TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8710-6:2019 VỀ BỆNH THỦY SẢN – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 6: BỆNH DO KOI HERPESVIRUS Ở CÁ CHÉP

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8710-6: 2019

BỆNH THỦY SẢN – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 6: BỆNH DO KOI HERPESVIRUS Ở CÁ CHÉP

Aquatic Animal disease – Diagnostic procedure – Part 6: Koi Herpesvirus Disease

Lời nói đầu

TCVN 8710-6:2019 thay thế TCVN 8710-6:2012.

TCVN 8710-6:2019 do Chi cục Thú y Vùng VI – Cục Thú y biên soạn trên cơ sở tham khảo tài liệu của Tổ chức Thú y Thế Giới (OIE) và các bài báo khoa học quốc tế, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Bộ TCVN 8710 Bệnh thủy sản – Quy trình chẩn đoán gồm các phần sau:

– TCVN 8710-1: 2011, phần 1: Bệnh còi do vi rút ở tôm (MBV);

– TCVN 8710-2: 2011, phần 2: Bệnh hoại tử thần kinh ở cá biển (VNN);

– TCVN 8710-3: 2011, phần 3: Bệnh đốm trắng ở tôm (WSSV);

– TCVN 8710-4: 2011, phần 4: Bệnh đầu vàng ở tôm (YHV);

– TCVN 8710-5: 2011, phần 5: Bệnh Taura ở tôm he (TSV);

– TCVN 8710-6: 2019, phần 6: Bệnh do Koi herpesvirus ở cá chép (KHV);

– TCVN 8710-7: 2012, phần 7: Bệnh xuất huyết mùa xuân ở cá chép (SVC);

– TCVN 8710-8: 2012, phần 8: Bệnh hoại tử cơ ở tôm (IMNV);

– TCVN 8710-9: 2012, phần 9: Bệnh hoại tử gan tụy ở tôm (NHB);

– TCVN 8710-10: 2015, phần 10: Bệnh do perkinsus marinus ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ;

– TCVN 8710-11: 2015, phần 11: Bệnh do perkinsus olseni ở nhuyễn thể hai mảnh vỏ;

– TCVN 8710-12: 2015, phần 12: Bệnh do vi bào tử ở tôm;

– TCVN 8710-13: 2015, phần 13: Bệnh do vi rút HPV ở tôm;

– TCVN 8710-14: 2015, phần 14: Bệnh EUS ở cá;

– TCVN 8710-15: 2015, phần 15: Bệnh do Aeromonas ở cá;

– TCVN 8710-16: 2016, phần 16: Bệnh gan thận mủ ở cá da trơn;

– TCVN 8710-17: 2016, phần 17: Bệnh sữa trên tôm hùm.

– TCVN 8710-19: 2019, phần 19: Bệnh hoại tử gan tụy cấp tính ở tôm;

– TCVN 8710-20: 2019, phần 20: Bệnh hoại tử dưới vỏ và cơ quan tạo máu ở tôm;

– TCVN 8710-21: 2019, phần 21: Bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae ở cá.

 

BỆNH THỦY SẢN – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 6: BỆNH DO KOI HERPESVIRUS Ở CÁ CHÉP

Aquatic Animal disease – Diagnostic procedure – Part 6: Koi Herpesvirus Disease

CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn sinh học thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh do Koi Herpesvirus ở cá chép.

2  Thuật ngữ và định nghĩa, các từ viết tắt

2.1  Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

Bệnh do Koi Herpesvirus ở cá chép (KHV) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm do Cyprinid herpesvirus 3 (CyHV-3). KHV (CyHV-3) thuộc giống Herpesvirus, họ Herpesviridae.

CHÚ THÍCH:

1) KHV còn có tên gọi là vi rút gây viêm thận và hoại tử mang ở cá chép (carp interstitial nephritis and gill necrosis virus – CNGV), vi rút có nhân là ADN mạch đôi.

