TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8710-2:2019 VỀ BỆNH THỦY SẢN – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 2: BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH Ở CÁ BIỂN

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8710-2:2019

BỆNH THỦY SẢN – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 2: BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH Ở CÁ BIỂN

Aquatic animal diseases – Diagnostic procedure – Part 2: Viral nervous necrosis (VNN) disease in marine fish

 

Lời nói đầu

TCVN 8710-2: 2019 thay thế TCVN 8710-02: 2011

TCVN 8710-2: 2019 được xây dựng trên cơ sở tham khảo (OIE) 2017. Manual of Diagnostic Test for Aquatic Animails. Chapter 2.3.12. Viral encephalopathy and retinopathy.

TCVN 8710-2: 2019 do Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương, Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ TCVN 8710 Bệnh thủy sản- Quy trình chẩn đoán gồm các phần sau:

– TCVN 8710-01: 2011, phần 1: Bệnh Còi do vi rút ở tôm (MBV);

– TCVN 8710-02: 2019, phần 2: Bệnh Hoại tử thần kinh ở cá biển (VNN);

– TCVN 8710-03: 2019, phần 3: Bệnh Đốm trắng ở tôm (WSSV);

– TCVN 8710-04: 2019, phần 4: Bệnh Đầu vàng ở tôm (YHV);

– TCVN 8710-05: 2011, phần 5: Bệnh Taura ở tôm He (TSV);

– TCVN 8710-06: 2019, phần 6: Bệnh do Koi herpesvirus ở cá chép (KHV);

– TCVN 8710-07: 2019, phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép (SVC);

– TCVN 8710-08: 2012, phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm (IMNV);

– TCVN 8710-09: 2012, phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm (NHB);

– TCVN 8710-10: 2015, phần 10: Bệnh do perkinsus marinus ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ;

– TCVN 8710-11: 2015, phần 11: Bệnh do perkinsus olseni ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ;

– TCVN 8710-12: 2019, phần 12: Bệnh vi bào tử do Enterocytozoon hepatopenaei ở tôm;

– TCVN 8710-13: 2015, phần 13: Bệnh gan tụy do Parvovirus ở tôm;

– TCVN 8710-14: 2015, phần 14: Hội chứng lở loét (EUS) ở cá;

– TCVN 8710-15: 2015, phần 15: Bệnh nhiễm trùng do Aeromonas ở cá;

– TCVN 8710-16:2016, phần 16: Bệnh gan thận mủ ở cá da trơn;

– TCVN 8710-17:2016, phần 17: Bệnh sữa trên tôm hùm;

– TCVN 8710-19: 2019, phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm;

– TCVN 8710-20: 2019, phần 20: Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm;

– TCVN 8710-21: 2019, phần 21: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae ở cá.

 

BỆNH THỦY SẢN – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 2: BỆNH HOẠI TỬ THẦN KINH Ở CÁ BIỂN

Aquatic animal diseases – Diagnostic procedure – Part 2: Viral nervous necrosis (VNN) disease in marine fish

CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sức khỏe thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển (VNN- Viral nervous necrosis).

2  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các thuật ngữ và định nghĩa sau:

2.1

Bệnh hoại tử thần kinh trên cá biển (Viral nervous necrosis (VNN) disease in marine fish) hay còn gọi là bệnh vi rút gây viêm não cá biển hoặc bệnh viêm não và võng mạc do vi rút (Viral encephalopathy and retinopathy).

Là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm ở nhiều loài cá biển với tổn thương chủ yếu ở não và võng mạc.

2.2

Vi rút VNN gây bệnh thuộc giống Betanodavirus họ Nodaviridae.

Betanodavirus là vi rút không có vỏ bọc, có hình cầu đường kính khoảng 25 nm, cấu trúc di truyền là ARN chuỗi đơn (+ARN). Bộ gene của vi rút gồm 2 phân tử ARN: ARN1 kích thước là 3.1 kb và ARN2 kích thước 1.4 kb.

CHÚ THÍCH: Hiện nay có 4 kiểu gen Betanodavirus gây bệnnh VNN, được phân loại thành: SJNNV (striped jack nevous necrosis virus), TPNNV (tiger puffer nervous necrosis virus), RGNNV (red-spotted grouper nervous necrosis virus) và BFNNV (barfin flounder nervous necrosis virus).

3  Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, sử dụng nước cất, nước khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ các trường hợp có quy định khác.

3.1  Thuốc thử và vật liệu thử dùng chung

3.1.1  Etanol, từ 96 % đến 100 % (thể tích).

3.1.2  Dung dịch muối đệm phosphate (PBS)

3.2 Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng RT PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction) và Realtime RT PCR.

