TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8677-2:2013 (ISO 17764-2 : 2002) VỀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT BÉO – PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8677-2:2013

ISO 17764-2 : 2002

THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT BÉO – PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ

Animal feeding stuffs – Determination of the content of fatty acids – Part 2: Gas chromatographic method

Lời nói đầu

TCVN 8677-2:2013 hoàn toàn tương đương với ISO 17764-2:2002;

TCVN 8677-2:2013 do Cục Chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố;

Bộ TCVN 8677 (ISO/TS 17764), Thức ăn chăn nuôi – Xác định hàm lượng axit béo bao gồm các phần sau:

– TCVN 8677-1:2011 (ISO/TS 17764-1:2002), Thức ăn chăn nuôi – Xác định hàm lượng axit béo – Phần 1: Phương pháp chuẩn bị metyl este;

– TCVN 8677-2:2013 (ISO/TS 17764-2:2002), Thức ăn chăn nuôi – Xác định hàm lượng axit béo – Phần 2: Phương pháp sắc ký khí.

THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT BÉO – PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ

Animal feeding stuffs – Determination of the content of fatty acids – Part 2: Gas chromatographic method

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng các axit béo riêng rẽ và tổng các axit béo (axit béo có thể rửa giải).

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp sử dụng sắc ký khí cột mao quản và detector ion hóa ngọn lửa (FID) để xác định hàm lượng axit béo trong chất béo bằng cách sử dụng các metyl este của các axit béo thu được theo phương pháp quy định trong TCVN 8677-1 (ISO/TS 17764-1).

Tiêu chuẩn này có thể dùng để nghiên cứu các loại dầu mỡ động vật và thực vật, hỗn hợp axit béo có trong thành phần thức ăn chăn nuôi, dịch chiết chất béo của thức ăn chăn nuôi và nguyên liệu của thức ăn hỗn hợp, kể cả chất béo và hỗn hợp axit béo có chứa axit butyric.

Phương pháp này không áp dụng cho các axit béo đã polime hóa.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987) Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

TCVN 8677-1 (ISO/TS 17764-1), Thức ăn chăn nuôi – Xác định hàm lượng axit béo – Phần 1: Phương pháp chuẩn bị metyl este.

3. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau đây:

3.1. Hàm lượng axit béo (fatty acid content)

Phần khối lượng của các axit béo có trong phần mẫu thử của dầu, mỡ, dịch chiết chất béo, các axit béo tự do hoặc xà phòng.

CHÚ THÍCH: Hàm lượng axit béo được biểu thị bằng gam trên kilogam.

3.2. Hàm lượng chất có thể rửa giải được (content of elutable material)

Khối lượng của tổng các axit béo có thể rửa giải được, sử dụng cột sắc ký khí như quy  định trong tiêu chuẩn này.

4. Nguyên tắc

Các metyl este đã được chuẩn bị từ các axit béo theo TCVN 8677-1 (ISO/TS 17764-1) được tách ra bằng sắc ký khí-lỏng, sử dụng cột mao quản. Các pic trong sắc đồ được xác định theo mẫu đối chứng đã biết thành phần và được định lượng bằng cách sử dụng chất chuẩn nội.

5. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử và dung môi đạt chất lượng tinh khiết phân tích.

5.1. Nước, phù hợp với loại 3 quy định trong TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987).

5.2. n-Hexan hoặc n-heptan.

5.3. n-Pentan.

5.4. Mẫu đối chứng: mẫu dầu hoặc mỡ đã biết chính xác dạng axit béo, hoặc hỗn hợp của mẫu metyl este axit béo đối chứng hoặc mẫu axit béo đối chứng.

CHÚ THÍCH: Nếu sử dụng phương pháp BF­₃ để este hóa, thì hỗn hợp của metyl este axit béo đối chứng không được dùng cho hiệu chuẩn hoặc các hệ số điều chỉnh đối với các axit béo có mạch ít hơn 10 nguyên tử cácbon, vì metyl este có thể hòa tan trong pha nước.

6. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

6.1. Máy sắc ký khí, bao gồm cột mao quản và hệ thống bơm được thiết kế đặc biệt để sử dụng với các cột sắc ký đó.

Hệ thống bơm có thể là loại phân dòng hoặc không phân dòng hoặc bộ bơm trên cột lạnh. Tuy nhiên, bộ bơm không phân dòng ấm là không phù hợp để phân tích chất béo của sữa vì pic của dung môi sẽ chồng lên pic của axit butyric.

6.2. Cột, được chế tạo bằng vật liệu trơ (silica nóng chảy hoặc thủy tinh) có pha tĩnh thích hợp cho liên kết hóa học vào thành cột.

Kích thước cột và độ dày của lớp màng là những yếu tố quan trọng trong việc xác định hiệu quả tách và khả năng tách của cột. Độ phân giải tối thiểu là 1,25 đối với axit béo C16:0 và C16:1, C18:0 và C18:1.

CHÚ THÍCH: Trong hầu hết các trường hợp, cột pha tĩnh phân cực vừa phải là phù hợp để sử dụng. Trong các trường hợp đặc biệt, ví dụ, để tách các đồng phân cis-trans- và/hoặc các đồng phân vị trí hoặc nếu cần chắc chắn là không có pic nào trùng nhau, thì nên dùng cột phân cực cao hơn. Cần xem xét hiệu quả mong muốn và khả năng của cột về kích thước và độ dày của màng pha tĩnh. Ví dụ, cột pha tĩnh phân cực vừa phải phù hợp với các este của poly (etylen glycol) khác nhau. Cột pha tĩnh phân cực cao thường là dạng cyano-propyl-polysiloxan.

6.3. Hệ thống bơm mẫu, để bơm bằng tay, có dung tích phần lớn là 10 ml và được chia vạch 0,1 ml, phù hợp với bơm (6.2) hoặc hệ thống bơm mẫu tự động.

CHÚ THÍCH: Tốt nhất nên dùng hệ thống bơm mẫu tự động và có thể cải thiện độ lặp lại và độ tái lập.

6.4. Thiết bị chuyển đổi tín hiệu, hệ thống điện tử được gắn với máy ghi để chuyển tín hiệu detector sang sắc đồ (bộ tích phân hoặc trạm dữ liệu).

7. Cách tiến hành

7.1. Chuẩn bị metyl este

Chuẩn bị metyl este của các axit béo của phần mẫu thử và mẫu đối chứng (5.4) theo TCVN 8677-1 (ISO/TS 17764-1).

7.2. Chọn các điều kiện vận hành tối ưu

Tối ưu hóa thiết bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Tối ưu hóa tốc độ dòng khí mang theo khuyến cáo của nhà sản xuất cột sắc ký đối với cột được chọn và khí mang.

Duy trì nhiệt độ của detector từ 20⁰C đến 50⁰C cao hơn nhiệt độ cao nhất của cột trong chương trình gia nhiệt, nhưng tối thiểu là 150⁰C.

Nhiệt độ bơm phụ thuộc vào kiểu loại bơm; theo hướng dẫn trong sổ tay thiết bị.

Khi sử dụng bơm phân dòng thì cài đặt tỷ lệ phân dòng từ 1:30 đến 1:100.

7.3. Phân tích

7.3.1. Hòa tan metyl este của axit béo của phần mẫu thử và phần mẫu thử đã bổ sung chất chuẩn nội vào n-hexan (5.2) đến hàm lượng 1% (khối lượng) khi sử dụng bơm phân dòng, hoặc đến hàm lượng 0,05% (khối lượng) khi sử dụng bơm không phân dòng hoặc bơm trên cột lạnh.

Chuẩn bị dung dịch metyl este của axit béo mẫu đối chứng (7.1) trong n-hexan với nồng độ tương tự.

Bơm riêng rẽ từ 0,1 ml đến 1 ml mẫu thử, mẫu thử có chứa chất chuẩn nội và mẫu đối chứng khi cần.

Khi dùng hệ thống bơm trên cột lạnh thì cần sử dụng n-pentan làm dung môi có thể tách tốt các metyl este của axit béo có chiều dài mạch chứa ít hơn 10 nguyên tử cacbon. Hòa tan các metyl este của axit béo có trong phần mẫu thử và mẫu đối chứng trong cùng một dung môi.