2) Ngoài CyHV-3, herpesvirus còn có hai loại vi rút CyHV-1 và CyHV-2 cũng gây bệnh ở cá chép: CyHV-1 (vi rút đậu ở cá chép (carp pox virus) hay vi rút ung thư mụn sần ở cá (fish papilloma virus)) và CyHV-2 (vi rút gây hoại tử hệ thống tạo huyết ở cá vàng (goldfish haematopoietic necrosis). Các phân tích về di truyền đã cho thấy KHV có mối tương quan gần với CyHV-1 và CyHV-2, có liên quan xa với vi rút gây bệnh ở cá da trơn nước ngọt (lctalurid herpesvirus: lcHV-1) và herpesvirus gây bệnh ở ếch (RaHV-1). Hiện nay, có ba chủng vi rút được nghiên cứu và mô tả: KHV phân lập từ Israel, Mỹ và Nhật Bản. Kết quả giải mã di truyền gen của ba chủng vi rút này cho thấy sự tương đồng về kiểu gen rất cao (trên 99%), các chủng KHV được phân lập từ Israel và Mỹ có sự tương đồng cao hơn so với chủng vi rút được phân lập từ Nhật Bản. Ba chủng vi rút này được giải thích chúng có cùng nguồn gốc và được sinh ra từ hai nhánh (lineage): Nhật Bản và Israel – Mỹ.

2.2  Từ viết tắt

– ADN: Axít deoxyribonucleic;

– ssADN (single-straind AND): ADN sợi đơn;

– DNase (Deoxyribonuclease): enzyme thủy phân liên kết của phân tử ADN;

– ARN: Axít ribonucleic;

– RNase (Ribonuclease): enzyme thủy phân liên kết của phân tử ARN;

– KHV (Koi Herpesvirus): Vi rút gây bệnh ở cá chép koi;

– PCR (Polymerase Chain Reaction): Phản ứng chuỗi trùng hợp;

– Realtime PCR (Realtime – Polymerase Chain Reaction): phản ứng chuỗi trùng hợp thời gian thực;

– PBS (Phosphate buffered saline): Dung dịch muối đệm phốt phát;

– TBE 10X (Tris-axit boric- Ethylendiamin Tetraacetic axit): Dung dịch đệm TBE đậm đặc 10 lần;

– Ct (cycle threshold): giá trị chu kỳ ngưỡng;

– UV (Ultraviolet): Cực tím.

3  Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và chỉ sử dụng nước cất hai lần đã khử ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương không có DNAse và RNAse, trừ khi có quy định khác.

3.1  Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho lấy mẫu

3.1.1  Cồn (Ethanol), từ 70% đến 100%;

3.1.2  Dung dịch muối đệm phốt phát (PBS), pH 7,2 ± 0,2 (xem Phụ lục A);

3.2  Thuốc thử và vật liệu thử dùng cho PCR, realtime PCR;

3.2.1  Kít chiết tách ADN/ARN vi rút;

3.2.2  Kít nhân gen PCR, realtime PCR;

3.2.3  Nước tinh khiết, không có DNAse và RNAse.

3.2.4  Bột agarose, dung dịch TBE 10X;

3.2.5  Chất nhuộm gel (ví dụ: GelRed hoặc chất nhuộm gel tương đương);

3.2.6  Dung dịch nạp mẫu (Loading dye);

3.2.7  Thang chuẩn ADN;

3.2.8  Đoạn mồi (primers): thực hiện phản ứng PCR;

3.2.9  Đoạn mồi (primers) và đoạn dò (probe): thực hiện phản ứng realtime PCR;

3.2.10  Mẫu đối chứng: Mẫu đối chứng dương là mẫu có chứa ADN của vi rút KHV được chiết tách từ mẫu dương chuẩn. Mẫu đối chứng âm là mẫu nước không có DNAse và RNAse dùng để pha loãng các chất phản ứng.