3.2.1  Cặp mồi, gồm mồi xuôi và mồi ngược RT PCR.

3.2.2  Cặp mồi, gồm mồi xuôi và mồi ngược, Dò (Probe) Realtime RT PCR.

3.2.3  Kít tách chiết ARN (acid deoxyribo nucleic).

3.2.4  Kít nhân gen RT PCR, PCR

3.2.5  Kít nhân gen Realtime RT PCR

3.2.6  Dung dịch đệm TE (Tris-axit etylendiamintetraaxetic).

3.2.7  Thang chuẩn DNA (Ladder)

3.2.8  Nước tinh khiết, không có nuclease.

3.2.9  Kít tách chiết ARN (acid deoxyribo nucleic).

3.2.10  Agarose

3.2.11  Dung dịch đệm TAE (Tris – acetate – EDTA) hoặc TBE (Tris – brorate – EDTA) (xem A.1).

3.2.12  Chất nhuộm màu, ví dụ: Sybr safe.

3.2.13  Chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X)

3.3  Thuốc thử và vật liệu dùng cho phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng parafin

3.3.1  Formalin 10 %, được chuẩn bị từ dung dịch formaldehyde 38 % và dung dịch muối đệm phosphat (PBS) hoặc nước cất (tỷ lệ thể tích 1 : 9).

3.3.2  Xylen

3.3.3  Thuốc nhuộm Haematoxylin (xem A.2).

3.3.4  Thuốc nhuộm Eosin (xem A.3).

3.3.5  Parafin, có độ nóng chảy từ 56 °C đến 60 °C.

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học và những thiết bị, dụng cụ sau

4.1  Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp chẩn đoán bằng PCR, Realtime PCR

4.1.1  Máy nhân gen PCR.

4.1.2  Máy Realtime PCR

4.1.3  Máy ly tâm, có thể ly tâm với gia tốc 6 000 g và 20 000 g.

4.1.4  Máy lắc trộn vortex

4.1.5  Máy spindown

4.1.6  Bộ điện di, gồm bộ nguồn và bể chạy điện di.

4.1.7  Máy đọc gel

4.2  Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng parafin

4.2.1  Khuôn nhựa, loại chuyên dụng cho làm tiêu bản vi thể.

4.2.2  Máy xử lý mẫu mô tự động

4.2.3  Nồi đun parafin, có thể duy trì nhiệt độ từ 56 °C đến 65 °C.

4.2.4  Khay sắt, loại chuyên dụng cho làm tiêu bản vi thể.

4.2.5  Máy làm lạnh tiêu bản, có thể duy trì nhiệt độ từ âm 10 °C đến 4 °C.

4.2.6  Máy cắt tiêu bản, cắt ở độ mỏng từ 3 µm đến 5 µm.

4.2.7  Nồi dãn tiêu bản, có thể duy trì nhiệt độ từ 35 °C đến 65 °C.

4.2.8  Kính hiển vi quang học, vật kính 10 X, 20X, 40 X và 100 X.

4.2.9  Lamen, vô trùng.

4.2.10  Lam kính, vô trùng.

4.2.11  Bom Canada (keo gắn).

4.2.12  Bút ghi kính (ghi ký hiệu mẫu).

4.2.13  Máy sấy mẫu sau cắt

5  Chẩn đoán lâm sàng

5.1  Đặc điểm dịch tễ

Hiện nay có khoảng 50 loài cá mẫn cảm với vi rút VNN, chủ yếu là các loài chủ yếu ở cá biển như cá vược (cá chẽm), cá mú (cá song) và một số loài cá khác.

Bệnh chủ yếu ảnh hưởng đến giai đoạn ấu trùng và hậu ấu trùng nhưng tỷ lệ tử vong cao được ghi nhận ở cả thương phẩm và cá trưởng thành.

Vi rút gây bệnh VNN có thể lây truyền theo chiều ngang qua môi trường nước, từ cá thể bị bệnh sang cá thể khỏe mạnh trong cùng một môi trường sống hoặc chúng có thể lây lan qua các dụng cụ vận chuyển cá và các sản phẩm từ cá bị nhiễm vi rút từ nơi này đến nơi khác. Ngoài ra Vi rút gây bệnh có truyền theo chiều dọc từ cá thể bố mẹ nhiễm vi rút sang cá con.

Ở Việt Nam hiện nay bệnh VNN có gần như quanh năm và bùng phát mạnh từ tháng 5 đến tháng 10, đặc biệt khi mưa nhiều. Nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của bệnh là 25 °C đến 30 °C.

5.2  Triệu chứng lâm sàng

Dấu hiệu bệnh lý điển hình của cá nhiễm VNN là các biểu hiện thần kinh như: bơi lội không bình thường (bơi vòng tròn, bơi ngửa, bơi không định hướng…) bỏ ăn, da tối màu, trương bóng hơi, đầu lao xuống dưới.

Giai đoạn cấp tính thường xuất hiện tại các trại ương giống ấu trùng (từ 10 đến 25 ngày tuổi). Cá giống bỏ ăn, chết rải rác, bơi không bình thường, bơi lội mạnh không định hướng, đầu lao xuống dưới.

Cá lớn (trên 150g) bị bệnh VNN có ít triệu chứng hơn. Cá thường chuyển màu đen và bơi chậm chạp với bóng hơi trương phồng. Giải phẫu cơ quan nội tạng bình thường và ruột không có thức ăn.

Cá bệnh hoạt động yếu đầu treo trên mặt nước hoặc dưới đáy bể hoặc đáy lồng, triệu chứng tăng dần khi cả quần đàn nhiễm bệnh. Cá chết sau khoảng từ 3 đến 5 ngày sau khi có dấu hiệu bệnh.

