnh phẩm xét nghiệm đều được bảo quản trong thùng lạnh (nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C) chuyển đến phòng thí nghiệm trong vòng 48 h. Trong trường hợp không tiến hành xét nghiệm mẫu ngay thì mẫu phải được bảo quản trong tủ âm sâu 80 °C (4.1.2).

CHÚ THÍCH: Mẫu được gửi tới phòng thí nghiệm có kèm theo phiếu gửi bệnh phẩm ghi rõ yêu cầu xét nghiệm và những thông tin về dịch tễ, các biểu hiện triệu chứng, bệnh tích của ca bệnh.

6.1.3  Chuẩn bị mẫu

Ruột non, hạch lâm ba được cắt nhỏ và nghiền nát bằng máy nghiền mẫu hoặc cối chày sứ (4.1.1), bổ sung dung dịch PBS (3.1.2), để thu được huyễn dịch 1/10 (1g phủ tạng + 900 ml dung dịch PBS). Cho huyễn dịch vào ống, ly tâm ở gia tốc 900 g (4.1.5) trong thời gian 10 min. Thu phần dịch nổi phía trên chẩn đoán virus PED bằng phương pháp realtime RT-PCR.

6.1.4  Cách tiến hành

6.1.4.1  Tách chiết ARN

Sử dụng bộ kít thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất (3.2.1). Ví dụ: sử dụng quy trình tách chiết ARN bằng kít Qiagen® Rneasy Extraction cat # 74104 (xem Phụ lục B)1).

6.1.4.2  Chuẩn bị mồi

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.1.4) theo phương pháp PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của virus gây PED sử dụng mồi xuôi, mồi ngược và mẫu dò (3.2.3).

Chuẩn bị mồi như sau:

Chuẩn bị mồi gốc:

– Mồi gốc và mẫu dò gốc ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.1.7) ở gia tốc 6 000 g trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Lần đầu tiên dùng dung dịch đệm TE (3.2.4) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 mM làm mồi gốc và mẫu dò gốc.

Chuẩn bị mồi sử dụng:

– Mồi sử dụng ở nồng độ 20 mM: mồi gốc được pha với nước (3.2.5) (20 ml mồi gốc và 80 ml nước (3.2.5)).

– Mẫu dò được sử dụng ở nồng độ 6 mM: 6 ml mẫu dò gốc pha với 94 ml nước (3.2.5).

– Trộn cùng 1 thể tích mồi xuôi, mồi ngược và mẫu dò sau khi pha thành hỗn hợp để tiện khi sử dụng.

Trình tự cặp mồi được nêu trong Bảng 1.

Bảng 1 – Trình tự mẫu dò và cặp mồi^[5]

6.1.4.3  Tiến hành phản ứng realtime RT- PCR

Ví dụ: sử dụng phương pháp realtime RT- PCR với cặp mồi đã chuẩn bị (6.1.4.2) và kit Superscript 3 platinum one-step qRT-PCR kit cat # 11732-020 (3.2.2).

Hỗn hợp phản ứng được chuẩn bị trong ống 0,2 ml, và có đầy đủ đối chứng âm và đối chứng dương trong mỗi lần chạy phản ứng realtime PCR.

+ Thành phần cho một phản ứng realtime PCR (theo hướng dẫn của kít thương mại) Bảng 2.

+ Đối chứng dương: Là mẫu ARN được tách chiết từ mẫu virus RED chuẩn.

+ Đối chứng âm: sử dụng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.5).

Sau khi chuẩn bị xong hỗn hợp nguyên liệu:

– Chuyển 20 ml hỗn hợp thành phần phản ứng realtime PCR (Bảng 2) vào ống phản ứng (ống PCR 0,2 ml)

– Cho 5 ml mẫu ARN vào ống phản ứng.

– Đặt ống phản ứng vào máy realtime PCR (4.1.4).

Bảng 2 – Thành phần phản ứng realtime RT-PCR

Chu kỳ nhiệt chạy phản ứng được cài đặt theo hướng dẫn của nhà sản xuất kit sử dụng cho phản ứng. Đối với kít kit Superscript 3 platinum one-step qRT-PCR kit cat # 11732-020, chu kỳ nhiệt được nêu trong Bảng 3.

Bảng 3 – Chu trình nhiệt của phản ứng realtime RT – PCR

CHÚ THÍCH: – Phản ứng realtime RT – PCR phải bao gồm: mẫu thử, mẫu kiểm chứng dương và mẫu kiểm chứng âm. Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

6.1.4.4  Đọc kết quả

Phản ứng được công nhận: mẫu đối chứng dương tính (được chuẩn độ trước) phải có giá trị C_t ≤ 35 (± 2 C_t), mẫu đối chứng âm không có C_t.

Với điều kiện phản ứng trên:

1) Mẫu có giá trị chu kỳ ngưỡng C_t ≤ 35 được coi là dương tính,

2) Mẫu không có giá trị chu kỳ ngưỡng C_t = 0 là âm tính.

3) Mẫu có giá trị chu kỳ ngưỡng C_t ≤ 40 và >35 được coi là nghi ngờ.