7.3.2. Việc lựa chọn chương trình nhiệt độ phụ thuộc vào thành phần của axit béo, để phân giải hiệu quả trong khoảng thời gian ngắn nhất có thể. Cần xem xét các tiêu chí nêu trong 6.3.

Chương trình nhiệt độ bắt đầu từ 60⁰C, nếu mẫu có chứa các axit béo với chiều dài mạch gồm ít hơn 12 nguyên tử cacbon.

Sau khi chương trình đạt được nhiệt độ cao nhất, thì chạy đẳng nhiệt cho đến khi tất cả các thành phần được rửa giải, nếu cần.

Khi sử dụng bơm trên cột lạnh, khởi động với nhiệt độ của lò không cao quá 10⁰C so với điểm sôi của dung môi ở áp suất thường dùng (đối với n-pentan là 50⁰C).

Khởi động chương trình nhiệt ngay sau khi bơm mẫu. Sau đó thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

8. Nhận biết pic

Nhận biết các pic metyl este của phần mẫu thử theo thời gian lưu bằng cách so sánh với thời gian lưu của các pic metyl este của axit béo đã biết trong mẫu đối chứng. Các pic trong sắc đồ của phần mẫu thử có cùng thời gian lưu như các pic trong mẫu đối chứng được coi là pic của chính axit béo đó.

9. Tính kết quả

9.1. Hiệu chính đối với axit heptadecanoic trong phần mẫu thử

Đối với axit heptadecanoic có nguồn gốc từ phần mẫu thử thì hiệu chính diện tích pic của axit heptadecanoic trong phần mẫu thử bằng các bổ sung chất chuẩn nội, sử dụng công thức:

A_rsr = A_sr17:0 –

Trong đó:

A_rsr là diện tích đã hiệu chính theo pic của chất chuẩn nội trong phần mẫu thử đã bổ sung chất chuẩn nội, tính bằng đơn vị diện tích;

A_sr16:0 là diện tích theo pic của axit hexadecanoic (axit palmitic) trong phần mẫu thử đã bổ sung chất chuẩn nội, tính bằng đơn vị diện tích;

A_sr17:0 là diện tích theo pic của axit heptadecanoic (axit margarinic) trong phần mẫu thử đã bổ sung chất chuẩn nội, tính bằng đơn vị thể tích;

A_sr18:0 là diện tích theo pic của axit octadecanoic (axit stearic) trong phần mẫu thử đã bổ sung chất chuẩn nội, tính bằng đơn vị diện tích;

A_sr18:1 là diện tích theo pic của axit octadecenoic (axit oleic) trong phần mẫu thử đã bổ sung chất chuẩn nội, tính bằng đơn vị diện tích;

A_sr16:0 là diện tích theo pic của axit hexadecanoic (axit palmitic) trong phần mẫu thử không bổ sung chất chuẩn nội, tính bằng đơn vị diện tích;

A_sr17:0 là diện tích theo pic của axit heptadecanoic (axit margarinic) trong phần mẫu thử không bổ sung chất chuẩn nội, tính bằng đơn vị diện tích;

A_sr18:0 là diện tích theo pic của axit octadecanoic (axit stearic) trong phần mẫu thử không bổ sung chất chuẩn nội, tính bằng đơn vị diện tích;

A_sr18:1 là diện tích theo pic của axit octadecenoic (axit oleic) trong phần mẫu thử không bổ sung chất chuẩn nội, tính bằng đơn vị diện tích;

Không cần hiệu chính đối với axit heptadecanoic trong mẫu thử nếu hàm lượng tương đối của axit heptadecanoic không vượt quá 0,5% tổng các axit béo.

9.2. Xác định hệ số hiệu chuẩn tương đối

Xác định hệ số hiệu chuẩn tương đối đối với axit béo với chiều dài mạch chứa ít hơn 10 nguyên tử cacbon.