4  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm sinh học thông thường và cụ thể như sau:

4.1  Thiết bị, dụng cụ sử dụng chung

4.1.1  Tủ lạnh: tủ lạnh thường (từ 0 °C đến 8 °C), tủ lạnh âm sâu (từ âm 20 °C đến âm 80 °C);

4.1.2  Buồng cấy an toàn sinh học cấp 2;

4.1.3  Máy lắc trộn vortex, có thể hoạt động với tốc độ từ 200 g đến 2500 g;

4.1.4  Máy nghiền mẫu hoặc cối, chày sứ, kéo, panh kẹp, vô trùng;

4.1.5  Dụng cụ tiêu hao như: găng tay, khẩu trang, bảo hộ cá nhân.

4.2  Thiết bị, dụng cụ cho phương pháp PCR, realtime PCR

4.2.1  Máy nhân gen (PCR, realtime PCR);

4.2.2  Máy ly tâm, có thể thực hiện ở 1500 g đến 2500 g, 10000 g và 12000 g;

4.2.3  Máy lắc ủ nhiệt;

4.2.4  Máy spindown, máy ly tâm lắng;

4.2.5  Máy chiết tách ADN/ARN tự động (nếu có);

4.2.6  Bộ điện di: khay đổ thạch, bể điện di, máy đọc và chụp ảnh gel.

Ngoài ra, còn có các loại đầu tip, pipet, ống nghiệm, đĩa petri và các vật tư tiêu hao phù hợp cho quá trình thực hiện các biện pháp kỹ thuật trong tiêu chuẩn này.

5  Chẩn đoán lâm sàng

5.1  Dịch tễ học

Đặc điểm phân bố: Bệnh do KHV là bệnh truyền nhiễm, gây ra ở cá chép nuôi và cá chép cảnh như: Cyprinus carpio, C. carpio koi, C. carpio goi và các dòng cá chép lai. Bệnh đã được ghi nhận ở ít nhất 28 quốc gia. Tại Châu Âu, bệnh được báo cáo ở Romania, Slovenia, Tây Ban Nha và Thụy Điển. Tại Châu Á, như Trung Quốc (Hồng Kông), Đài Loan, Indonesia, Nhật Bản, Hàn Quốc, Malaysia, Singapore và Thái Lan. Bệnh cũng được báo cáo ở Nam Phi, Canada và Mỹ. Sự lưu hành của vi rút có thể còn ở nhiều quốc gia khác, tuy nhiên chưa có báo cáo rõ ràng.

Giai đoạn mẫn cảm: cá có thể nhiễm bệnh ở tất cả các giai đoạn, tuy nhiên cá giống từ 2,5 g đến 6 g dễ nhiễm hơn cá lớn trên 230 g.

Tỉ lệ mắc bệnh và tỉ lệ chết: Tỷ lệ mắc bệnh có thể lên đến 100 % trong quần thể và tỷ lệ chết từ 70 % đến 80 %, nhưng có thể gia tăng trên 90 %. Cá bị bệnh do KHV rất dễ bị nhiễm các tác nhân thứ cấp khác như ngoại ký sinh trùng: Argulus sp., Chilodonella sp., Cryptobia sp., Dactylogyrus sp., Gyrodactylus sp., Ichthyobodo sp., Ichthyophthirius sp., Trichodina sp., Flavobacterium columnare; vi khuẩn: Aeromonas sp., Pseudomonas sp.; nấm Achlya sp. Bệnh có liên quan đến nhiệt độ nước, xảy ra từ 16 °C đến 29 °C. Trong điều kiện thí nghiệm, tỷ lệ chết giảm ở nhiệt độ dưới 16 °C hoặc nhiệt độ trên 30 °C.

Phương thức truyền lây: Vi rút KHV truyền lây theo chiều ngang, bệnh lây lan từ cá bệnh sang cá khỏe, từ môi trường nước và từ các vật chủ trung gian. Vi rút xâm nhập qua da, mang, đến các cơ quan nội tạng (thận, gan, lách và mô ruột), đồng thời gây ra các tổn thương tại các cơ quan này: sau đó, vi rút tấn công vào nhân, tế bào chất của tế bào vật chủ. KHV có khả năng tồn tại trong môi trường nước ít nhất 4 giờ.

5.2  Triệu chứng lâm sàng

Dấu hiệu đầu tiên cá ngạt thở, giảm ăn, bơi gần tầng mặt, mang và da có màu sắc nhợt nhạt, mất nhớt và có thể bị hoại tử, xuất huyết tơ mang, mắt lõm xuống.