5.3  Dấu hiệu bệnh tích

Cá chết và sắp chết hầu hết bóng hơi trương phồng, xung huyết trong.

6  Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1  Phương pháp Nested RT – PCR (Reverse transcriptase-polymerase chain reaction)

6.1.1  Lấy mẫu

Cá <1 cm: Lấy nguyên con từ 5 -10 con

Cá từ 1 đến 6 cm: Lấy phần đầu bao gồm mắt, não của 3-5 con

Cá lớn: Lấy não, mắt

Cá bố mẹ: Lấy não, mắt, Trứng, sẹ

Lượng mẫu lấy để tách chiết ARN khoảng 30 mg.

Mẫu được nghiền nhuyễn với tỷ lệ 1 thể tích mẫu trong 9 thể tích dung dịch muối đệm PBS (3.1.2), để tạo thành huyễn dịch 10 % (sử dụng cân phân tích cân trọng lượng mẫu được nghiền để điều chỉnh lượng dung dịch PBS (3.1.2) nhằm đảm bảo tạo được huyễn dịch 10%).

6.1.2  Bảo quản mẫu

Trong quá trình vận chuyển, mẫu được bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C không quá 48 h hoặc bảo quản trong etanol từ 96 % đến 100 % (3.1.1). Đối với loại mẫu dùng cho phương pháp cắt mô cần phải cố định trong dung dịch formalin 10% và không bảo quản ở nhiệt độ âm;

Mẫu chuyển đến phòng thí nghiệm nếu chưa phân tích ngay phải được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C đến âm 80 °C hoặc trong etanol từ 96 % đến 100 % (3.1.1).

6.1.3  Cách tiến hành

6.1.3.1  Tách chiết ARN

Sử dụng bộ kít tách chiết (3.2.3) thích hợp và an toàn theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Kít Invitrogen PureLink Viral RNA/DNA Mini Kit (Cat No. 69506)1) (xem phụ lục B).

6.1.3.2  Chuẩn bị mồi

Phương pháp RT PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu F2/R3 và F’2/R’3/ (3.2.1) để phát hiện vi rút VNN Trình tự cặp mồi (xem phụ lục C, Bảng C1).

Mồi được chuẩn bị như sau:

– Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.1.5) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Dùng dung dịch đệm TE (3.2.6) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM làm gốc.

– Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 µM: pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.8) (10 µl mồi gốc và 40 µl nước tinh khiết không có nuclease).

6.1.3.3  Tiến hành phản ứng Nested RT – PCR

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy nhân gen (4.1.1) theo phương pháp nested RT- PCR bao gồm 2 giai đoạn (hoặc 2 bước): Giai đoạn 1 (bước 1), thực hiện phản ứng RT – PCR sử dụng cặp mồi F2/R3 ; Giai đoạn 2 (bước 2), thực hiện phản ứng nested RT – PCR sử dụng cặp mồi F’2/R’3 (3.2.1), sử dụng kít nhân gen (3.2.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất (xem phụ lục C).

6.1.3.4  Điện di

6.1.3.4.1  Chuẩn bị bản gel

Pha thạch với nồng độ agarose (3.2.10) từ 1,5 % đến 2 % bằng dung dịch đệm TBE 1X hoặc TAE 1X (3.2.11) vào chai thủy tinh 250 ml, lắc đều rồi đun sôi;

Khi nhiệt độ giảm xuống khoảng 40 °C đến 50 °C thì bổ sung 10 µl chất nhuộm màu (3.2.12) vào mỗi 100 ml thạch. Lắc nhẹ tránh tạo bọt để chất nhuộm màu tan đều.

Tiến hành đổ thạch vào khay điện di đã được cài lược; không nên đổ bản thạch dày quá 0,8 cm.

Khi bản thạch đông lại thì tiến hành gỡ lược khỏi bản thạch.

Chuyển bản gel vào bể điện di (4.1.6), đổ dung dịch đệm (TBE 1X hoặc TAE 1X) cùng loại với dung dịch pha thạch agarose đã đun vào bể điện di cho tới khi ngập bản thạch.

CHÚ THÍCH: Có thể dùng các sản phẩm có sẵn chất nhuộm DNA để pha chế thạch agarose (ví dụ: Sybr safe DNA gel stain2) và sử dụng theo quy định của nhà sản xuất.

6.1.3.4.2  Chạy điện di

Hút 2 µl chất đệm tải mẫu (Loading dye 6X) (3.2.13) vào 8 µl sản phẩm Nested RT – PCR (bước 2) trộn đều và cho vào các giếng trên bản thạch.Thực hiện điện di trong bộ điện di (4.1.6), chạy kèm theo thang chuẩn DNA (Ladder) (3.2.7) để dự đoán kích thước sản phẩm khuếch đại. Hút 10 µl thang chuẩn DNA (Ladder) (3.2.7) vào một giếng trên bản thạch.

Điện di ở hiệu điện thế 100 V trong thời gian 30 min.

6.1.3.5  Đọc kết quả

Sau khi điện di, đọc kết quả trên máy đọc gel (4.1.7).

