TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8710-21:2019 VỀ BỆNH THỦY SẢN – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 21: BỆNH DO VI KHUẨN STREPTOCOCCUS AGALACTIAE Ở CÁ

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8710-21 : 2019

BỆNH THỦY SẢN – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 21: BỆNH DO VI KHUẨN STREPTOCOCCUS AGALACTIAE Ở CÁ

Aquatic animal disease – Diagnostic procedure –  Part 21: Streptococcus agalactiae disease in fish

Lời nói đầu

TCVN 8710-21 : 2019 do Chi cục Thú y vùng VI – Cục Thú y biên soạn trên cơ sở tham khảo tài liệu của các bài báo khoa học quốc tế, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ tiêu chuẩn TCVN 8710 Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán gồm các phần sau:

– TCVN 8710-1: 2011, phần 1: Bệnh Còi do vi rút ở tôm (MBV);

– TCVN 8710-2: 2011, phần 2: Bệnh Hoại tử thần kinh ở cá biển (VNN);

– TCVN 8710-3: 2011, phần 3: Bệnh Đốm trắng ở tôm (WSSV);

– TCVN 8710-4: 2011, phần 4: Bệnh Đầu vàng ở tôm (YHV);

– TCVN 8710-5: 2011, phần 5: Bệnh Taura ở tôm He (TSV);

– TCVN 8710-6: 2019, phần 6: Bệnh do Koi herpesvirus ở cá chép (KHV);

– TCVN 8710-7: 2012, phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép (SVC);

– TCVN 8710-8: 2012, phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm (IMNV);

– TCVN 8710-9: 2012, phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm (NHB);

– TCVN 8710-10: 2015, phần 10: Bệnh do perkinsus marinus ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ;

– TCVN 8710-11: 2015, phần 11: Bệnh do perkinsus olseni ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ;

– TCVN 8710-12: 2015, phần 12: Bệnh do vi bào tử ở tôm;

– TCVN 8710-13: 2015, phần 13: Bệnh do vi rút HPV ở tôm;

– TCVN 8710-14: 2015, phần 14: Bệnh EUS ở cá;

– TCVN 8710-15: 2015, phần 15: Bệnh do Aeromonas ở cá;

– TCVN 8710-16: 2016, phần 16: Bệnh gan thận mủ ở cá da trơn;

– TCVN 8710-17: 2016, phần 17: Bệnh sữa trên tôm hùm;

– TCVN 8710-19: 2019, phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm;

– TCVN 8710-20: 2019, phần 20: Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm;

– TCVN 8710-21: 2019, phần 21: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae ở cá.

 

BỆNH THỦY SẢN – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 21: BỆNH DO VI KHUẨN STREPTOCOCCUS AGALACTIAE Ở CÁ

Aquatic animal disease – Diagnostic procedure –  Part 21: Streptococcus agalactiae disease in fish

CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sinh học thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh do vi khuẩn Strepcoccus agalactiae gây ra ở cá.

2. Thuật ngữ, định nghĩa và các từ viết tắt

2.1  Thuật ngữ, định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

Vi khuẩn Streptococcus agalactiae là vi khuẩn gram dương, liên cầu khuẩn thuộc nhóm B (GSB), giống Streptococcus, họ Streptococcaceae.

Vi khuẩn Streptococcus agalactiae gây bệnh ở cá, phát triển tốt ở nhiệt độ 30 °C đến 37 °C, có khả năng phát triển ở độ mặn 0 ‰ đến 35 ‰, có thể tồn lưu tự do trong nước ao và bùn đáy từ 3 ngày đến 7 ngày.