Những mẫu nghi ngờ này cần được xét nghiệm lại lần 2 đề khẳng định và kết luận cuối cùng.

6.2  Phát hiện kháng thể bằng phương pháp ELISA

6.2.1  Lấy mẫu

Sử dụng xylanh 5 ml và kim tiêm 22 G vô trùng, lấy từ 1,5 ml đến 2 ml máu ở vịnh tĩnh mạch cổ lợn nghi mắc bệnh PED. Sau khi lấy, rút pittong lùi ra để tạo khoảng trống (hoặc bơm máu vào ống nghiệm vô trùng), ghi ký hiệu mẫu trên xylanh hoặc ống nghiệm rồi đặt nằm nghiêng 45° trong hộp đựng mẫu, để đông máu trong 1 h đến 2 h ở nhiệt độ bình thường, tránh ánh nắng trực tiếp.

6.2.2  Bảo quản mẫu

Mẫu được bảo quản theo mục 6.1.2.

6.2.3  Chuẩn bị mẫu

Tất cả các mẫu máu được chắt huyết thanh từ xylanh (6.2.1) sang ống nghiệm vô trùng khác. Thời gian kể từ lúc lấy máu cho đến lúc chắt huyết thanh không quá 24 h, ghi ký hiệu của mẫu lên ống chứa huyết thanh.

6.2.4  Cách tiến hành

Hiện nay, có nhiều bộ kít ELISA phát hiện kháng thể PED bán sẵn trên thị trường. Khi sử dụng phương pháp ELISA cần theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất^[2].

CHÚ THÍCH: Phương pháp này nhanh và dễ thực hiện. Tuy nhiên, không phân biệt được kháng thể do tiêm phòng vắc xin PED hay kháng thể do nhiễm thực địa.

Ví dụ: sử dụng phương pháp ELISA phát hiện kháng thể PED theo quy trình của kit PED Ab hãng IDEXX thì các bước tiến hành được thực hiện như sau:

a) Chuẩn bị nguyên liệu

– Nguyên liệu của bộ kít (3.4.1) để ở nhiệt độ phòng từ 20 đến 30 phút trước khi làm phản ứng.

– Pha loãng dung dịch rửa 1X: 10 ml dung dịch nước rửa đặc 10X với 90 ml nước cất khử ion (3.4.2).

– Pha loãng mẫu với tỷ lệ 1/40: 10 ml mẫu kiểm tra với 390 ml dung dịch pha loãng mẫu trong ống pha loãng. Sau đó 100 ml dung dịch mẫu kiểm tra đã pha loãng sang đĩa ELISA với bố trí mẫu tương ứng.

b) Các bước tiến hành

Bố trí sơ đồ đĩa ELISA phản ứng (tham khảo Phụ lục C).

– Chuẩn bị bộ kit: Xác định số mẫu kiểm tra, 01 đối chứng dương, 01 đối chứng âm;

– Nhỏ 100 ml đối chứng âm và đối chứng dương (không pha loãng) vào đĩa ELISA theo vị trí bố trí;

– Vỗ nhẹ đĩa, đậy nắp. Ủ ở nhiệt độ 37°C (4.2.2) trong 30 min;

– Sau 30 min ủ đĩa, đổ bỏ dung dịch trong đĩa, rửa đĩa 3 lần với lượng 300 ml/giếng bằng dung dịch rửa đĩa 1X;

– Nhỏ 100 ml chất gắn kết (conjugate) vào tất cả các giếng. Ủ tiếp ở nhiệt độ 37°C (4.2.2) trong 30 min;

– Sau đó đỗ bỏ dung dịch trong đĩa, rửa đĩa 3 lần với các lượng 300 ml/giếng bằng dung dịch rửa đĩa 1X;

– Nhỏ 100 ml cơ chất vào các giếng, ủ đĩa trong 15 min ở nhiệt độ phòng;

– Nhỏ 100 ml dung dịch dừng phản ứng vào các giếng.

6.2.5  Đọc kết quả

– Đọc đĩa ở bước sóng 650 nm bằng máy đọc ELISA (4.2.1) và tính kết quả.

– Phản ứng được công nhận khi:

+ mật độ quang học (OD) của đối chứng âm ≤ 0,15

+ OD của đối chứng dương – OD của đối chứng âm ≥ 0,15

– Đánh giá kết quả:

+ Mẫu dương tính: S/P ≥ 0,4

+ Mẫu âm tính: S/P < 0,4

CHÚ THÍCH: Đối với những mẫu nghi ngờ phải làm lại để khẳng định, nếu vẫn nghi ngờ thì dựa vào dịch tễ học để kết luận bệnh.

7  Kết luận

Lợn được kết luận mắc bệnh tiêu chảy ở lợn do virus corona (PED) khi có các đặc điểm về triệu chứng, bệnh tích điển hình và có kết quả xét nghiệm dương tính với virus PED hoặc dương tính kháng thể PED bằng các phương pháp trong tiêu chuẩn này.

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị dung dịch thử

A.1  Dung dịch kháng khuẩn

A.1.1  Thành phần

A.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan kháng sinh bằng nước cất rồi lọc bằng màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 mm. Bảo quản ở âm 20 °C (4.1.2).

A.2  Dung dịch muối đệm phosphat (PBS), 0,01 M, pH 7,2

A.2.1  Thành phần

A.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước, chỉnh pH đến 7,2 bằng dung dịch natri hydroxit (NaOH) 1 N hoặc dung dịch axit clohydric (HCl) 1 N. Hấp tiệt trùng bằng nồi hấp, chia nhỏ và bảo quản ở 4 °C (4.1.3).

Phụ lục B

(Tham khảo)

Chuẩn bị tách chiết ARN

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ARN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây tạp chéo và ảnh hưởng đến cơ thể nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

Tách chiết ARN theo quy trình của kit Invitrogen (Cat No. 74106): thực hiện như sau:

B.1  Chuẩn bị

Chuẩn bị dung dịch RLT (600 ml/mẫu) vào ống ly tâm 50 ml. Thêm 1/100 β-mercaptoetanol (β-ME) vào dung dịch RLT (dung dịch này có thể bảo quản 1 tháng ở nhiệt độ phòng).

B.2  Cách tiến hành

Dùng huyễn dịch đã xử lý (6.1.3) để tách chiết ARN. Có thể sử dụng bộ kít Qiagen® Rneasy Extraction (cat # 74104 50 prep hoặc # 74106 250 prep) theo quy trình dưới đây.

– Nhỏ 200 ml huyễn dịch (6.1.3) vào ống ly tâm (4.1.5) loại 1,5ml cùng với 600 ml Qiagen® buffer RLT có 1 % β-ME, lắc đều trên máy lắc trộn Vortex (4.1.6).

– Thêm 500 ml etanol 70 % thể tích (3.1.1) vào ống, lắc mạnh bằng máy lắc trộn Vortex (4.1.6).

– Chuyển tất cả dịch nổi sang cột lọc RNeasy® Qiagen, ly tâm trong 15 s với gia tốc ≥ 8 000 g bằng máy ly tâm (4.1.5) ở nhiệt độ phòng.

– Bổ sung 700 ml dung dịch rửa 1 (RW1 buffer) vào cột RNeasy® Qiagen, ly tâm trong 15 s ở gia tốc ≥ 8 000 g bằng máy ly tâm lạnh (4.1.5), thay ống thu mới vào cột lọc.

– Nhỏ 500 ml dung dịch rửa RPE buffer vào cột RNeasy® và ly tâm trong 15 s ở gia tốc ≥ 8 000 g bằng máy ly tâm (4.1.5), thay ống thu mới, lặp lại 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer.

– Thay ống thu mới, ly tâm cột lọc và ống thu trong 2 min ở gia tốc tối đa, bỏ ống thu.

– Đặt cột lọc vào ống thu ARN, nhỏ 50 ml nước sạch nuclease vào cột lọc, ủ ở nhiệt độ phòng trong ít nhất 1 min. Tách ARN bằng cách ly tâm trong 1 min ở gia tốc ≥ 8 000 g bằng máy ly tâm (4.1.5), bỏ cột lọc, giữ lại dung dịch trong ống thu ARN.

– Bảo quản mẫu ARN thu được ở 4 °C trong thời gian ngắn trước khi làm RT-PCR, nếu sau 24 h, nên bảo quản mẫu ở âm 70 °C bằng tủ lạnh âm sâu (4.1.2) hoặc nhiệt độ thấp hơn.

Phụ lục C

(Tham khảo)

Sơ đồ bố trí mẫu trong đĩa ELISA xét nghiệm kháng thể virus corona (PED)

CHÚ THÍCH:      NC: đối chứng âm

PC: đối chứng dương

S1 đến S92: mẫu kiểm tra

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] O. Kim, C. Chae (1999) Application of reverse transcrption polymerase chian reaction to detect porcine epidemic dianrhea virus in Vero cell culture, J Vet Diagn Invest 11:537-538 (1999)

[2] F. Guscetti (1998), Immunohistochemical Detection of Porcine Epidemic Diarrhea Virus Compare to Other Methods, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1998, 5(3):412.

[3] Pan et al (2012), Isolation and characterization of a variant porcine epidemic diarrhea virus in China, Virology Jounal 2012, 9:195.

[4] Faculty of Veterinary Medicine, Kasetsart University, Kamphangsaen campus, Nakornphathom: Recurrent of Porcine Epidemic Diarrhea Outbreak in a Pig Farm: A case Report Pariwat Poolperm, Preeda Lertwatcharasarakul, Sakuna Phattanakunanan, Kitcha Urairong, THAILAND 73140, Pariwat.P@ku.ac.th

[5] Leyi Wang, Yan Zhang: Beverly Byrum: Development and evaluation of a duplex real-time RT- PCR for detection and differentiation of virulent and variant strains of porcine epidemic diarrhea viruses from the United States. Animal Disease Diagnostic Laboratory, Ohio Department of Agriculture, 8995 East Main Street, Building No. 6, Reynoldsburg, OH 43068, United States