Điều kiện của phản ứng được công nhận khi:

– Đối chứng âm có kết quả âm tính (không có sản phẩm khuếch đại);

– Đối chứng dương có kết quả dương tính được thể hiện bằng vệt sáng rõ có kích thước 420 bp và 294 bp.

Với điều kiện phàn ứng trên

Mẫu xét nghiệm âm tính khi:

– Tại giếng của mẫu thử không xuất hiện vạch sáng (không có sản phẩm khuếch đại);

– Thang chuẩn ADN sáng và chia vạch rõ ràng.

Mẫu xét nghiệm dương tính khi:

– Tại giếng của mẫu thử có sản phẩm khuếch đại có kích thước 420 bp và 294 bp, hoặc chỉ có sản phẩm khuếch đại có kích thước 294 bp;

– Thang chuẩn ADN sáng và chia vạch rõ ràng.

CHÚ THÍCH: Trong trường hợp mẫu dương tính yếu, có thể chỉ phát hiện được sản phẩm của bước hai 294 bp.

6.2  Phương pháp Realtime RT – PCR

6.2.1  Lấy mẫu (Theo 6.1.1)

6.2.2  Bảo quản mẫu (Theo 6.1.2)

6.2.3  Cách tiến hành

6.2.3.1  Tách chiết ARN (Xem mục 6.1.3.1)

6.2.3.2  Chuẩn bị mồi

Phương pháp Realtime PCR sử dụng cặp mồi RNA 2 FOR/ RNA 2 REV và RNA2 probe (3.2.2) để phát hiện vi rút VNN. Trình tự cặp mồi (xem phụ lục D, Bảng D.1).

Mồi được chuẩn bị như sau:

– Mồi ở trạng thái đông khô phải được ly tâm nhanh bằng máy spindown (4.1.5) trong 30 s để mồi lắng xuống đáy ống trước khi mở và hoàn nguyên. Khi hoàn nguyên, nên dùng dung dịch đệm TE (3.2.6) để hoàn nguyên mồi ở nồng độ 100 µM làm gốc.

– Mồi được sử dụng ở nồng độ 20 µM: pha loãng mồi gốc bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.8) (10 µl mồi gốc và 40 µl nước tinh khiết không có nuclease).

– Đoạn dò ARN2 Probe sử dụng ở nồng độ 10 pM: pha loãng đoạn dò bằng nước tinh khiết không có nuclease (3.2.8) (5 µl mồi gốc và 45 µl nước tinh khiết không có nuclease)

6.2.3.3  Tiến hành phản ứng Realtime RT- PCR

Phản ứng khuếch đại được thực hiện trong máy Realtime RT PCR (4.1.2) theo phương pháp Realtime RT PCR khuếch đại đoạn gen đặc hiệu của vi rút VNN sử dụng cặp mồi đặc hiệu RNA 2 FOR / RNA 2 REV (3.2.2), sử dụng kít nhân gen (3.2.5) theo hướng dẫn của nhà sản xuất (xem phụ lục D).

6.2.4.4  Đọc kết quả

Điều kiện phản ứng được công nhận khi:

– Mẫu đối chứng âm phải cho kết quả âm tính (không có giá trị Ct);

– Mẫu đối chứng dương phải cho kết quả dương tính và có giá trị Ct so với giá trị Ct của mẫu đã được chuẩn độ trước đó có khoảng giá trị Ct dao động ±2.

Với điều kiện phản ứng như trên:

– Mẫu có giá trị Ct < 35 được xem là dương tính;

– Mẫu không có giá trị Ct là âm tính;

– Mẫu có giá trị Ct trong khoảng 35 ≤ Ct ≤ 40 được xem là nghi ngờ.

CHÚ Ý:

– Những mẫu nghi ngờ, cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm tương đương khác để khẳng định kết quả.

– Phản ứng realtime RT- PCR phải bao gồm: mẫu kiểm tra, mẫu kiểm chứng dương và mẫu kiểm chứng âm;

– Mẫu và nguyên liệu cho phản ứng realtime RT-PCR cần đặt trong khay đá lạnh trong suốt quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng.

6.3  Phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp nhuộm HE

6.3.1  Lấy mẫu

– Cá <1cm: Lấy nguyên con từ 5 -10 con

– Cá từ 1 đến 6 cm: Lấy phần đầu bao gồm mắt, não của 3-5 con

– Cá lớn, Cá bố mẹ: Lấy não, mắt.

6.3.2  Bảo quản mẫu

Mẫu được bảo quản trong dung dịch formalin 10% (bổ sung 2% muối) (với tỷ lệ tối thiểu là 1 : 10).

6.3.3  Chuẩn bị mẫu

– Đối với cá nhỏ lấy nguyên con, đối với cá lớn lấy phần đầu hoặc não, mắt cắt thành những lát mỏng (0,5 cm) trước khi ngâm trong dung dịch cố định Formalin 10% ở nhiệt độ phòng. Tỷ lệ mẫu và dung dịch cố định là 1/10.

Phải dùng các dụng cụ vô trùng khi lấy mô ở các mẫu khác nhau để tránh lây nhiễm.