2.2  Các từ viết tắt

– ADN (Deoxyribonucleic acid): Axít deoxyribonucleic;

– DNase (Deoxyribonuclease): enzyme thủy phân liên kết của phân tử ADN;

– RNA (Ribonucleic acid): Axít ribonucleic;

– RNase (Ribonuclease): enzyme thủy phân liên kết của phân tử ARN;

– BA (blood agar): Môi trường thạch máu;

– BHI (brain heart infusion): Môi trường canh thang não tim;

– TSA (tryptic soy agar): thạch đậu tương;

– Realtime PCR (Realtime Polymerase Chain Reaction): Phản ứng tổng hợp chuỗi thời gian thực;

– GSB (Group B Streptococcus): Liên cầu khuẩn nhóm B;

– TBE 10X (Tris-axit boric- Ethylendiamin Tetraacetic axit): Dung dịch đệm TBE đậm đặc 10 lần;

– Ct (cycle threshold): giá trị chu kỳ ngưỡng;

– UV (Ultraviolet): Cực tím.

3  Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết, phân tích, sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, không có DNase/RNase, trừ khi có quy định khác.

3.1  Thuốc thử và vật liệu thử của phương pháp nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn (xem phụ lục A)

3.1.1  Môi trường thạch BA (thạch máu) gồm thạch Colombia và 5 % máu cừu;

3.1.2  Môi trường thạch chọn lọc Chromagar Strep B;

3.1.3  Môi trường thạch dinh dưỡng TSA;

3.1.4  Môi trường canh thang BHI;

3.1.5  Card định danh vi khuẩn Gram (+) hoặc kit kiểm tra sinh hóa;

3.1.6  Thuốc nhuộm gram (Xem phụ lục B).

3.2  Thuốc thử và vật liệu thử của phương pháp Realtime PCR

3.2.1  Dung dịch tách chiết (NaCl 0,9%…) hoặc bộ kit tách chiết ADN vi khuẩn;

3.2.2  Bộ kit nhân gen: Power SYBR Green PCR Master Mix;

3.2.3  Đoạn mồi (primers);

3.2.4  Mẫu đối chứng;

3.2.5  Nước không có enzyme phân hủy ADN/ARN;

3.2.6  Thang chuẩn ADN 100bp;

3.2.7  Dung dịch đệm TBE 10X;

3.2.8  Bột Agarose;

3.2.9  Chất nhuộm màu (GelRed hoặc chất nhuộm gel tương đương);

3.2.10  Chất đệm tải mẫu (Loading dye);

3.2.11  Cồn (Ethanol) 70 % (C₂H₆O).

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau:

4.1  Thiết bị, dụng cụ sử dụng chung

4.1.1  Tủ lạnh: tủ lạnh thường (từ 0°C đến 8 °C), tủ lạnh âm sâu (từ âm 20 °C đến âm 80 °C);

4.1.2  Buồng cấy an toàn sinh học cấp 2;

4.1.3  Tủ ấm duy trì nhiệt độ ở 28 °C đến 30 °C;

4.1.4  Máy lắc trộn vortex, có thể hoạt động với tốc độ từ 200 g đến 2500 g:

4.1.5  Nồi hấp vô trùng duy trì nhiệt độ 115 °C và 121 °C;

4.1.6  Cối, chày sứ, kéo, panh kẹp, que cấy vô trùng;

4.2  Thiết bị, dụng cụ của phương pháp nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn

4.2.1  Kính hiển vi quang học, vật kính 10X, 20X, 40X và 100X;

4.2.2  Máy định danh vi khuẩn hoặc thiết bị khác tương đương;

4.3  Thiết bị, dụng cụ của phương pháp PCR và Realtime-PCR

4.3.1  Máy tách chiết ADN/ARN tự động (nếu có);

4.3.2  Máy ly tâm;

4.3.3  Máy spindown;

4.3.4  Máy lắc ủ nhiệt;

4.3.5  Máy nhân gen (Realtime – PCR);

4.2.7  Thiết bị điện di: khay đổ thạch, bể điện di, máy đọc và chụp ảnh gel.

5  Chẩn đoán lâm sàng

5.1  Dịch tễ học

Loài cảm nhiễm: các loài cá đặc biệt là cá rô phi. Bệnh xảy ra quanh năm nhưng chủ yếu xảy ra vào mùa có nhiệt độ cao, mùa hè thu miền Bắc và mùa khô miền Nam với đỉnh điểm cá chết trong vòng 2 tuần đến 3 tuần với tỉ lệ chết 90 % đến 100 % [3]. Bệnh lây nhiễm cho cá ở mọi lứa tuổi, kích cỡ (cá có kích thước lớn trên 100 g dễ bị mắc bệnh hơn).

