TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8710-19:2019 VỀ BỆNH THỦY SẢN – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 19: BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TÍNH Ở TÔM

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8710-19: 2019

BỆNH THỦY SẢN – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 19: BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TÍNH Ở TÔM

Aquatic animal disease – Diagnostic procedure – Part 19: Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (AHPND)

Lời nói đầu

TCVN 8710-19: 2019 do Chi cục Thú y Vùng VI – Cục Thú y biên soạn trên cơ sở tham khảo tài liệu của Tổ chức Thú y Thế Giới (OIE) và các bài báo khao học quốc tế, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 8710 Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán gồm các phần:

– TCVN 8710-01: 2011, phần 1: Bệnh Còi do vi rút ở tôm (MBV);

– TCVN 8710-02: 2011, phần 2: Bệnh Hoại tử thần kinh ở cá biển (VNN);

– TCVN 8710-03: 2011, phần 3: Bệnh Đốm trắng ở tôm (WSSV);

– TCVN 8710-04: 2011, phần 4: Bệnh Đầu vàng ở tôm (YHV);

– TCVN 8710-05: 2011, phần 5: Bệnh Taura ở tôm He (TSV);

– TCVN 8710-06: 2019, phần 6: Bệnh do Koi herpesvirus ở cá chép (KHV);

– TCVN 8710-07: 2012, phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép (SVC);

– TCVN 8710-08: 2012, phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm (IMNV);

– TCVN 8710-09: 2012, phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm (NHB);

– TCVN 8710-10: 2015, phần 10: Bệnh do perkinsus marinus ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ;

– TCVN 8710-11: 2015, phần 11: Bệnh do perkinsus olseni ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ;

– TCVN 8710-12: 2015, phần 12: Bệnh vi bào tử ở tôm;

– TCVN 8710-13: 2015, phần 13: Bệnh do vi rút HPV ở tôm;

– TCVN 8710-14: 2015, phần 14: Bệnh EUS ở cá;

– TCVN 8710-15: 2015, phần 15: Bệnh do Aeromonas ở cá;

– TCVN 8710-16: 2016, phần 16: Bệnh gan thận mủ ở cá da trơn;

– TCVN 8710-17: 2016, phần 17: Bệnh sữa trên tôm hùm;

– TCVN 8710-19: 2019, phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm;

– TCVN 8710-20: 2019, phần 20: Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm;

– TCVN 8710-21: 2019, phần 21: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae ở cá.

 

BỆNH THỦY SẢN – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 19: BỆNH HOẠI TỬ GAN TỤY CẤP TÍNH Ở TÔM

Aquatic animal disease – Diagnostic procedure – Part 19: Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (AHPND)

CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sinh học thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm (AHPND) do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra.

Tiêu chuẩn này cũng có thể áp dụng cho mẫu nước, bùn hay thức ăn cho tôm.

2  Thuật ngữ và định nghĩa, các từ viết tắt

2.1  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm (Acute hepatopancreatic necrosis disease – AHPND) là bệnh gây nên hội chứng chết sớm (EMS) do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus độc lực mang plasmid chứa gen sinh độc tố. Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus là vi khuẩn Gram âm, hình que, thuộc chi vibrio, họ vibrionaceae.

2.2  Từ viết tắt

– ADN (Deoxyribonucleic acid): Axít deoxyribonucleic;

– DNase (Deoxyribonuclease): enzyme thủy phân liên kết của phân tử ADN;

– RNA (Ribonucleic acid): Axít ribonucleic;

– RNase (Ribonuclease): enzyme thủy phân liên kết của phân tử ARN;

– AHPND (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease): Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm;

– EMS (Early mortality syndrome): Hội chứng chết sớm;

– TCBS (Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar): môi trường thạch sacaroza, muối mật, xitrat thiosulfat;

– TSA (tryptic soy agar): thạch tryptic soy;

– PCR (Polymerase Chain Reaction): Phản ứng chuỗi trùng hợp;

– Realtime PCR: Phản ứng realtime PCR;

– PBS (Phosphate buffered saline): Dung dịch muối đệm phốt phát;

– TBE 10X (Tris – axit boric – Ethylendiamin Tetraacetic axlt): Dung dịch đệm TBE đậm đặc 10 lần;

– Ct (cycle threshold): giá trị chu kỳ ngưỡng;

– UV (Ultraviolet): Cực tím.

3  Thuốc thử, vật liệu thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có RNAse và DNAse, trừ khi có quy định khác.