CHÚ Ý: Không dùng cá chết hoặc cá bảo quản đá để cắt mô.

Mẫu cố định trong formalin 10 % (3.3.1) khoảng từ 24 h đến 72 h tùy thuộc vào kích thước mẫu;

Sau đó chuyển sang cồn 70 %.

Lấy miếng tổ chức cố định trong formalin ra, cắt miếng nhỏ dày khoảng 1 mm, dài khoảng 1 cm cho vào khuôn nhựa (4.2.1).

6.3.4  Cách tiến hành

Tiến hành xử lý mẫu, cắt tiêu bản và nhuộm tiêu bản tiêu bản Haematoxylin và Eosin theo hướng dẫn (xem phụ lục E)

6.3.5  Đọc kết quả

Soi tiêu bản từ độ phóng đại thấp đến độ phóng đại cao

Tổ chức não và mắt của cá bị bệnh xuất hiện nhiều không bào màu trắng và xám có đường kính từ 5 µm đến 10 µm. Trong mô não và mắt cá cũng tồn tại hiện tượng hoại tử, sự xâm nhập của các tế tào máu vào các vùng bị hoại tử

CHÚ Ý: Phương pháp chẩn đoán bằng mô bệnh học chỉ mang tính chất định hướng trong chẩn đoán bệnh VNN

7  Kết luận

Cá được xác định nhiễm bệnh VNN khi có những đặc điểm dịch tễ, triệu chứng lâm sàng đặc trưng của bệnh VNN và:

– Có kết quả dương tính với VNN bằng phương pháp Nested RT – PCR, hoặc:

– Có kết quả dương tính với VNN bằng phương pháp Realtime RT – PCR.

 

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị thuốc thử

A.1  Dung dịch đệm TAE hoặc TBE

A.1.1  Thành phần

Dung dịch TAE (hoặc TBE) 10X:                      100 ml

Nước khử ion:                                                 900 ml

Tổng:                                                              1000 ml dung dịch TAE (TBE) 1X

A.1.2  Chuẩn bị

Lấy 100 ml dung dịch TAE (TBE) 10X hòa chung với 900 ml nước khử ion, khuấy và lắc đều.

Bảo quản ở nhiệt độ phòng.

A.2  Thuốc nhuộm Hematoxylin (dung dịch Hematoxylin – Mayer)

A.2.1  Thành phần

Hematoxylin dạng tinh thể:                               4 g

Natri iodat:                                                      0,8 g

Amoni alum sulphate [NH₄Al(SO₄)2]:                100 g

(hoặc Postasium alum sulphate [KAI(SO₄)₂])

Axit citric:                                                        4 g

Cloral hydrat:                                                  200 g

Nước:                                                             2000 ml

A.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan Hematoxylin trong nước, sau đó cho natri iodat và amoni nhôm sulfat hoặc kali nhôm sulfat, hòa tan, tiếp tục cho axit citric và chloral hydrat rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã pha trong chai tối màu.

A.3  Thuốc nhuộm Eosin

A.3.1  Thành phần

Eosin Y:                                                          10 g

Etanol 70 %:                                                   1 lít

Axit axetic:                                                      5 ml

A.3.2  Chuẩn bị

Thêm từ 2 giọt đến 3 giọt axit axetic vào etanol 70 %. Hòa tan eosin trong etanol, sau đó thêm axit axetic rồi lọc qua giấy lọc.

Bảo quản dung dịch đã chuẩn bị trong chai tối màu.

A.4  Dung dịch muối đệm phosphat (PBS)

A.4.1  Thành phần

Natri clorua (NaCl)                                                 8 g

Natri hydro photphat dihydrat (Na₂HPO₄.2H₂O)       2,9 g

Kali dihydro photphat (KH₂PO₄)                              0,2 g

Kali clorua (KCl)                                                    0,2 g

Nước cất                                                              1000 ml

A.4.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên vào 1000ml nước cất, khuấy và lắc đều.

Chỉnh pH bằng dung dịch NaOH 1N hoặc dung dịch HCl 1N. Hấp vô trùng ở 121 °C trong 30 min.

 

Phụ lục B

(Tham khảo)

Quy trình tách chiết ARN

CẢNH BÁO: Việc tách chiết ADN có sử dụng hóa chất nguy hiểm và có khả năng gây hại nếu thao tác không cẩn thận. Do vậy, nên tránh tiếp xúc trực tiếp với da và hít phải hơi của các hóa chất này. Luôn luôn đeo găng tay, khẩu trang, mặc quần áo bảo hộ khi thực hiện các thao tác này.

B.1  Chuẩn bị hóa chất

VÍ DỤ: Bộ kít Invitrogen PureLink Viral RNA/DNAMini Kit, Cat. No: 12280-050.