Dấu hiệu bệnh tích bên trong: Gan và thận có thể sưng to hơn bình thường, màu sắc của các cơ quan nội tạng bất thường (nhạt hơn hay đậm hơn), đồng thời có thể xuất hiện các điểm xuất huyết.

Trong trường hợp cấp tính: cá chết rất nhanh mà không thể hiện dấu hiệu tổn thương cơ quan nội tạng.

Cơ quan đích của vi rút KHV bao gồm: mang, gan, thận, lách, ruột và máu.

6  Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

6.1  Lấy mẫu và xử lý mẫu bệnh phẩm

6.1.1  Lấy mẫu

– Cá có kích thước nhỏ hơn 4 cm: Lấy cả con từ 5 con đến 10 con;

– Cá có kích thước từ 4 cm đến 6 cm: Lấy mang và toàn bộ phủ tạng từ 5 con đến 10 con;

– Cá có kích thước trên 6 cm: Lấy mang, thận và lách từ 5 con.

CHÚ THÍCH: Khi xét nghiệm cá nhiễm bệnh cận lâm sàng, có biểu hiện khỏe mạnh, ngoài các mẫu mang, thận, lách cần thu thập thêm mẫu ruột và não. Trong trường hợp thực hiện chương trình giám sát bệnh do KHV. Cá được lưu giữ ở nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của KHV (nhiệt độ trên 17 °C) trong khoảng thời gian 3 tuần. Sau đó, thu mẫu cá đối với những cá có dấu hiệu bệnh hoặc xuất hiện những dấu hiệu bất thường, để kiểm tra sự hiện diện của KHV.

Mẫu được bảo quản trong túi nilon hoặc lọ đựng bệnh phẩm vô trùng, tất cả được đặt trong thùng bảo ôn và vận chuyển trong điều kiện lạnh từ 2 °C đến 8 °C. Mẫu bệnh phẩm gửi đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ sau khi lấy, kèm theo phiếu gửi bệnh phẩm, nếu quá thời gian đó, bệnh phẩm phải được bảo quản ở nhiệt độ đông băng từ âm 20 °C đến âm 80 °C, hoặc có thể bảo quản mẫu trong cồn từ 96 % đến 100 % theo tỉ lệ mẫu: cồn (1:10).

6.1.2  Xử lý mẫu bệnh phẩm

Tạo huyễn dịch 10% từ mẫu bệnh phẩm nghiền (4.1.4) trong dung dịch PBS (3.1.2) vô trùng (ví dụ: nghiền 1 g mẫu bệnh phẩm trong 9 ml dung dịch PBS (3.1.2)). Sau đó ly tâm 2500 g trong 15 phút bằng máy ly tâm (4.2.2). Thu dịch nổi để chẩn đoán phát hiện vi rút KHV bằng realtime PCR và PCR.

6.2  Phát hiện vi rút KHV

6.2.1  Phương pháp PCR

6.2.1.1  Chiết tách ADN

Sau khi xử lý mẫu (7.1.2), tiến hành chiết tách ADN. Ví dụ sử dụng kít chiết tách InviMAG Virus DNA/RNA Mini Kit/ KF96 1), hoặc có thể sử dụng các loại kít chiết tách tương đương, phù hợp cho chiết tách ADN vi rút (tham khảo Phụ lục B).

Sau khi chiết tách, ADN được bảo quản ở 4 °C nếu xét nghiệm ngay, hoặc bảo quản âm 20 °C chờ đến khi xét nghiệm.

6.2.1.2  Tiến hành phản ứng

Các bước tiến hành phản ứng tham khảo Phụ lục C.

Phản ứng PCR phát hiện vi rút KHV sử dụng cặp mồi của Bercovier TK. Chuẩn bị các mồi ở nồng độ 20 μM với nước sạch DNAse/RNAse (4.2.3).

Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và cài đặt chu trình nhiệt chạy phản ứng PCR theo hướng dẫn của bộ kít sử dụng. Ví dụ sử dụng bộ kít Master mix HotstarTaq®Master Mix 2), Catalogue Number: 203445 của hãng Qiagen.