3.1  Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho lấy mẫu và tăng sinh (xem Phụ lục A)

3.1.1  Cồn (Ethanol), từ 70 % đến 100 % (C₂H₆O);

3.1.2  Dung dịch muối đệm phốt phát (PBS), pH 7,2 ± 0,2.

3.2  Thuốc thử và vật liệu thử của phương pháp nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn (xem Phụ lục A)

3.2.1  Môi trường thạch TCBS;

3.2.2  Môi trường thạch dinh dưỡng TSA;

3.2.3  Natri clorua;

3.2.4  Card định danh vi khuẩn Gram (-) hoặc kit kiểm tra sinh hóa;

3.2.5  Thuốc nhuộm gram (Xem phụ lục B);

3.2.6  Môi trường và thuốc thử để kiểm tra đặc tính sinh hóa (Xem Bảng 1).

3.3  Thuốc thử và vật liệu thử của phương pháp PCR, realtime PCR

3.3.1  Môi trường pepton kiềm (Alkaline saline pepton water);

3.3.2  Dung dịch tách chiết (NaCl 0,9 %…) hoặc bộ kit tách chiết ADN vi khuẩn;

3.3.3  Bộ kit nhân gen PCR, realtime PCR;

3.3.4  Nước không có enzyme phân hủy ADN/ARN;

3.3.5  Bột agarose, dung dịch TBE 10X;

3.3.6  Chất nhuộm gel (GelRed hoặc chất nhuộm gel tương đương);

3.3.7  Dung dịch nạp mẫu (Loading dye);

3.3.8  Thang chuẩn ADN;

3.3.9  Đoạn mồi (primers): thực hiện phản ứng PCR;

3.3.10  Đoạn mồi (primers) và đoạn dò (probe): thực hiện phản ứng realtime PCR;

3.3.11  Mẫu đối chứng: Mẫu đối chứng dương là mẫu có chứa ADN của AHPND được chiết tách từ mẫu dương chuẩn. Mẫu đối chứng âm là mẫu nước không có DNase/ RNase dùng để pha loãng các chất phản ứng.

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thí nghiệm sinh học, bao gồm những thiết bị, dụng cụ sau:

4.1  Thiết bị, dụng cụ sử dụng chung

4.1.1  Tủ lạnh: tủ lạnh thường (từ 0°C đến 8 °C), tủ lạnh âm sâu (từ âm 20 °C đến âm 80 °C);

4.1.2  Buồng cấy an toàn sinh học cấp 2;

4.1.3  Tủ ấm, duy trì nhiệt độ ở 28 °C đến 30 °C;

4.1.4  Máy lắc trộn vortex, có thể hoạt động với tốc độ từ 200 g đến 2500 g;

4.1.5  Nồi hấp vô trùng, duy trì nhiệt độ 115 °C và 121 °C;

4.1.6  Cối, chày sứ, kéo, panh kẹp, que cấy vô trùng;

4.1.7  Dụng cụ tiêu hao như: găng tay, khẩu trang, bảo hộ cá nhân.

4.2  Phương pháp nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn

4.2.1  Kính hiển vi quang học, vật kính 10X, 20X, 40X và 100X;

4.2.2  Máy định danh vi khuẩn hoặc thiết bị khác tương đương.

4.3  Phương pháp PCR và Realtime-PCR

4.3.1  Máy nhân gen (PCR, realtime PCR);

4.3.2  Máy ly tâm, có thể thực hiện ở 1500 g đến 2500 g, 10000 g và 12000 g;

4.3.3  Máy lắc ủ nhiệt;

4.3.4  Máy spindown, máy ly tâm lắng;

4.3.5  Máy tách chiết ADN/ARN tự động (nếu có);

4.3.6  Bộ điện di: khay đổ thạch, bể điện di, máy đọc và chụp ảnh gel

Ngoài ra, còn có các loại đầu típ, pipet, ống nghiệm, đĩa petri và các vật tư tiêu hao phù hợp cho quá trình thực hiện các biện pháp kỹ thuật trong tiêu chuẩn này.

5  Chẩn đoán lâm sàng

5.1  Dịch tễ học

Loài cảm nhiễm: Tôm sú (Penaeus monodon) và tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei). Tôm nuôi trong giai đoạn từ tháng 4 đến tháng 9 mắc bệnh nhiều nhất.

Giai đoạn tôm bị bệnh có thể xuất hiện khoảng 10 ngày sau khi thả tôm, nhưng mẫn cảm nhất ở giai đoạn tôm 20 ngày tuổi đến 45 ngày tuổi. Tỷ lệ tôm nhiễm bệnh và chết có thể lên đến 100 %. Bệnh lây nhiễm từ tôm bệnh sang tôm khỏe qua nguồn thức ăn và nguồn nước.