Các hóa chất cần được chuẩn bị và bảo quản theo đúng hướng dẫn của bộ kít Invitrogen PureLink Viral RNA/DNA Mini Kit, với thể tích vừa đủ cho số lượng mẫu chiết tách, bao gồm:

– Proteinase K

– Dung dich đệm Lysis Buffer

– Dung dịch Carrier ARN

– Dung dịch Wash buffer (W5)

– Nước RNAse-free (E3)

– Cách pha hỗn hợp dung dịch Carrier và Lysis Buffer

N x 0,21 mL = A mL

A mL x 28 µL/mL = B µL

Trong đó: N là số mẫu cần tách chiết

A là tổng số mL Lysis Buffer cần cho N mẫu;

B là tổng số µL Carrier ARN cần cho N mẫu.

B.2  Tiến hành

– Cho 25 µL Proteinase K vào ống eppendorf 1,5 ml;

– Cho 200 µL mẫu vào ống eppendorf chứa Proteinase K;

(Nếu thể tích mẫu < 200 µL thì có thể điều chỉnh thể tích mẫu cho đủ 200 µL bằng dung dịch PBS hoặc 0.9% NaCl).

– Cho hỗn hợp dung dịch Lysis Buffer và Carrier ARN vào ống chứa mẫu; đóng nắp ống và vortex 15s;

– Ủ mẫu ở 56 °C trong 15 min;

– Cho thêm 250 µL cồn 96 – 100 % vào ống mẫu; đóng nắp và vortex 15s;

– Để ở nhiệt độ phòng 5 min;

(Mẫu mô sau khi để ở nhiệt độ phòng 5 min thì đem ly tâm 12.000 vòng trong 2 min và lấy dịch nổi bên trên).

– Chuyển toàn bộ mẫu tách chiết vào cột lọc;

– Ly tâm cột lọc ở 12.000 vòng trong 2 đến 3 min; chuyển cột lọc sang ống thu mới;

– Cho 500 µL nước rửa Wash buffer (W5) vào cột lọc; ly tâm 12.000 vòng trong 2 đến 3 min; Chuyển cột lọc sang ống thu mới;

– Lặp lại bước 9 với 500 µL nước rửa Wash buffer (W5) một lần nữa;

– Loại bỏ ống thu và chuyển cột lọc sang ống thu mới;

– Ly tâm khô 12000v trong 1 min cho khô sạch nước rửa W5;

– Chuyển cột lọc sang ống eppendorf 1,5 µL;

– Cho 10 – 50 µL nước ARNse-free (E3) (có sẵn trong bộ kít) vào cột lọc;

– Để ở nhiệt độ phòng 1 min; Ly tâm cột lọc ở 12.000 vòng trong 1 đến 2 min. Lấy sản phẩm dưới cột lọc;

– Bảo quản ARN ở nhiệt độ âm 80° C.

CHÚ Ý: Mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương đều được tách chiết ARN trong cùng thời điểm với mẫu cần phát hiện vi rút gây bệnh VNN.

 

Phụ lục C

(Quy định)

Phương pháp Nested RT – PCR phát hiện VNN

C.1  Trình tự cặp mồi

Bảng C.1 – Trình tự cặp mồi^[7]

Tên mồi	Trình tự cặp mồi	Kích thước sản phẩm, bp
F2	5′-CGT-GTC-AGT-CAT-GTG-TCG-CT-3′	420
R3	5′-CGA-GTC-AAC-ACG-GGT-GAA-GA-3′
F’2	5′-GTT-CCC-TGT-ACA-ACG-ATT-CC-3′	294
R’3	5′-GGA-TTT-GAC-GGG-GCT-GCT-CA-3′

C.2  Thực hiện phản ứng Nested RT – PCR

Kỹ thuật nested RT- PCR bao gồm 2 giai đoạn (hoặc 2 bước):

Giai đoạn 1 (bước 1): Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi F2/R3 đã được chuẩn bị (3.2.1) và kít nhân gen (3.2.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Thành phần cho 1 phản ứng (xem bảng C.2).

VÍ DỤ: Kit nhân gen SuperScript” III One-Step RT-PCR with Platinum” Taq. Cat: 12574-0263)

Bảng C.2 – Thành phần phản ứng RT – PCR

Thành phần	Nồng độ (µM)	Thể tích cho 1 phản ứng (µl)
Nước không có ARN/DNA		7,5
Dung dịch 2x Reaction Mix		12,5
Mồi F2	20	1
Mồi R3	20	1
Enzyme Tag Mix		0,5
Tổng thể tích dung dịch đệm thực hiện phản ứng		22,5

Chuyển 22,5 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

Mẫu đối chứng dương: Cho 2,5 µl mẫu ARN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng VNN chuẩn.

Mẫu đối chứng âm: Cho 2,5 µl nước tinh khiết không có nuclease.

Mẫu thử: Cho 2,5 µl mẫu ARN kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng PCR bằng máy nhân gen (4.1.1) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng C.3).

Bảng C.3 – Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ^[7]

Nhiệt độ (°C)	Thời gian	Số chu kỳ
50	15 min	1
94	2 min
94	15 s	35
55	30 s
68	60s
68	5 min	1

Sau đó, lấy sản phẩm bước 1 ra để chuẩn bị cho phản ứng bước 2 – Nested RT – PCR

Giai đoạn 2 (bước 2): Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi F’2/R’3 đã được chuẩn bị (3.2.1) và kít nhân gen (3.2.4) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Kit nhân gen của Thermo Scientific Dream Tag PCR Master Mix (2X) Cat K0171)4)

Thành phần cho 1 phản ứng bước 2 (xem Bảng C.4).