Thực hiện điện di sản phẩm: Sau khi khi kết thúc chương trình chạy máy PCR, lấy các ống chứa sản phẩm khuếch đại ra khỏi máy và giữ ở 4 °C để chuẩn bị cho quá trình điện di.

6.2.1.3  Đọc kết quả

– Điều kiện phản ứng được công nhận khi: Kết quả của mẫu đối chứng dương KHV có kết quả dương tính (sản phẩm khuếch đại: 409 bp). Mẫu đối chứng âm phải cho kết quả âm tính (không có sản phẩm khuếch đại). 

– Đánh giá kết quả của mẫu xét nghiệm: Mẫu dương tính là mẫu được phát hiện đồng thời với đối chứng dương (có sản phẩm khuếch đại: 409 bp). Mẫu âm tính là mẫu không có sản phẩm khếch đại tương đồng với mẫu đối chứng âm.

6.2.2  Phương pháp realtime PCR

6.2.2.1  Chiết tách ADN

Xem 6.2.1.1.

6.2.2.2  Tiến hành phản ứng

Các bước tiến hành tham khảo Phụ lục D.

Phản ứng realtime PCR phát hiện vi rút KHV sử dụng mồi xuôi KHV 86f, mồi ngược KHV 163R và đoạn dò Taqman Probe KHV-109p (theo Gilad, 2004).

Chuẩn bị các mồi ở nồng độ 20 μM và đoạn dò ở nồng độ 6 μM với nước tinh khiết không có DNAse/RNAse (4.2.3).

Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng và cài đặt chu trình nhiệt chạy phản ứng realtime PCR phát hiện vi rút KHV theo hướng dẫn của bộ kít được sử dụng. Ví dụ sử dụng bộ kít Master mix Platinum® Quantitative PCR SuperMix- UDG 3), Cat. No.: 11730-017 của hãng Invitrogen.

6.2.2.3  Đọc kết quả

Điều kiện phản ứng được công nhận: Mẫu đối chứng âm phải cho kết quả âm tính (không có giá trị Ct). Mẫu đối chứng dương phải cho kết quả dương tính và có giá trị Ct dao động trong khoảng ± 2 Ct của mẫu đã được chuẩn độ trước đó.

Với điều kiện như trên, mẫu có giá trị Ct < 37 được coi là dương tính. Mẫu không có giá trị Ct là âm tính. Mẫu có giá trị 37 ≤ Ct ≤ 45 được coi là nghi ngờ.

Với những mẫu nghi ngờ cần được thực hiện lại xét nghiệm hoặc sử dụng phương pháp xét nghiệm khác để khẳng định kết quả.

7. Kết luận

Cá được xác định là mắc bệnh do Koi Herpesvirus (KHV) gây ra khi đồng thời: Cá thể hiện dấu hiệu bệnh lý điển hình hoặc chết cấp tính và mẫu xét nghiệm có kết quả dương tính với PCR hoặc realtime PCR.

 

Phụ lục A

(Quy định)

Thành phần và chuẩn bị dung dịch thuốc thử

A  Dung dịch muối đệm phốt phát pH ~ 7,2 (PBS).

A.1  Thành phần

Natri clorua (NaCl)	8g
Kali clorua (KCl)	0,2 g
Natri hydrophosphat (Na2HPO4)	1,15 g
Kali dihydrophosphat (KH2PO4)	0,2 g
Nước cất	1000 ml

A.2  Cách chuẩn bị

Hòa tan natri clorua, kali clorua, natri hydrophosphat và kali dihydrophosphat trong 1000 ml nước cất. Chỉnh pH trong khoảng 7,2 ± 0,2. Hấp 121 °C trong thời gian 15 phút, chia nhỏ và bảo quản ở 4 °C trong khoảng 3 tháng.

GHI CHÚ: Có thể sử dụng PBS thương mại và chuẩn bị theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

 

Phụ lục B

(Tham khảo)

Quy trình chiết tách ADN/ARN

Sử dụng kít chiết tách ADN/ARN. Hiện nay có rất nhiều các loại kít chiết tách khác nhau được cung cấp trên thị trường. Do đó, tùy thuộc vào điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm để lựa chọn bộ kít phù hợp. Nếu sử dụng kít chiết tách InviMAG Virus DNA/RNA Mini Kit/KF96, Cat. No: 7441050100 bằng máy Thermo Scientific KingFisher KF 96 thì các bước được thực hiện như sau:

B.1  Chuẩn bị

– Dung dịch đệm Lysis Buffer RV: Cho thêm Proteinase K và Carrier RNA vào dung dịch đệm Lysis theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Dung dịch này được bảo quản ở nhiệt độ phòng 15 °C đến 30 °C.

– Dung dịch hạt từ (Bead Mix): Cho dung dịch MAP vào dung dịch Binding theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

– Dung dịch rửa 1 (Washing Wash 1), dung dịch rửa 2 (Washing Wash 2): Cho thêm ethanol 100 % vào dung dịch theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

– Dung dịch Elution Buffer: dung dịch thu hồi ADN/ARN sau khi tách chiết được sử dụng trực tiếp từ ống gốc của bộ kít.

B.2  Tiến hành chiết tách mẫu tự động bằng máy Thermo Scientific KingFisher KF

– Hút 200 μl dung dịch đệm Lysis Buffer cho vào ống eppendorf 1,5 ml vô trùng có ghi sẵn ký hiệu mẫu.

– Giải đông, vortex huyễn dịch 10 % mẫu đã chuẩn bị ở mục 7.1.2. Sau đó tiến hành ly tâm 2500 g trong 15 phút. Hút 200 μl dịch trong bên trên vào ống Lysis buffer và trộn đều.

– Ly tâm lắng (5.2.4) để kéo các phần bám trên nắp ống eppendorf xuống.

– Đặt ống eppendorf lên máy lắc ủ nhiệt (5.2.3), lắc với vận tốc 750 g trong 15 phút ở nhiệt độ 65 °C.

– Lấy các ống eppendorf ra khỏi máy lắc ủ nhiệt (5.2.3) và sắp xếp thứ tự trên khay.

– Chuẩn bị các đĩa 96 giếng sâu và đĩa 96 thu hồi ADN/ARN của kít

– Hút dung dịch mẫu sau khi lắc nhiệt vào đĩa 96 giếng sâu thứ 1 theo sơ đồ mẫu. Đĩa 96 giếng sâu thứ 2: mỗi giếng 800 μl dung dịch Washing Wash 1, Đĩa 96 giếng sâu thứ 3 và 4: mỗi giếng 800 μl dung dịch Washing Wash 2, đĩa 96 giếng thu hồi ADN/ARN cho vào 100 μl dung dịch Elution Buffer.

– Sau đó cho thêm vào đĩa 96 giếng sâu thứ 1 (giếng chứa hỗn hợp mẫu và dung dịch đệm Lysis Buffer) 420 μl dung dịch hạt từ.

– Chọn chương trình máy chiết tách theo hướng dẫn của nhà sản xuất để gắn các đĩa mẫu và dung dịch chiết tách vào bên trong máy chiết tách.

– Vận hành máy theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

– Sau khi chiết tách ADN/ARN đã hoàn tất. Lấy đĩa thu ADN/ARN ra khỏi máy và đặt vào tủ an toàn sinh học cấp 2.

– Hút toàn bộ dung dịch trong giếng đĩa thu ADN/ARN cho vào ống thu hồi 500 μl vô trùng đã ghi sẵn ký hiệu mẫu chiết tách tương ứng.

– Mẫu ADN/ARN được bảo quản ở 4°C để sẵn sàng thực hiện phản ứng realtime PCR/PCR. Trong trường hợp mẫu ADN/ARN chưa thực hiện phản ứng realtime PCR/ PCR thì mẫu cần được lưu trữ ở nhiệt độ âm 20 °C hoặc âm 80°C.