5.2  Triệu chứng lâm sàng

Ở giai đoạn đầu, triệu chứng của bệnh chưa rõ ràng. Tôm chậm lớn, lờ đờ, bỏ ăn, tấp mé và chết ở đáy ao/ đầm nuôi.

Ở giai đoạn tôm nhiễm nặng, tôm bệnh có hiện tượng vỏ mềm, màu sắc cơ thể biến đổi.

5.3  Bệnh tích

Tôm sậm màu, gan tụy mềm nhũn, sưng to hoặc bị teo lại, có màu sắc nhợt nhạt hoặc trắng, lớp màng bao bên ngoài gan tụy có màu trắng, xuất hiện những đốm hoặc vệt màu đen trong khối gan tụy: khi sờ, nắn thấy gan tụy dai và khó vỡ.

6  Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1  Lấy mẫu và xử lý mẫu bệnh phẩm

6.1.1  Lấy mẫu

– Tôm trưởng thành và tôm bố mẹ (lớn hơn 25 ngày tuổi): Thu nguyên con, hoặc thu các loại mẫu: gan, tụy và đầu. Mẫu có thể được gộp từ 1 mẫu đến 5 mẫu thành 1 mẫu xét nghiệm.

– Ấu trùng hoặc hậu ấu trùng tôm (postlarvae) (từ 1 ngày tuổi đến 25 ngày tuổi): Thu nguyên con, lượng mẫu ít nhất khoảng 1 g/mẫu.

Mẫu tôm phải còn sống hoặc vừa mới chết. Mẫu không dập nát. Mẫu phải được lấy vô trùng, các bộ phận phải để riêng biệt trong từng túi hay lọ vô trùng bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8°C (không bảo quản mẫu xét nghiệm vi trùng ở nhiệt độ âm). Bệnh phẩm từ lúc lấy cho tới khi thực hiện xét nghiệm không được quá 24 giờ.

6.1.2  Xử lý mẫu

Mẫu sau khi lấy (xem 6.1.1), tiến hành cắt nhuyễn hoặc nghiền nát ít nhất 1 g mẫu, trộn đều tạo thành hỗn hợp mẫu đồng nhất.

6.2  Phát hiện bệnh hoại tử gan tụy cấp tính trên tôm

6.2.1  Phương pháp nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn

6.2.1.1  Phân lập vi khuẩn

Dùng que cấy vô trùng cấy ria mẫu lên môi trường thạch TCBS (xem 3.2.1), ủ các đĩa thạch trong tủ ấm ở 28 °C đến 30 °C trong vòng 18 giờ đến 24 giờ.

Trên môi trường TCBS:

+ Khuẩn lạc phẳng, màu vàng, đường kính 2 mm – 3 mm: Vibrio cholerae, Vibrio fluvialis, Vibrio furnissii.

+ Khuẩn lạc phẳng, màu xanh lá, đường kính 2 mm – 3 mm: Vibrio vulnificus, Vibrio parahaemolyticus và Vibrio mimicus.

Dùng que cây vô trùng, chọn khuẩn lạc điển hình (xanh, vàng) cấy ria trên môl trường thạch TSA (xem  4.2.2) 1 % NaCl (xem 4.2.3) ủ ở 28 °C đến 30 °C trong vòng 18 giờ đến 24 giờ. Lấy khuẩn lạc thuần thu được đi nhuộm gram và kiểm tra sinh hóa.

6.2.1.2  Quan sát hình thái, sử dụng phương pháp nhuộm Gram

Nhỏ một giọt nước muối sinh lý trên phiến kính, dùng que cấy vô trùng chuyển khuẩn lạc thuần trên môi trường TSA 1 % NaCl (xem 6.2.1.1) vào giọt nước rồi trộn đều, dàn mỏng, để khô tự nhiên sau đó cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn. Tiêu bản sau khi cố định được nhuộm bằng máy nhuộm gram tự động (nếu có) hoặc phương pháp gram (xem phụ lục B).

Soi trên kính hiển vi ở vật kính dầu với độ phóng đại 100 lần, vi khuẩn Vibrio bắt màu hồng (màu gram âm), hình que thẳng hoặc hơi cong, không hình thành bào tử và có tiên mao.

6.2.1.3  Đặc tính sinh hóa

Xác định các đăc tính sinh hóa của vi khuẩn dựa vào mốt số chỉ tiêu cơ bản như vi khuẩn gram âm, di động và các chỉ tiêu sinh hóa nêu trong Bảng 1.