Nếu không sử dụng hệ thống bơm trên cột lạnh thì cần tính đến sự bay hơi chọn lọc của các metyl este của axit béo. Trong trường hợp này, cần xác định các hệ số hiệu chuẩn tương đối trên toàn bộ dải các metyl este của axit béo.

Hiệu số hiệu chuẩn được sử dụng để chuyển đổi diện tích pic về phần khối lượng. Việc xác định các hệ số hiệu chuẩn nhờ vào sắc đồ thu được khi phân tích hỗn hợp chuẩn (5.4) được thực hiện trong các điều kiện tương tự như các điều kiện được dùng cho phân tích mẫu thử.

Tính hệ số hiệu chuẩn đối với axit béo i theo công thức:

k_j =

trong đó:

k_i là hệ số hiệu chuẩn đối với axit béo i, tính bằng đơn vị khối lượng trên đơn vị diện tích;

m_i là khối lượng của axit béo i trong mẫu đối chứng, tính bằng đơn vị khối lượng;

A_i là diện tích pic của axit béo i trong mẫu đối chứng, tính bằng đơn vị diện tích.

Nếu không thể xác định được hệ số hiệu chuẩn do không có axit béo chuẩn, thì sử dụng hệ số hiệu chuẩn của axit béo sẵn có đứng trước gần nhất với axit béo đối chứng.

Các hệ số tiêu chuẩn được biểu thị liên quan đến hệ số hiệu chuẩn của chuẩn nội C17:0. Hệ số hiệu chuẩn tương đối cuối cùng là:

k_i =

trong đó:

k’_i là hệ số hiệu chuẩn tương đối của axit béo i;

k_i là hệ số hiệu chuẩn của axit béo i; tính bằng đơn vị khối lượng trên đơn vị thể tích;

k_r là hệ số hiệu chuẩn của axit béo chuẩn nội, tính bằng đơn vị khối lượng trên đơn vị diện tích.

9.3. Dải các hệ số hiệu chuẩn tương đối

Các hệ số hiệu chuẩn tương đối có thể có sự khác biệt nhỏ so với giá trị nghịch đảo của các hệ số đáp ứng tương đối. Sự đáp ứng được coi là độ lớn của tín hiệu từ detector ion hóa ngọn lửa đối với một axit béo cụ thể.

Tính các giá trị lý thuyết của các hệ số đáp ứng tương đối của metyl este của axit béo no mạch thẳng bằng công thức sau:

R_i =

Trong đó:

R_i là hệ số đáp ứng tương đối lý thuyết của axit béo i;

M_r là phân tử lượng của axit béo nội chuẩn (C17:0) tính bằng gam trên mol (g/mol);

M_i là phân tử lượng của axit béo i, tính bằng gam trên mol (g/mol);

n_r là số lượng nguyên tử cacbon trong axit béo nội chuẩn;

n_i là số lượng nguyên tử cacbon của axit béo i.

Hệ số hiệu chuẩn tương đối (k’_i) không được khác quá 5% so với giá trị R_i^-1. Trong trường hợp có sự chênh lệch lớn nhất thì kiểm tra xem có sai số hệ thống không. Các hệ số đó chấp nhận được nếu có một hoặc vài mẫu đối chứng đã được sử dụng đúng.

CHÚ THÍCH: Hầu hết sai số hệ thống là do sự bay hơi chọn lọc của các thành phần ra khỏi xyranh khi bơm trong bộ bơm ấm, hoặc khi phân dòng trong trường hợp sử dụng bơm phân dòng. Trong những trường hợp này, các axit béo mạch ngắn sẽ bị đánh giá quá mức. Điều này dẫn đến hệ số hiệu chuẩn đối với các axit  béo mạch ngắn bị thấp hơn so với các giá trị lý thuyết. Một nguyên nhân khác gây ra sai số hệ thống là có thể do chiết không hoàn toàn các metyl este của các axit béo mạch ngắn trong pha alkan.