 

Phụ lục C

(Tham khảo)

Phát hiện vi rút KHV bằng phương pháp PCR

C.1  Trình tự mồi

Sử dụng cặp mồi đặc hiệu phát hiện gen của vi rút KHV theo Bercovier TK (OIE, 2017)

Bảng C.1 – Trình tự mồi

Mồi	Trình tự (5′ – 3′)	Kích thước sản phẩm bp
Mồi xuôi	GGG-TT A-CTG-TAC-GAG	409
Mồi ngược	CAC-CCA-GTA-GAT-TAT-GC

C.2  Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt

– Pha hỗn hợp nhân gen (master mix) theo hướng dẫn của nhà sản xuất bộ kít nhân gen PCR. Ví dụ sử dụng bộ kít Master mix HotstarTaq®Master Mix, Catalogue Number: 203445 của hãng Qiagen (thành phần bao gồm: HotStarTaq ADN Polymerase, PCR Buffer (với 3 mM MgCl2) và 400 μM dNTP).

– Tổng thể tích của phản ứng PCR là 25 μl (20 μl hỗn hợp Master mix và 5 μl mẫu ADN):

+ Cho 20 μl hỗn hợp Master mix vào ống PCR 0,2 ml.

+ Cho 5 μl ADN vừa tách chiết vào ống PCR 0,2 ml đã chứa sẵn 20 μl hỗn hợp Master mix.

LƯU Ý: Để kiểm soát phản ứng PCR, mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương được thực hiện song song cùng với mẫu kiểm tra.

+ Mẫu đối chứng âm: Cho 5 μl nước tinh khiết không có DNAse/RNAse vào ống PCR đã chứa sẵn 20 μl hỗn hợp Master mix.

+ Mẫu đối chứng dương: Cho 5 μl ADN dương chuẩn của vi rút KHV (mẫu ADN hỗn hợp được chuẩn bị từ mẫu dương chuẩn của vi rút KHV) vào ống PCR đã chứa sẵn 20 μl hỗn hợp Master mix.

+ Đặt ống PCR (hỗn hợp Master mix và mẫu ADN) vào máy PCR và tiến hành cài đặt chu trình nhiệt thực hiện phản ứng PCR.

Bảng C.2 – Thành phần phản ứng PCR

Thành phần	Nồng độ μM	Thể tích cho 01 phản ứng μl
Nước không có DNAse/RNAse		6,5
Mồi xuôi	10	0,5
Mồi ngược	10	0,5
Dung dịch HotStarTaq Master Mix		12,5
Mẫu đã chiết tách (ADN)		5
Tổng thể tích		25

Bảng C.3 – Chu trình nhiệt

Nhiệt độ °C	Thời gian	Số chu kỳ
95 (*)	15 phút (*)	01
94	30 giây
55	30 giây	35
72	30 giây
72	7 phút	01
Giữ ở 4 °C
CHÚ THÍCH: Nhiệt độ và thời gian (*) chỉ phù hợp với kít HotstarTag®Master Mix, Cat. No.: 203445 (Qiagen).

C.3  Điện di sản phẩm PCR

– Chuẩn bị thạch Agarose (3.2.4) 1,5 % pha trong dung dịch TBE (3.2.4) 0,5X bổ sung chất nhuộm gel (3.2.5) (ví dụ như: gel red) với tỷ lệ theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

– Đổ thạch vào khuôn điện di (có lược).

– Thạch khô, rút lược ra và cho thạch vào bể điện di có chứa dung dịch TBE 1X. 

– Cho mẫu vào các giếng (10 μl sản phẩm PCR + 2 μl dung dịch dung dịch nạp mẫu (3.2.6)).

– Sử dụng thang chuẩn ADN (100 bp) (3.2.7).

LƯU Ý: Khi chạy điện di sản phẩm PCR phải có mẫu đối chứng dương và đối chứng âm.

– Đậy nắp bể điện di lại và kết nối với dòng điện, phải đảm bảo dòng điện được kết nối đúng cực. Điện di trong vòng 45 phút với hiệu điện thế 80 V – 100 V.

– Sau khi điện di xong, tắt nguồn điện, lấy thạch ra rửa nước trong 5 phút và đọc kết quả bằng ánh sáng UV thích hợp, chụp ảnh.

 

Phụ lục D

(Tham khảo)

Phát hiện vi rút KHV bằng phương pháp realtime PCR

D.1  Trình tự cặp mồi, đoạn dò

Bảng D.1 – Trình tự cặp mồi, đoạn dò

Mồi và đoạn dò	Trình tự (5′ – 3′)	Kích thước sản phẩm khuếch đại bp
Mồi xuôi: KHV 86f	GAC-GCC-GGA-GAC-CTT-GTG	78
Mồi ngược: KHV 163R	CGG-GTT-CTT-ATT-TTT-GTC-CTT-GTT
Đoạn dò: KHV-109p	6FAM CTT-CCT-CTG-CTC-GGC-GAG-CAC-G TAMRA

D.2  Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt

– Sử dụng cặp mồi, đoạn dò đã chuẩn bị và bộ kít thương mại theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. Ví dụ sử dụng bộ kít Master mix Platinum® Quantitative PCR SuperMix – UDG, Cat. No.: 11730-017 của hãng Invitrogen (thành phần bao gồm: Taq ADN polymerase, Tris-HCl, KCl, 6 mM MgCl2,400 μM dGTP, 400 μM dATP, 400 μM dCTP, 800 μM dUTP, uracil ADN glycosylase (UDG)).

– Pha hỗn hợp nhân gen (Master mix) theo hướng dẫn của bộ kít.

– Sau khi chuẩn bị xong hỗn hợp Master mix tiến hành:

+ Cho 20 μl hỗn hợp Master mix vào ống PCR 0,2 ml;

+ Cho 5 μl ADN vừa tách chiết vào ống PCR 0,2 ml đã chứa sẵn 20 μl hỗn hợp Master mix;

LƯU Ý: Để kiểm soát phản ứng PCR, mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương được thực hiện song song cùng với mẫu kiểm tra.

+ Mẫu đối chứng âm: Cho 5 μl nước tinh khiết không có DNAse/RNAse vào ống PCR đã chứa sẵn 20 μl hỗn hợp Master mix.

+ Mẫu đối chứng dương: Cho 5 μl ADN dương chuẩn của vi rút KHV (mẫu ADN hỗn hợp được chuẩn bị từ mẫu dương chuẩn của vi rút KHV) vào ống PCR đã chứa sẵn 20 μl hỗn hợp Master mix.

+ Đặt ống PCR (20 μl hỗn hợp Master mix và 5 μl) vào máy realtime PCR và tiến hành cài đặt chu trình nhiệt thực hiện phản ứng realtime PCR.

Bảng D.2 – Thành phần phản ứng realtime PCR

Thành phần nguyên liệu	Nồng độ μM	Thể tích cho 01 phản ứng μl
Nước không có DNAse/RNAse		6,0
Mồi xuôi: KHV-86f	20	0,5
Mồi ngược: KHV-163R	20	0,5
Đoạn dò: KHV-109p	6	0,5
Dung dịch SuperMix		12,5
Mẫu đã chiết tách (ADN)		5
Tổng thể tích		25

Bảng D.3 – Chu trình nhiệt của phản ứng realtime PCR

Nhiệt độ °C	Thời gian	Số chu kỳ
50 (*)	2 phút (*)	1
95 (*)	2 phút (*)	1
95	15 giây	45
58	40 giây (Ghi nhận tín hiệu quang)
72	10 giây
CHÚ THÍCH: Nhiệt độ và thời gian (*) chỉ phù hợp với kít PlatinumQuantitative PCR SuperMix-UDG, Cat. No.: 11730-017.

 

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCVN 8710-6: 2012: Bệnh Thủy sản – Quy trình chẩn đoán – Phần 6: Bệnh do Koi Herpesvirus ở cá chép.

[2] RAHO6_V615-32: 2017. Quy trình phát hiện Koi Herpesvirus (KHV) bằng kỹ thuật Realtime PCR.

[3] OIE (Office International des Epizooties), 2017. Koi Herpesvirus Disease. Chapter 2.3.7. Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals.

[4] Oren Gilad, Susan Yun, Francisco J. Zagmutt-Vergara, Christian M. Leutenegger, Herve Bercovier, Ronald P. Hedrick, 2004. Concentrations of a Koi herpesvirus (KHV) in tissues of experimentally infected Cyprinus carpio koi as assessed by real-time TaqMan PCR. Diseases of aquatic organisms. 60: 179-187.