5.2  Triệu chứng lâm sàng

Cá bị bệnh có dấu hiệu bơi bất thường (bơi xoắn ốc hoặc quay vòng); cơ thể sẫm màu, một bên hoặc hai bên mắt màu đục và lồi; xuất huyết tại gốc vây và xương nắp mang, trướng bụng, hậu môn sưng đỏ. Cá chết với tỷ lệ cao.

5.3  Bệnh tích

Tại các cơ quan nội tạng như gan, thận, lách, mật có thể bị sưng, nhũn; có thể xuất huyết và viêm, ổ bụng chứa nhiều dịch.

6  Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1  Lấy mẫu và xử lý mẫu bệnh phẩm

6.1.1  Lấy mẫu

– Đối với cá nhỏ (có chiều dài nhỏ hơn 10 cm): Lấy nguyên con trên 1 g.

– Đối với cá lớn (có chiều dài lớn hơn hoặc bằng 10 cm): Lấy phần nội tạng gan, thận, lách từ 5 con đến 10 con.

Mẫu cá phải còn sống hoặc vừa mới chết. Mẫu không dập nát. Mẫu phải được lấy vô trùng, các bộ phận phải để riêng biệt trong từng túi hay lọ vô trùng bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C (không bảo quản mẫu xét nghiệm vi trùng ở nhiệt độ âm). Bệnh phẩm từ lúc lấy cho tới khi thực hiện xét nghiệm không được quá 24 giờ.

6.1.2  Xử lý mẫu

Mẫu sau khi lấy (xem 6.1.1), tiến hành cắt nhuyễn ít nhất 1 g, trộn đều tạo thành mẫu đồng nhất.

6.2  Phát hiện vi khuẩn Streptococcus agalactiae

6.2.1  Phương pháp nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn

6.2.1.1  Phân lập vi khuẩn

Đối với cá nhỏ (chiều dài nhỏ hơn 10 cm): Đồng nhất các cơ quan nội tạng, dùng que cấy, cấy ria lên môi trường thạch BA hoặc trên môi trường chọn lọc Chromagar Strep B.

Đối với cá lớn (chiều dài trên 10 cm): Sau khi mổ khám, dùng cồn 70 % (xem 3.2.11) sát trùng bề mặt các cơ quan nội tạng, dùng que cấy, cấy ria từ các cơ quan nội tạng như gan, thận, lách hoặc từ não cá trên môi trường thạch BA hoặc trên môi trường chọn lọc Chromagar Strep B.

Sau khi cấy, ủ đĩa thạch trong tủ ấm (xem 4.1.3) ở 28 °C đến 30 °C sau 24 giờ đến 48 giờ. Trên môi trường thạch BA, khuẩn lạc hình tròn, trơn nhẵn, đường kính từ 1,5 mm đến 2 mm, sắc tố màu trắng và dung huyết dạng β và trên môi trường Chromagar Strep B có dạng hình tròn và màu tím hoa cà điển hình được nghi ngờ là vi khuẩn Streptococcus agalactiae.

Dùng que cấy vô trùng, chọn khuẩn lạc điển hình cấy ria trên môi trường thạch TSA (xem 3.1.3) ủ thạch trong tủ ấm (xem 4.1.3) ở 28 °C đến 30 °C trong 24 giờ đến 48 giờ. Lấy khuẩn lạc thuần kiểm tra sinh hóa, đồng thời tăng sinh khuẩn lạc trong 2 ml canh thang BHI (xem 3.1.4) để tiến hành nhuộm Gram vì Streptococcus agalactiae chỉ xuất hiện dạng chuỗi khi chúng được nuôi trong môi trường canh hoặc trong mô động vật.

CHÚ THÍCH: Vi khuẩn Streptococcus agalactiae có thể nuôi cấy trên môi trường thạch BHI, thạch TSA, canh BHI, canh TSA,… vì thế tùy điều kiện phòng thí nghiệm để lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp

6.2.1.2  Quan sát hình thái, sử dụng phương pháp nhuộm Gram

Nhỏ một giọt nước muối sinh lý trên phiến kính, dùng que cấy vô trùng chuyển khuẩn lạc trên môi trường TSA (xem 3.1.3) vào giọt nước trộn đều, dàn mỏng, để khô tự nhiên sau đó cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn. Tiêu bản sau khi cố định được nhuộm bằng máy nhuộm gram tự động (nếu có) hoặc phương pháp nhuộm gram (Xem phụ lục B).

Soi trên kính hiển vi ở vật kính dầu với độ phóng đại 100 lần, vi khuẩn Streptococcus agalactiae bắt màu tím (Gram dương), hình tròn, liên kết với nhau tạo thành chuỗi dạng liên cầu khuẩn.

6.2.1.3  Đặc tính sinh hóa

Xác định các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn dựa vào một số chỉ tiêu cơ bản như vi khuẩn gram dương, liên kết dạng liên cầu khuẩn, âm tính với catalase và oxidase và các chỉ tiêu sinh hóa nêu trong bảng 1.

Bảng 1 – Các chỉ tiêu sinh hóa của vi khuẩn Streptococcus agalactiae

Đặc tính cơ bản	Thuộc tính của Streptococcus agalactiae
CAMP test	+
Capsule	+
Catalase	–
Coagulase	–
Có roi hay không	Không có roi
Nhuộm Gram	+
Khả năng dung huyết	Dung huyết β
Khả năng di động	Không di động
O/F	Yếm khí tùy nghi
Oxidase	–
PYR	–
Hình dạng	Hình cầu
Bào tử	Không hình thành bào tử
Urease	–
VP (Voges Proskauer)	Không cố định
Khả năng lên men
Adonitol	–
Arabinose	–
Arabitol	–
Arbutin	–
Cellobiose	Không cố định
Dulcitol	–
Erythritol	–
Fructose	+
Galactose	+
Glucose	+
Glycerol	+
Glycogen	–
Hippurate	+
Inulin	–
Lactose	Không cố định
Maltose	+
Mannitol	–
Melibiose	+
Raffinose	+
Ribose	+
Salicin	Không cố định
Sorbitol	–
Sucrose	+
Trehalose	+
Xylose	–
Phản ứng enzyme
Alkaline Phosphatase	+
Arginine Dehydrolase	+
Esculin Hydrolysis	–
CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng máy định danh vi khuẩn tự động (máy định danh Vitek2 hoặc sử dụng kit định danh vi khuẩn Gram dương phù hợp khác)

6.2.2  Phương pháp realtime PCR

6.2.2.1  Nguyên tắc

Phương pháp phân tích này dựa vào sự khuếch đại đoạn ADN đích của vi khuẩn Streptococcus agalactiae gây bệnh ở cá được phát hiện thông qua kỹ thuật Realtime PCR, với ADN được tách chiết từ canh thang hoặc từ mẫu bệnh phẩm nhằm rút ngắn tối đa thời gian xét nghiệm.

Nguyên lý của phản ứng SYBR Green realtime PCR là SYBR Green gắn không đặc hiệu với sản phẩm ADN và tín hiệu huỳnh quang tăng tỉ lệ thuận với sản phẩm ADN khi được nhân lên. Chính vì không đặc hiệu nên phương pháp này phải làm thêm bước điện di xác định kích thước vạch sáng của gen đích.

6.2.2.2  Tăng sinh vi khuẩn

Mẫu sau khi xử lý được tăng sinh trong canh thang BHI (xem 3.1.4) theo tỷ lệ 1:10, ủ tăng sinh ở 28 °C đến 30 °C trong tủ ấm (xem 4.1.3) từ 18 giờ đến 24 giờ.

6.2.2.3  Tách chiết ADN

Mẫu sau khi tăng sinh (xem 6.2.2.2) được dùng để chiết tách ADN. Tiến hành tách chiết ADN vi khuẩn bằng phương pháp sốc nhiệt (xem Phụ lục C) hoặc dùng bộ kít tách chiết thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Sau khi chiết tách, ADN được bảo quản ở 4 °C nếu xét nghiệm ngay, hoặc bảo quản ở âm 20 °C hoặc âm 80 °C (xem 5.1.1).

6.2.2.4  Tiến hành phản ứng realtime PCR

Các bước tiến hành phản ứng tham khảo phụ lục D.

Phương pháp Realtime PCR phát hiện vi khuẩn Streptococcus agalactiae gây bệnh ở cá sử dụng đoạn mồi IGS. Chuẩn bị mồi ở nồng độ 10 μl với nước sạch DNase/Rnase (3.2.5)

Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và cài đặt chu trình nhiệt chạy phản ứng realtime PCR phát hiện vi khuẩn Streptococcus agalactiae theo hướng dẫn của bộ kít được sử dụng (tham khảo phụ lục D)

LƯU Ý: Mẫu ADN và nguyên liệu cho phản ứng realtime PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

6.2.2.5  Điện di1) và đọc kết quả

Các bước tiến hành phản ứng tham khảo phụ lục D, D.3

Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc gel theo bảng 2:

Bảng 2 – Kết quả điện di

Giếng	Vạch 336 bp	Kết quả
Thang chuẩn ADN	Các vạch sách rõ ràng	Điện di tốt
Mẫu đối chứng dương	Có	Hỗn hợp phản ứng PCR tốt
	Không	Mẫu đối chứng dương hỏng hoặc enzyme hỏng
Mẫu đối chứng âm	Có	Bị tạp nhiễm
	Không	Không tạp nhiễm
Mẫu thử	Có	Dương tính với Streptococcus agalactiae
	Không	Âm tính với Streptococcus agalactiae

Đánh giá kết quả:

Điều kiện phản ứng được công nhận khi: kết quả của mẫu đối chứng dương (có giá trị Ct đã biết trước) phải cho kết quả dương tính và có giá trị Ct = ±2 Ct, mẫu đối chứng âm phải cho kết quả âm tính (không có giá trị Ct).

Với điều kiện như trên, mẫu dương tính là mẫu có giá trị Ct ≤ 35, sản phẩm sau khi chạy Realtime PCR tiếp tục điện di có kích thước vạch sáng 190 bp.

Mẫu âm tính là mẫu không có Ct hoặc mẫu có giá trị Ct ≤ 35 nhưng sản phẩm sau khi điện di không có vạch sáng hay vạch sáng không có kích thước 190 bp.

Mẫu có giá trị 35 < Ct ≤ 40 và sản phẩm sau khi chạy Realtime PCR tiếp tục điện di có kích thước vạch sáng 190 bp được coi là nghi ngờ.

Những mẫu nghi ngờ cần được xét nghiệm lại hoặc sử dụng phương pháp khác để khẳng định.

7  Kết luận

Cá được xác định là mắc bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae gây ra khi có đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích điển hình của bệnh và kết quả dương tính với một trong hai phương pháp:

– Phân lập, định danh được vi khuẩn Streptococcus agalactiae.

– Phản ứng Realtime PCR phát hiện dương tính Streptococcus agalactiae.

 

PHỤ LỤC A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị dung dịch thuốc thử

A.1  Môi trường thạch BA (thạch máu)

Thành phần:

Special nutrient substrate	23,0 g
Starch	1,0 g
Sodium chloride	5,0 g
Agar	13,0 g
Nước cất vô trùng	1000 ml
Máu ngựa hoặc cừu vô trùng	5 %

Chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần (trừ máu ngựa hoặc cừu) với nước cất trong chai tam giác vô trùng. Điều chỉnh pH 7,3 ± 0,2 bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N. Hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121 °C trong 15 phút. Làm nguội 45 °C đến 50 °C. Cho 5ml máu cừu hoặc máu ngựa vào 95 ml môi trường, trộn đều và đổ đĩa.

GHI CHÚ: Có thể sử dụng thạch BA thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.2  Môi trường thạch chọn lọc Chromagar Strep B

Thành phần:

Peptone và yeast extract 20,0 g

Muối 7,5 g

Hỗn hợp Chromogenic 2,2 g

Thạch 15,0 g

Nước cất vô trùng 1010 ml

Chất bổ sung (supplement) S1 8 ml

Chất bổ sung (supplement) S2 0,25 g

Chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần (trừ chất bổ sung) với 1000 ml nước cất trong chai tam giác vô trùng. Thêm 8ml chất bổ sung S1 vào dung dịch huyền phù trên. Khuấy đều cho đến khi thạch tan hết. Điều chỉnh pH 7,3 ± 0.2 bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N. Hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121 °C trong 15 phút. Làm nguội 45 °C đến 50 °C.

Hòa tan 0,25 g chất bổ sung S2 vào 10 ml nước cất.

Dùng lọc tiệt trùng và cho 10 ml chất bổ sung S2 vào môi trường đã làm nguội 45 °C đến 50 °C. Lắc hoặc khuấy nhẹ để đồng nhất môi trường, đổ vào đĩa petri vô trùng.

GHI CHÚ: Có thể sử dụng thạch Chromagar Strep B thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.3  Môi trường thạch dinh dưỡng TSA

Thành phần:

Peptone từ casein 15,0 g

Peptone từ đậu nành 5,0 g

NaCl 5,0 g

Thạch 15,0 g

Nước cất vô trùng 1000 ml

Chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần với nước cất trong chai tam giác vô trùng. Điều chỉnh pH 7,3 ± 0.2 bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N. Hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121°C trong 15 phút. Làm nguội 45 °C đến 50 °C, trộn đều và đổ đĩa.

GHI CHÚ: Có thể sử dụng môi trường thạch TSA thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.4  Môi trường canh BHI

Thành phần:

Chất dinh dưỡng (chiết xuất từ não, tim và peptone) 27,5 g

Glucose 2,0 g

NaCl 5,0 g

Disodium phosphate 2,5 g

Nước cất vô trùng 1000 ml

Chuẩn bị:

Hòa tan các thành phần với nước cất trong chai tam giác vô trùng. Hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121 °C trong 15 phút. Điều chỉnh pH 7,4 ± 0.2 bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N.

GHI CHÚ: Có thể sử dụng môi trường BHI thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

A.5  Môi trường kiểm tra tính chất sinh hóa

Sử dụng card định danh vi khuẩn gram dương hoặc kít kiểm tra sinh hóa theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

 

Phụ lục B

(Quy định)

Phương pháp nhuộm Gram

B.1  Thuốc nhuộm

B.1.1  Dung dịch kết tinh tím

Tím tinh thể	2,0 g
Ethanol 95%	20,0 ml
Amoni oxalat	0,8 g
Nước cất	80,0 ml

Hòa tan tím tinh thể trong etanol, hòa tan amino oxalat trong nước cất. Sau đó trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc cho tan hết.

B.1.2  Dung dịch fucshin đậm đặc

Basic fucshin	1 g
Ethanol 95%	10 ml
Phenol (axit phenic)	5 g
Nước cất	100 ml

Khi dùng, pha loãng dung dịch fucshin theo tỉ lệ 1/10 với nước cất.

B.1.3  Dung dịch lugol

Kali iodua	2 g
Iodua tinh thể	1 g
Nước cất	200 ml

Nghiền Kali iodua và iodua tinh thể, cho nước cất vào từ từ và lắc cho tan

B.1.4  Cồn-axeton

Ethanol 95%	3 phần
Axeton	1 phần

B.2  Tiến hành nhuộm

– Nhỏ dung dịch tím lên tiêu bản: từ 1 phút đến 2 phút, rửa nước nhanh, để khô

– Nhỏ dung dịch lugol: để 1 phút, rửa nước nhanh, để khô.

– Nhỏ cồn-axeton, rửa nước nhanh, để khô.