Bảng 1 – Đặc tính sinh hóa của một số loài vi khuẩn Vibrio spp.

Loài	Tăng sinh trong canh dinh dưỡng		Các chỉ tiêu sinh hóa
	0 % NaCl	1 % NaCl	Oxidase	Nitrate	ADH	LDC	ODC
Nhóm 1
Vibrio cholera	+	+	+	+	–	+	+
Vibrio mimicus	+	+	+	+	–	+	+
Nhóm 2
Vibrio metschinikovii	–	+	–	–	v	v	–
Nhóm 3
Vibrio cincinattiensis	–	+	+	+	–	v	–
Nhóm 4
Vibrio hollisae	–	+	+	+	–	–	–
Nhóm 5
Vibrio damselae	–	+	+	+	+	v	–
Vibrio fluvialis	–	+	+	+	+	–	–
Vibrio furnissii	–	+	+	+	+	–	–
Nhóm 6
Vibrio alginolyticus	–	+	+	+	–	+	v
Vibrio parahaemolyticus	–	+	+	+	–	+	+
Vibrio vulnificus	–	+	+	+	–	+	v
Vibrio carchariae	–	+	+	+	–	+	–
+ ≥ 90% dương tính				ADH (Arginine dihydrolase)
– < 10% dương tính				LDC (Lysine decarboxylase)
v 10% – 89% dương tính				ODC (Onithine decarboxylase)
CHÚ THÍCH: Việc định danh vi khuẩn dựa vào các phản ứng sinh hóa, có thể sử dụng máy định danh vi khuẩn tự động (máy định danh Vitek2 hoặc máy định danh vi khuẩn tự động phù hợp khác) hoặc bộ kit định danh cho kết quả tương đương.

6.2.2  Phương pháp PCR

6.2.2.1  Nguyên tắc

Phương pháp phân tích này nhằm xác định ADN của mầm bệnh có hay không tồn tại trong mẫu kiểm tra dựa vào việc xác định đoạn ADN đích có được khuếch đại hay không. Vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm được phát hiện thông qua kỹ thuật PCR, Realtime PCR, với ADN được tách chiết từ canh tăng sinh hoặc từ mẫu mô bệnh của tôm với các biểu hiện triệu chứng điển hình nhằm rút ngắn tối đa thời gian xét nghiệm.

6.2.2.2  Tăng sinh vi khuẩn

Mẫu sau khi xử lý (xem 6.1.2) được tăng sinh trong môi trường pepton kiềm (xem 3.3.1) theo tỷ lệ 1:10, ủ ở tủ ấm (xem 4.1.3) từ 28 °C đến 30 °C từ 18 giờ đến 24 giờ.

CHÚ Ý: Khi xét nghiệm mẫu tôm có triệu chứng, bệnh tích điển hình có thể tách chiết ADN trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm mà không cần phải qua bước tăng sinh (Mẫu bệnh phẩm được nghiền thành huyễn dịch 10 % với dung dịch PBS (xem Phụ lục A). Sau đó ly tâm 1500 g trong 10 phút. Thu dịch nổi dùng cho tách chiết ADN vi khuẩn)

6.2.2.3  Tách chiết ADN (Xem thêm phụ lục C)

Mẫu sau khi tăng sinh (xem 6.2.2.2) được dùng để chiết tách ADN. Tiến hành tách chiết ADN vi khuẩn bằng phương pháp sốc nhiệt (xem phụ lục C) hoặc dùng bộ kít tách chiết thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Sau khi chiết tách, ADN được bảo quản ở 4 °C nếu xét nghiệm ngay, hoặc bảo quản ở âm 20 °C hoặc âm 80 °C (xem 4.1.1) chờ đến khi tiến hành xét nghiệm.

6.2.2.4  Tiến hành phản ứng PCR

Các bước tiến hành phản ứng tham khảo Phụ lục D.

Phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính sử dụng cặp mồi AP3. Chuẩn bị các mồi ở nồng độ 10 µM với nước tinh khiết không có DNase/RNase (xem 3.3.4).

Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và cài đặt chu trình nhiệt chạy phản ứng PCR theo hướng dẫn của bộ kít sử dụng. Ví dụ sử dụng bộ kít Taq PCR Master Mix kit, Catalogue Number: 2014431) của hãng Qiagen.

Thực hiện điện di sản phẩm: Sau khi khi kết thúc chương trình chạy máy PCR, lấy các ống chứa sản phẩm khuếch đại ra khỏi máy và giữ ở 4 °C để chuẩn bị cho quá trình điện di.

LƯU Ý: Mẫu ADN và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng

6.2.2.5  Điện di và đọc kết quả

Các bước tiến hành tham khảo phụ lục D, D.3

Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc gel theo Bảng 2:

Bảng 2 – Kết quả điện di

Giếng	Vạch 336 bp	Kết quả
Thang chuẩn ADN	Các vạch sáng rõ ràng	Điện di tốt
Mẫu đối chứng dương	Có	Hỗn hợp phản ứng PCR tốt
	Không	Mẫu đối chứng dương hỏng hoặc enzyme hỏng
Mẫu đối chứng âm	Có	Bị tạp nhiễm
	Không	Không tạp nhiễm
Mẫu thử	Có	Dương tính với AHPND
	Không	Âm tính với AHPND

Đánh giá kết quả: Điều kiện phản ứng được công nhận khi: đối chứng dương có kích thước vạch sáng 336 bp so với thang chuẩn và đối chứng âm không xuất hiện bất kỳ vạch sáng nào.

Mẫu dương tính là mẫu được phát hiện đồng thời với đối chứng dương có cùng vạch sáng có chiều dài 336 bp so với thang chuẩn.

Mẫu âm tính là mẫu không có vạch sáng có chiều dài 336 bp

6.2.3  Phương pháp Realtime PCR

6.2.3.1  Nguyên tắc

Xem 6.2.2.1

6.2.3.2  Tăng sinh vi khuẩn

Xem 6.2.2.2

6.2.3.3  Tách chiết ADN

Xem 6.2.2.3

6.2.3.4  Tiến hành phản ứng

Các bước tiến hành tham khảo Phụ lục E.

Phương pháp Realtime PCR phát hiện vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính sử dụng cặp mồi và mẫu dò VpPirA.

Chuẩn bị các mồi và mẫu dò ở nồng độ 10 µM với nước tinh khiết không có DNase/RNase (4.3.4).

Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và cài đặt chu trình nhiệt chạy phản ứng realtime PCR phát hiện vi khuẩn gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính theo hướng dẫn của bộ kít được sử dụng, Ví dụ sử dụng bộ kít Master mix Platinum^® Quantitative PCR SuperMix – UDG, Cat. No.: 11730-0172) của hãng Invitrogen

LƯU Ý: Mẫu ADN và nguyên liệu cho phản ứng PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng

6.2.3.5  Đọc kết quả

Điều kiện phản ứng được công nhận: Mẫu đối chứng âm phải cho kết quả âm tính (không có giá trị Ct). Mẫu đối chứng dương phải cho kết quả dương tính và có giá trị Ct dao động trong khoảng ± 2 Ct của mẫu đã được chuẩn độ trước đó.

Với điều kiện như trên, mẫu có giá trị Ct < 35 được coi là dương tính. Mẫu không có giá trị Ct là âm tính. Mẫu có giá trị 35 ≤ Ct ≤ 40 được coi là nghi ngờ.

Với những mẫu nghi ngờ cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm khác để khẳng định kết quả.

7  Kết luận

Tôm được xác định là mắc bệnh AHPND do vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây ra khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích điển hình và kết quả dương tính với một trong các xét nghiệm: phản ứng PCR hoặc phản ứng Realtime PCR

Phương pháp nuôi cấy, phân lập3) và định danh vi khuẩn chỉ kết luận được đến loài Vibrio parahaemolyticus. Vì vậy cần kết hợp với phương pháp Realtime PCR hoặc PCR để xác định gen sinh độc tố gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính của vi khuẩn này.

 

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị dung dịch thuốc thử

A.1  Dung dịch muối đệm phosphat (PBS) pH 7,2

A.1.1  Thành phần:

Natri clorua (NaCl)	8,0 g
Kali clorua (KCl)	0,2 g
Natri hydrophosphat (Na2HPO4)	1,15g
Kali dihydrophosphat (KH2PO4)	0,2 g
Nước cất	1000 ml

A1.2  Chuẩn bị:

Hòa tan natri clorua, kali clorua, natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 1000 ml nước cất. Chỉnh pH trong khoảng 7,2 ± 0,2. Hấp 121 °C trong thời gian 15 phút, chia nhỏ và bảo quản ở 4 °C trong khoảng 3 tháng.

GHI CHÚ: Có thể sử dụng PBS thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.2  Môi trường thạch chọn lọc TCBS

A.2.1  Thành phần:

Yeast extract	5,0 g
Proteose Peptone	10,0 g
Sodium thiosulfate	10,0 g
Sodium citrate	10,0 g
ŌX gall	5,0 g
Sodium cholate	3,0 g
Saccharose	20,0 g
Sodium chloride	10,0 g
Ferric citrate	1,0 g
Bromothymol blue	0,04 g
Thymol blue	0,04 g
Thạch	Từ 8,0 đến 18 g4)
Nước cất	1000 ml

A.2.2  Chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh môi trường khô trong nước, đun đến khi sôi. Chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 8,6 ± 0,2 ở 25°C, nếu cần. Không hấp áp lực.

GHI CHÚ: Có thể sử dụng môi trường thạch TCBS thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.3  Môi trường thạch dinh dưỡng TSA 1% muối

A.3.1  Thành phần:

Peptone từ casein	15,0g
Peptone từ đậu nành	5,0g
NaCl	10,0g
Thạch	15,0g
Nước cất	1000ml

A.3.2  Chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần với nước cất trong chai tam giác vô trùng. Điều chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 8,6 ± 0,2 ở 25°C, nếu cần. Hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121°C trong 15 phút. Làm nguội đến 45 – 50°C, trộn đều và đổ đĩa.

GHI CHÚ: Có thể sử dụng môi trường thạch TSA thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.4  Môi trường pepton kiềm

A.4.1  Thành phần:

Peptone                                    20,0 g

NaCl                                         20,0 g

Nước cất                                  1000 ml

A.4.2  Chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần với nước cất trong chai vô trùng. Điều chỉnh pH, sao cho sau khi khử trùng là 8,6 ± 0,2 ở 25°C, nếu cần. Hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121°C trong 15 phút.

GHI CHÚ: Có thể sử dụng peptone kiềm thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.5  Các môi trường nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn

Sử dụng card định danh vi khuẩn gram âm hoặc kít kiểm tra sinh hóa theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

 

Phụ lục B

(Quy định)

Phương pháp nhuộm Gram

B.1  Thuốc nhuộm

B.1.1  Dung dịch kết tinh tím

Tím tinh thể	2,0 g
Ethanol 95%	20,0 ml
Amoni oxalat	0,8 g
Nước cất	80,0 ml

Hòa tan tím tinh thể trong etanol, hòa tan amino oxalat trong nước cất. Sau đó trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc cho tan hết.

B.1.2  Dung dịch fucshin đậm đặc

Basic fucshin	1 g
Ethanol 95%	10 ml
Phenol (axit phenic)	5 g
Nước cất	100 ml
Khi dùng, pha loãng dung dịch fucshin theo tỉ lệ 1/10 với nước cất.
B.1.3  Dung dịch lugol
Kali iodua	2 g
Iodua tinh thể	1 g
Nước cất	200 ml
Nghiền Kali iodua và iodua tinh thể. cho nước cất vào từ từ và lắc cho tan.
B.1.4  Cồn-axeton
Ethanol 95%	3 phần
Axeton	1 phần

B.2  Tiến hành nhuộm

– Nhỏ dung dịch tím lên tiêu bản: từ 1 phút đến 2 phút, rửa nước nhanh, để khô.

– Nhỏ dung dịch lugol: để 1 phút, rửa nước nhanh, để khô.

– Nhỏ cồn-axeton, rửa nước nhanh, để khô.

– Nhỏ dung dịch fucshin loãng: để 1 phút, rửa nước, thấm khô hoặc sấy khô.

B.3  Xem tiêu bản

– Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và xem tiêu bản bằng kính hiển vi quang học bằng vật kính độ phóng đại 100 lần.

– Vi khuẩn gram dương bắt màu tím.

– Vi khuẩn gram âm bắt màu hồng.

 

Phụ lục C

(Tham khảo)

Kỹ thuật tách chiết ADN vi khuẩn bằng phương pháp sốc nhiệt

Cụ thể, gồm các bước như sau:

– Chuyển 1 ml dịch tăng sinh vào ống eppendorf. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi, giữ lại phần sinh khối kết tụ ở đáy.

– Huyền phù sinh khối trong 1ml nước muối sinh lý đã được hấp tiệt trùng. Vortex mạnh để sinh khối được trộn đều trong nước. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ dịch nổi, giữ lại phần sinh khối kết tụ ở đáy.

– Bổ sung 250 µl nước muối sinh lý đã được hấp tiệt trùng. Vortex mạnh để trộn đều sinh khối.

– Đặt ống eppendorf vào block nhiệt khô 95°C trong 20 phút.

– Đặt ống eppendort vào khay đá để giảm nhanh nhiệt độ từ nóng xuống lạnh trước khi ly tâm.

– Ly tâm ở nhiệt độ từ 20°C đến 25°C tốc độ 10000 vòng/phút trong 3 phút.

– Chuyển 100 µl dịch nổi bên trên chứa ADN sang 1 ống mới.

ADN sau tách chiết bảo quản 4°C đến 8°C trong 24 giờ, hoặc lưu -20°C nếu chưa thực hiện phản ứng ngay.

 

Phụ lục D

(Tham khảo)

Phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh AHPND ở tôm bằng đoạn mồi AP3

D.1  Trình tự cặp mồi

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu phát hiện gen của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh AHPND theo Bercovier TK (OIE, 2017)

Bảng D.1 – Trình tự cặp mồi

Mồi	Trình tự (5′-3′)	Kích cỡ sản phẩm bp
Mồi xuôi AP3-F	ATG AGT AAC AAT AT A AAA CAT GAA AC	336
Mồi ngược AP3-R	GTG GTA ATA GAT TGT ACA GAA

D.2  Thực hiện phản ứng PCR

Sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị và kit nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Thành phần cho 1 phản ứng được nêu trong bảng D.2

VÍ DỤ: PCR dùng kit nhân gen Taq PCR Master Mix kit, Cat No.: 201443, của hãng Qiagen

Bảng D.2 – Thành phần phản ứng PCR

STT	Thành phần	Nồng độ µM	Thể tích µl
1	Nước không có DNAse/RNAse		8,5
2	Dung dịch Master mix 2X		12,5
3	Mồi xuôi AP3-F	10	0,5
4	Mồi ngược AP3-R	10	0,5
Tổng thể tích			22

Chuyển 22 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

– Mẫu đối chứng dương: cho 3 µl mẫu ADN tách chiết đã được giám định hoặc sử dụng các mẫu chuẩn.

– Mẫu đối chứng âm: cho 3 µl nước không có enzyme phân hủy ADN/ARN, hoặc là mẫu ADN vi khuẩn âm tính với Vibrio parahaemolyticus.

– Mẫu thử: cho 3 µl mẫu ADN kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen đã cài đặt chu trình nhiệt như trong bảng D.3

Bảng D.3 – Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR*

Nhiệt độ °C	Thời gian	Số chu kỳ
94 (*)	3 phút (*)	1
94	30 giây	30
53	30 giây
72	40 giây
72	5 phút	1
CHÚ THÍCH: Nhiệt độ và thời gian (*) chỉ phù hợp với kít HotstarTag®Master Mix, Cat. No.: 203445 (Qiagen).

D.3  Điện di sản phẩm PCR

– Chuẩn bị thạch Agarose (3.3.5) 1,5 % pha trong dung dịch TBE (3.3.5) 0,5X bổ sung chất nhuộm gel (3.3.6) (ví dụ như: gel red) với tỷ lệ theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

– Đổ thạch vào khuôn điện di (có lược).

– Thạch khô, rút lược ra và cho thạch vào bể điện di có chứa dung dịch TBE 1X.

– Cho mẫu vào các giếng (10 µl sản phẩm PCR + 2 µl dung dịch dung dịch nạp mẫu (3.3.7)).

– Sử dụng thang chuẩn ADN (3.3.8).

LƯU Ý: Khi chạy điện di sản phẩm PCR phải có mẫu đối chứng dương và đối chứng âm.

– Đậy nắp bể điện di lại và kết nối với dòng điện, phải đảm bảo dòng điện được kết nối đúng cực. Điện di trong vòng 45 phút với hiệu điện thế 80 V – 100 V.

– Sau khi điện di xong, tắt nguồn điện, lấy thạch ra rửa nước trong 5 phút và đọc kết quả bằng ánh sáng UV thích hợp, chụp ảnh.

 

Phụ lục E

(Tham khảo)

Phương pháp Realtime PCR phát hiện vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh AHPND ở tôm bằng đoạn mồi VpPirA

E.1  Trình tự cặp mồi và đoạn dò

Bảng E.1 – Trình tự cặp mồi và đoạn dò

Mồi và đoạn dò	Trình tự (5′ – 3′)
Mồi xuôi VpPirA-F	TTG GAC TGT CGA ACC AAA CG
Mồi ngược VpPirA-R	GCA CCC CAT TGG TAT TGA ATG
Đoạn dò VpPirA-P	FAM – AGA CAG CAA ACA TAC ACC TAT CAT CCC GGA – TAMRA

E.2  Thực hiện phản ứng Realtime PCR

Sử dụng cặp mồi và đoạn dò đã được chuẩn bị và kít nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Thành phần cho 1 phản ứng được nêu trong bảng E.2.