Bảng C.4 – Thành phần phản ứng Nested RT – PCR

Thành phần	Nồng độ (µM)	Thể tích cho 1 phản ứng (µl)
Nước không có ARN/DNA		7,5
Dung dịch Master Mix		12,5
Mồi F’2	20	1
Mồi R’3	20	1
Tổng thể tích thực hiện 1 phản ứng		22

Chuyển 22 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

Mẫu đối chứng dương: Cho 3 µl sản phẩm bước 1 vào ống phản ứng mới.

Mẫu đối chứng âm: Cho 3 µl sản phẩm bước 1 vào ống phản ứng mới.

Mẫu thử: Cho 3 µl mẫu sản phẩm bước 1 vào ống phản ứng mới

Tiến hành phản ứng Nested RT-PCR bằng máy nhân gen (4.1.1) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng C.5).

Bảng C.5 – Chu trình nhiệt của phản ứng Nested RT – PCR bước 2 ^[7]

Nhiệt độ (°C)	Thời gian	Số chu kỳ
95	2 min	1
95	40 s	25
55	40 s
72	60 s
72	10 min	1

Sau khi kết thúc chu trình nhiệt của phản ứng Nested RT – PCR tiến hành điện di theo mục (6.1.3.4)

 

Phụ lục D

(Quy định)

Phương pháp Realtime RT- PCR phát hiện VNN

D.1  Trình tự cặp mồi

Bảng D.1 – Trình tự cặp mồi ^[7]

Tên mồi và đoạn dò	Trình tự	Kích thước sản phẩm, bp
RNA 2 FOR	5’-CAA-CTG-ACA-RCG-AHC-ACA-C – 3’	69
RNA 2 REV	5’-CCC-ACC-AYT-TGG-CVA-C – 3’
RNA 2 probe	5’- TYC-ARG-CRA-CTC-GTG-GTG-CVG*- 3’

D.2  Thực hiện phản ứng Realtime RT -PCR

Chuẩn bị dung dịch cho phản ứng sử dụng cặp mồi đặc hiệu RNA 2 FOR / RNA 2 REV (3.2.2) đã được chuẩn bị sử dụng kít nhân gen (3.2.5) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

VÍ DỤ: Kit nhân gen Invitrogen superscript III qRT-PCR kit Cat.No: 11732-0885)

Thành phần cho 1 phản ứng (xem Bảng D.2):

Bảng D.2 – Thành phần phản ứng Realtime RT- PCR

Thành phần	Nồng độ (µM)	Thể tích cho 1 phản ứng (µl)
Nước không có ARN/ADN		5,5
Dung dịch 2X reaction mix		12,5
Mồi RNA 2 FOR	20	0,5
Mồi RNA 2 REV	20	0,5
Đoạn dò RNA 2 probe	10	0,5
Enzym		0,5
Tổng thể tích dung dịch đệm thực hiện phản ứng		20

Chuyển 20 µl hỗn hợp nhân gen vào mỗi ống phản ứng:

– Mẫu kiểm chứng dương: Cho 5 µl mẫu ARN đã được giám định hoặc sử dụng các chủng VNN chuẩn.

– Mẫu kiểm chứng âm: Cho 5 µl nước tinh khiết không có nuclease.

– Mẫu thử: Cho 5 µl mẫu ARN kiểm tra vào ống phản ứng.

Tiến hành phản ứng Realtime RT- PCR bằng máy Realtime PCR (4.1.2) đã cài đặt chu trình nhiệt (xem Bảng D.3).

Bảng D.3 – Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime RT- PCR

Nhiệt độ (°C)	Thời gian	Số chu kỳ
50	15 min	01
95	2 min	01
95	15 s	40
60 (*)	30 s

CHÚ THÍCH BẢNG: (*) Nhiệt độ và thời gian này phù hợp với máy Realtime PCR ABI 7500

 

Phụ lục E

(Tham khảo)

Phương pháp kiểm tra bệnh tích vi thể bằng phương pháp nhuộm HE

E.1  Xử lý mẫu

Chuyển khuôn chứa mẫu sang ngâm etanol 70 % (thể tích) (3.1.1) trong thời gian từ 30 đến 60 min;

Ngâm sang etanol 90 % (3.1.1) trong thời gian từ 30 đến 60 min;

Ngâm sang etanol 100 % (3.1.1) lần thứ nhất trong thời gian từ 30 đến 60 min;

Ngâm sang etanol 100 % (3.1.1) lần thứ hai trong thời gian từ 30 đến 60 min;

Ngâm sang xylen (3.3.2) lần thứ nhất trong thời gian từ 30 đến 60 min;

Ngâm sang xylen (3.3.2) lần thứ hai trong thời gian từ 30 đến 90 min;

Ngâm tẩm parafin (3.3.5) lần thứ nhất trong thời gian từ 30 đến 90 min;

Ngâm tẩm parafin (3.3.5) lần thứ hai, thời gian 120 min;

CHÚ THÍCH: Tất cả các thao tác trên có thể được thực hiện trong máy xử lý mẫu mô tự động (4.2.2).

Đúc khuôn:

Sau đó, đưa mẫu vào khung đúc parafin: rót parafin nóng chảy từ nồi đun parafin (4.2.3) vào khay sắt (4.2.4) chuyên dụng;

Gắp bệnh phẩm vào rồi đặt khuôn nhựa (4.2.1) lên trên;

Để nguội, tách lấy khối parafin.

E.2  Cắt tiêu bản

Cắt gọt khối parafin cho bằng phẳng, đặt trên mặt máy làm lạnh (4.2.5);

Đặt khối parafin lên máy cắt tiêu bản (4.2.6) sao cho mặt khối parafin song song với mép lưỡi dao, cắt bỏ những lát đầu đến khi lát cắt có đủ các tổ chức;

Cắt lấy tiêu bản, độ dày lát cắt từ 3 µm đến 5 µm;

Chọn lát cắt tiêu bản phẳng và lấy được hết các mô cần lấy, thả vào nồi dãn tiêu bản (4.2.7) có nhiệt độ nước từ 35 °C đến 40 °C;

Dùng lam kính (4.2.10) vớt dán lát cắt, chuyển sang máy sấy mẫu (4.2.13) có nhiệt độ 40°C trong 2 đến 3h.

E.3  Nhuộm tiêu bản Haematoxylin và Eosin

Tẩy parafin trong xylen (3.3.2) 2 lần (2 cốc), mỗi lần để từ 3 min đến 5 min;

Ngâm trong etanol 100 % (3.1.1) 2 lần (2 cốc), mỗi lần để từ 3 min đến 5 min;

Ngâm trong etanol 90 % (3.1.1) để từ 3 min đến 5 min;

Ngâm trong etanol 70 % (3.1.1) để từ 3 min đến 5 min;

Rửa dưới vòi nước chảy từ 3 min đến 5 min;

Ngâm trong thuốc nhuộm haematoxylin (3.3.3) từ 3 min đến 5 min;

Rửa dưới vòi nước chảy từ 3 min đến 5 min;

Ngâm trong thuốc nhuộm từ Eosin (3.3.4) từ 3 min đến 5 min;

Loại bỏ nước còn bám trên phiến kính bằng cách:

Nhúng qua etanol 70 % (3.1.1) để từ 2 đến 3 min; sau đó nhúng qua etanol 100 % (3.1.1) 3 lần (3 cốc), mỗi lần để từ 2 đến 3 min; chuyển sang ngâm trong xylen (3.3.2) 2 lần (2 cốc), mỗi lần từ 2 min đến 3 min; Lau sạch xung quanh và gắn lamen (4.2.9) bằng keo dán.

Để khô tự nhiên và soi dưới kính hiển vi quang học (4.2.8).

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội, Bệnh học Thủy sản, 2004, trang 112-116.

[2] Danayadol, Y, Direkbusarakom, S. and Supamattaya, K, 1995. Viral nervous necrosis in brownspotted grouper, Epinephelus malabaricus, cultured in Thailand. In: Diseases in Asian Aquaculture II, M. Shariff.

[3] TCVN 8710-02: 2011 Quy trình chẩn đoán bệnh hoại tử thần kinh trên cá biển (VNN).

[4] TCVN 1-2: 2008 Xây dựng tiêu chuẩn – Phần 2: Quy định về trình bày và thể hiện nội dung tiêu chuẩn quốc gia.

[5] Mori, K., Mangyoku, T, Iwamoto, T, Arimoto, M, Tanaka, S, Nakai, T, 2003. Serological relationships among genotypic variants of Betanodavirus. Diseases of Aquatic Organisms. 57: p. 19-26.

[6] Munday, B.L., Kwang, J., Moody, N., 2002. Betanodavirus infections of teleost fish: a review. Journal of Fish Diseases, 25: 127-142.

[7] Oie. 2017. Manual of Diagnostic Test for Aquatic Animails.Chapter 2.3.12. Viral encephalopathy and retinopathy.

[8] Johansen, R., Grove, S., Svendsen, A.K., Modahl, l., Dannevig, B.H, A., 2004. Sequential study of pathological findings in Alantic halibut, Hippoglossus hippoglossus (L), throughout one year after an acute outbreak of viral encephalopathy and retinopathy. Journal of Fish Diseases. 27: p. 327-341.

[9] Tanaka, S., Takagi, M., Miyazaki, T.,2004. Histopathological studies on viral nervous necrosis of sevenband grouper, Epinephelus septemfasciatus Thunburg, at the grow-out stage. Journal of Fish Diseases. 27: p. 385-399.

[10] FAO/NACA. 2001 Bệnh viêm não và võng mạc do Virus (VER). Hướng dẫn chuẩn đoán bệnh động vật thủy sản Châu Á- – tài liệu kỹ thuật Thủy sản FAO 402/2.

1) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

2) Sản phẩm do hãng Invitrogen cung cấp. Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

3) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

4) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.

5) Thông tin này đưa ra tạo điều kiện thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định sử dụng sản phẩm này. Có thể sử dụng các sản phẩm tương tự nếu cho các kết quả tương đương.