– Nhỏ dung dịch fucshin loãng: để 1 phút, rửa nước, thấm khô hoặc sấy khô.

B.3  Xem tiêu bản

– Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và xem tiêu bản bằng kính hiển vi quang học bằng vật kính độ phóng đại 100 lần.

– Vi khuẩn gram dương bắt màu tím.

– Vi khuẩn gram âm bắt màu hồng..

 

Phụ lục C

(Tham khảo)

Kỹ thuật tách chiết ADN vi khuẩn bằng phương pháp sốc nhiệt

Cụ thể, gồm các bước như sau:

– Chuyển 1 ml dịch tăng sinh vào ống eppendorf. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi, giữ lại phần sinh khối kết tụ ở đáy.

– Huyền phù sinh khối trong 1ml nước muối sinh lý đã được hấp tiệt trùng. Vortex mạnh để sinh khối được trộn đều trong nước. Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ dịch nổi, giữ lại phần sinh khối kết tụ ở đáy.

– Bổ sung 250 μl nước muối sinh lý đã được hấp tiệt trùng. Vortex mạnh để trộn đều sinh khối.

– Đặt ống eppendort vào block nhiệt khô 95°C trong 20 phút.

– Đặt ống eppendort vào khay đá để giảm nhanh nhiệt độ từ nóng xuống lạnh trước khi ly tâm.

– Ly tâm ở nhiệt độ từ 20°C đến 25°C tốc độ 10000 vòng/phút trong 3 phút.

– Chuyển 100 μl dịch nổi bên trên chứa ADN sang 1 ống mới.

ADN sau tách chiết bảo quản 4°C đến 8°C trong 24 giờ, hoặc lưu -20°C nếu chưa thực hiện phản ứng ngay.

CHÚ THÍCH: Kỹ thuật tách chiết ADN vi khuẩn có thể sử dụng bộ kit tách chiết ADN cho kết quả tương đương, ví dụ kit InViMag Bacteria DNA kit/KFml, Catalogue Number: 24331504502)

 

Phụ lục D

(Tham khảo)

Phương pháp Realtime PCR phát hiện vi khuẩn Streptococcus agalactiae gây bệnh ở cá bằng đoạn mồi IGS

D.1 – Trình tự cặp mồi

Bảng D.1 – Trình tự cặp mồi

Mồi	Trình tự (5′-3′)	Kích cỡ sản phẩm bp
Mồi xuôi IGS-F	GGA AAC CTG CCA TTT GCG TCT	190
Mồi ngược IGS-R	AAT CTA TTT CTA GAT CGT GGA AT

D.2 – Thực hiện phản ứng Realtime PCR

Sử dụng cặp mồi đã được chuẩn bị và kit nhân gen theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Thành phần cho 1 phản ứng được nêu trong bảng D.2

VÍ DỤ: Realtime PCR dùng kít nhân gen Power SYBR Green PCR Master Mix, Catalogue Number: PN 4367659 của hãng Applied Biosystems3).

Bảng D.2.1 – Thành phần phản ứng Realtime PCR

STT	Thành phần	Nồng độ μM	Thể tích μl
1	Nước không có DNAse/RNAse		6
2	Dung dịch Master mix 2X		12,5
3	Mồi xuôi IGS-F	10	0,75
4	Mồi ngược IGS-R	10	0,75
Tổng thể tích			20
5	ADN mẫu tách chiết		5

Chuyển 20 μl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

– Mẫu đối chứng dương: cho 5 μl mẫu ADN tách chiết đã được giám định hoặc sử dụng các mẫu chuẩn.

– Mẫu đối chứng âm: cho 5 μl nước không có enzyme phân hủy ADN/ARN, hoặc là mẫu ADN vi khuẩn âm tính với Streptococcus agalactiae.

– Mẫu thử: cho 5 μl mẫu ADN kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng Realtime PCR bằng máy nhân gen đã cài đặt chu trình nhiệt như trong bảng D.3

Bảng D.2.2 – Chu trình nhiệt cho phản ứng Realtime PCR*

Nhiệt độ °C	Thời gian	Số chu kỳ
50	2 phút	1
95	10 phút	1
94	30 giây	40
60	1 phút
95	15 giây	1
60	1 phút	1
95	30 giây	1
60	15 giây	1
Chú thích: Nhiệt độ và thời gian (*) chỉ phù hợp với kít Power SYBR Green PCR Master Mix, Cat.No: PN 4367659 (Applied Biosystems)3).

D.3  Điện di sản phẩm realtime PCR

– Chuẩn bị thạch 1,5 %: cho 1,5 g agarose (3.2.8) vào lọ thủy tinh chịu nhiệt, bổ sung thêm 100 ml TBE 0,5X, đun dung dịch thạch trong lò vi sóng và mang ra lắc nhẹ sau mỗi 30 giây cho đến khi thạch tan hoàn toàn. Mang lọ thạch ra khỏi lò vi sóng và đợi đến khi nhiệt độ thạch bên trong lọ giảm xuống còn khoảng 50 °C.

– Cho 2,5 μl Gelred (3.2.9) vào 25 ml thạch 1,5 % (thể tích này sử dụng cho 17 giếng hoặc 25 giếng) và lắc đều nhẹ nhàng để Gelred hòa tan hoàn toàn, tránh tạo bọt khí. Sau đó đổ thạch vào khuôn đã có gắn sẵn lược, chờ khoảng 1 giờ để thạch đông.

– Khi bản thạch đã đông, nhẹ nhàng lấy lược ra và tránh làm vỡ thạch. Đặt thạch vào bồn điện di có chứa dung dịch TBE 1X, phải đảm bảo dung dịch TBE ngập khỏi bản thạch.

– Các sản phẩm PCR được pha với dung dịch loading dye 6X (3.2.10). Sau đó cho hỗn hợp này vào giếng thạch.

– Hút 7 μl thang chuẩn cho vào giếng cuối cùng.

– Đậy nắp bể điện di lại và kết nối với dòng điện, phải đảm bảo dòng điện được kết nối đúng cực. Điện di trong vòng 45 phút với hiệu điện thế 80 V đến 100 V.

– Sau khi điện di xong, tắt nguồn điện, lấy thạch ra rửa bỏ thuốc nhuộm bằng cách ngâm trong nước 45 phút và đọc kết quả bằng ánh sáng UV, chụp ảnh

 

Phụ lục E

(Quy định)

Sơ đồ chẩn đoán bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae trong phòng thí nghiệm

Hình F.1 – Sơ đồ chẩn đoán bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae trong phòng thí nghiệm bằng phương pháp nuôi cấy phân lập và định danh vi khuẩn

Hình F.2 – Sơ đồ chẩn đoán bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae trong phòng thí nghiệm bằng phương pháp Realtime PCR

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Y-L Su & J Feng & J-S Bai và A-X Li, 2016. Development of a quantitative PCR assay for monitoring Streptococcus agalactiae colonization and tissue tropism in experimentally infected tilapia. Journal of Fish Diseases 39 (2016) 229-238.

[2] ISO 20837:2006, Microbiology of food and animal feeding stuffs – Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens- Requirements for sample preparation for qualitative detection.

[3] P.J. Quinn & M.E. Carter & B. Markey & G.R. Carter. Clinical Veterinary Microbiology.

[4] Đồng Thanh Hà và ctv, 2009. Một số đặc điểm của Streptococcus agalactiae – Tác nhân gây bệnh Streptococcosis trên cá rô phi ở miền bắc Việt Nam.

[5] St. Xavier’s College, Kathmandu, Nepal, 2018. Biochemical Test and Identification of Streptococcus agalactiae. Sagar Aryal; sag.micro@gmail.com; Department of Microbiology.

1) Kít nhân gen là SYBR Green PCR không có nhiệt độ phát tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu cho vi khuẩn Streptococcus agalatiae, vì vậy cần có thêm bước điện di để kết luận.

2) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

3) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm của nhà cung cấp này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.