VÍ DỤ: sử dụng bộ kít Master mix Platinum^® Quantitative PCR SuperMix – UDG, Cat. No.: 11730-017 của hãng Invitrogen.

Bảng E.2 – Thành phần phản ứng Realtime PCR

STT	Thành phần	Nồng độ	Thể tích (µl)
1	Nước không có DNAse/RNAse		5,5
2	Dung dịch SuperMix	2X	12,5
3	Mồi xuôi VpPirA-F	10 pM	0,75
4	Mồi ngược VpPirA-R	10 pM	0,75
5	Đoạn dò VpPirA-P	10 pM	0,5
Tổng thể tích			20

– Sau khi chuẩn bị xong hỗn hợp Master mix tiến hành:

+ Cho 20 µl hỗn hợp Master mix vào ống PCR 0,2 ml;

+ Cho 5 µl ADN vừa tách chiết vào ống PCR 0,2 ml đã chứa sẵn 20 µl hỗn hợp Master mix;

LƯU Ý: Để kiểm soát phản ứng PCR, mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương được thực hiện song song cùng với mẫu kiểm tra.

+ Mẫu đối chứng âm: Cho 5 µl nước tinh khiết không có ADNse/RNase vào ống PCR đã chứa sẵn 20 µl hỗn hợp Master mix.

+ Mẫu đối chứng dương: Cho 5 µl ADN dương chuẩn của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh AHPND (mẫu ADN hỗn hợp được chuẩn bị từ mẫu dương chuẩn của vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus gây bệnh AHPND) vào ống PCR đã chứa sẵn 20 µl hỗn hợp Master mix.

+ Đặt ống PCR (20 µl hỗn hợp Master mix và 5 µl) vào máy realtime PCR và tiến hành cài đặt chu trình nhiệt thực hiện phản ứng realtime PCR.

Bảng E.3 – Chu trình nhiệt cho phản ứng Realtime PCR *

Nhiệt độ	Thời gian	Số chu kỳ
50 °C (*)	2 phút (*)	1
95 °C (*)	2 phút (*)
95 °C	15 giây	40
60 °C	30 giây (Ghi nhận tín hiệu quang)
CHÚ THÍCH: Nhiệt độ và thời gian (*) chỉ phù hợp với kít PlatinumQuantitative PCR SuperMix-UDG, Cat. No.: 11730-017.

 

PHỤ LỤC F

(Quy định)

Sơ đồ chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm (AHPND) trong phòng thí nghiệm

Hình F.1 – Sơ đồ chẩn đoán bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (AHPND) trong phòng thí nghiệm

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] OIE 2018 chapter 2.2.1 Acute Hepatopancreatic Necrosic Disease.

[2] TCCS 02: 2014/TY-TS: Tiêu chuẩn cơ sở phát hiện vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus có gen gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm bằng kỹ thuật PCR (Quyết định ban hành số 934/QĐ-TY-TS ngày 12 tháng 12 năm 2014 của Cục trưởng Cục Thú y).

[3] TCCS 01: 2016/TY-TS: Quy trình xét nghiệm phát hiện vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus có gen gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm bằng kỹ thuật Real-time PCR (Quyết định ban hành số 453/QĐ-TY-TS ngày 01 tháng 07 năm 2016 của Cục truởng Cục Thú y).

[4] Jee Eun Han, Kathy F.J.Tang, Carlos R. Pantoja, Brenda L. White, Donald V. Lightner, 2015. qPCR assay for detecting and quantifying a virulence plasmid in acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) due to pathogenic Vibrio parahaemolyticus. Aquaculture 442 (2015) 12-15.

[5] ISO 20837:2006, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens- Requirements for sample preparation for qualitative detection.

[6] Jee Eun Han, D.V.M. Ph.D. Kathy F.J. Tang, Ph.D. Luis F. Aranguren, Ph.D. Patharapol Piamsomboon, D.V.M., Ph.D. Seung Hye Han, 2017. Four AHPND strains identified on Latin American shrimp farms. https://www.aquaculturealliance.org/advocate/four-ahpnd-strains-identified-on-latin-american-shrimp-farms/.

[7] Chapter VI – Laboratory identification of Vibrio cholerae. Laboratory Methods for the Diagnosis of Vibrio cholerae, Centers for Disease Control and Prevention.

---