9.4. Tính hàm lượng axit béo

Tính hàm lượng của các axit béo riêng rẽ trong chất béo theo công thức sau:

w_i = x k’_i x 1000

trong đó:

w_i là phần khối lượng của axit béo i trong mẫu chất béo, tính bằng gam trên kilogam (g/kg);

A_isr là diện tích dưới pic tương ứng với axit béo i trong chất béo đã bổ sung chất nội chuẩn, tính bằng đơn vị diện tích;

A_rsr là diện tích đã được hiệu chính theo pic của chất chuẩn nội trong phần mẫu thử đã bổ sung chất chuẩn nội, tính bằng đơn vị diện tích;

m_r là khối lượng của chất chuẩn nội được bổ sung vào phần mẫu thử của mẫu chất béo, tính bằng gam (g);

m_s là khối lượng của phần mẫu thử của mẫu chất béo, tính bằng gam (g);

k’_I là hệ số hiệu chuẩn tương đối của axit béo i.

Biểu thị các kết quả chính xác đến 1 g/kg.

9.5. Tính hàm lượng chất có thể rửa giải được

Tính hàm lượng của chất có thể rửa giải được bằng cách cộng các giá trị w_i của tất cả các axit béo riêng lẻ.

9.6. Tính hàm lượng của các axit béo trong mẫu chứa chất béo

Tính hàm lượng của các axit béo riêng rẽ bằng cách nhân hàm lượng của axít béo trong chất béo với hàm lượng chất béo trong mẫu.

10. Độ chụm

10.1. Yêu cầu chung

Độ chụm của phương pháp được thiết lập năm 1999 bởi phép thử liên phòng thử nghiệm được tiến hành theo ISO 5725[1]. Các chi tiết của phép thử nêu trong Phụ lục A. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và chất nền khác với các dải nồng độ và chất nền đã nêu.

10.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ độc lập, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp thử trên vật liệu thử giống hệt nhau, do cùng một người phân tích, sử dụng cùng một thiết bị thực hiện trong cùng một phòng thử nghiệm, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5% các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại r nêu trong hoặc thu được từ Bảng 1.

10.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả riêng rẽ độc lập, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp thử trên vật liệu thử giống hệt nhau, do các người phân tích khác nhau thực hiện trong các phòng thử nghiệm khác nhau, sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 5% các trường hợp vượt quá giới hạn tái lập R nêu trong hoặc thu được trong Bảng 1.

Bảng 1 – Giới hạn độ lặp lại (r) và giới hạn độ tái lập (R)

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:

– mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

– phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

– phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

– tất cả các chi tiết thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả thử;

– kết quả thử nghiệm thu được hoặc hai kết quả thử nghiệm thu được nếu đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại.

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm

Độ chụm của phương pháp được thiết lập năm 2001 bởi phép thử liên phòng thử nghiệm do NEN tổ chức và được thực hiện phù hợp với ISO 57251). Trong phép thử này, 11 phòng thí nghiệm đã tham gia. Tuy nhiên, bốn phòng thử nghiệm không có kinh nghiệm với phương pháp này và đã không đưa ra được dữ liệu được yêu cầu. Các mẫu được kiểm tra đánh giá là dầu cá thô, dầu chiên đã qua sử dụng, dầu dừa, chất béo được chiết từ dừa ép và chất béo chiết được từ bột thịt và bột xương.

Trong các Bảng từ A.1 đến A.3 nêu kết quả thống kê của các phép thử.

CHÚ THÍCH: Xem thêm thông tin trong tài liệu ISO/TC 34/SC 10 N 880.

Bảng A.1 – Độ chụm đối với tổng các axit béo ^a

Bảng A.2 – Dữ liệu độ chụm đối với axit palmitic (axit-hexadecanoic)

Bảng A.3 – Dữ liệu độ chụm đối với axit oleic (axit cis-9-octadecanoic)

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] ISO 5725:1986, Precision of test methods – Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests.

[2] TCVN 6910-1:2001 (ISO 5725-1:1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung.

[3] TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2:1994), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.

[4] TCVN 4331:2001 (ISO 6492:1999), Thức ăn chăn nuôi – Xác định hàm lượng chất béo

[5] TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002), Thức ăn chăn nuôi – Lấy mẫu

[6] TCVN 6952:2001 (ISO 6498:1998), Thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử.