TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8902:2011 (EN 1138:1994) VỀ NƯỚC RAU QUẢ – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT L-MALIC (L-MALAT) BẰNG ENZYM – PHƯƠNG PHÁP ĐO PHỔ NADH

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8902:2011

EN 1138:1994

NƯỚC RAU QUẢ – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT L-MALIC (L-MALAT) BẰNG ENZYM – PHƯƠNG PHÁP ĐO PHỔ NADH

Fruit and vegetable juices – Enzymatic determination of L-malic acid (L-malate) content – NADH spectrometric method

Lời nói đầu

TCVN 8902:2011 hoàn toàn tương đương với EN 1138:1994;

TCVN 8902:2011 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F10 Rau quả và sản phẩm rau quả biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

NƯỚC RAU QUẢ – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT L-MALIC (L-MALAT) BẰNG ENZYM – PHƯƠNG PHÁP ĐO PHỔ NADH

Fruit and vegetable juices – Enzymatic determination of L-malic acid (L-malate) content – NADH spectrometric method

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp enzym để xác định hàm lượng axit L-malic tổng số trong nước rau quả và các sản phẩm có liên quan, ở dạng axit tự do hoặc dạng muối.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987) Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kĩ thuật và phương pháp thử.

ISO 5725:1986*) Precision of test methods – Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests (Độ chụm của phương pháp thử – Xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp thử bằng thử nghiệm liên phòng).

3. Kí hiệu và chữ viết tắt

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các kí hiệu và chữ viết tắt sau:

NAD     β-Nicotinamit-adenin-dinucleotit;

NADH   β-Nicotinamit-adenin-dinucleotit, dạng khử;

GOT     Glutamat-oxaloaxetat-transaminaza (EC1) 2.6.1.1);

L-MDH L-malat dehydrogenaza (EC1) 1.1.1.37);

IU         1 đơn vị quốc tế (IU) hoạt độ enzym xúc tác chuyển đổi được 1 µmol cơ chất mỗi phút ở 25 ^oC trong điều kiện chuẩn;

c          Nồng độ chất;

ρ          Nồng độ khối lượng.

4. Nguyên tắc

Phương pháp này dựa trên sự chuyển hóa L-malat thành oxaloaxetat bằng enzym và đo phổ nicotinamit adenin dinucleotit ở pH 10,0 (phản ứng 1):

(1) L-malat + NAD +  oxaloaxetat + NADH + H⁺

Điểm cân bằng của phản ứng (1) nằm gần như hoàn toàn theo chiều L-malat. Tuy nhiên, bằng cách cho oxaloaxetat tham gia phản ứng (2) với enzym GOT làm xúc tác trong sự có mặt của L-glutamat, điểm cân bằng có thể thay đổi theo chiều tạo ra oxaloaxetat và NADH:

(2) Oxaloaxetat + L-glutamat  L-aspartat + 2-oxoglutarat

Lượng NADH tạo thành được đo bởi độ tăng độ hấp thụ, tương đương với lượng axit L-malic.

5. Thuốc thử

5.1. Yêu cầu chung

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước loại 3 nêu trong TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987).

5.2. Đệm glyxylglyxin, pH 10,0

Hòa tan 4,75 g glyxylglyxin và 0,88 g L-glutamic trong 50 ml nước, chỉnh đến pH 10,0 bằng khoảng 4,6 ml dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = 10 mol/l, và thêm nước đến 60 ml. Dung dịch đã pha bền được ít nhất 3 tháng ở 4 ^oC.

5.3. Dung dịch NAD

Hòa tan 420 mg NAD trong 12 ml nước. Dung dịch đã pha bền được ít nhất bốn tuần ở 4 ^oC.

5.4. Huyền phù enzym GOT

Glutamat-oxaloaxetat transaminaza, ρ(GOT) = 2 mg/ml, huyền phù trong dung dịch amoni sulfat, c((NH₄)₂SO₄) = 3,2 mol/l. Huyền phù này có hoạt độ enzym khoảng 400 IU/ml với cơ chất L-aspartat và 2-oxoglutarat. Huyền phù đã pha bền được ít nhất một năm ở 4 ^oC.

5.5. Huyền phù enzym L-MDH

L-malat dehydrogenaza, 1(L-MDH) = 5 mg/ml huyền phù trong dung dịch amoni sulfat, c((NH4)2SO4) = 3,2 mol/l. Huyền phù này có hoạt độ enzym khoảng 6000 IU/ml với cơ chất oxaloaxetat. Huyền phù đã pha bền được ít nhất một năm ở 4 ^oC.

6. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

6.1. Pipet dùng để thử nghiệm enzym, có chia vạch dọc thân pipet và đầu tip phân phối dài, không chia vạch.

6.2. Pipet, có độ chính xác tương đương với 6.1 (thay thế cho 6.1), ví dụ có thể thay đổi dung tích pipet.

6.3. Cuvet, làm bằng thủy tinh hoặc bằng nhựa, có chiều dài đường quang 10 mm và có độ hấp thụ không đáng kể ở các bước sóng 334 nm, 340 nm hoặc 365 nm.

6.4. Máy đo quang đơn phổ, có đèn thủy ngân và màng lọc đo được ở các bước sóng 334 nm hoặc 365 nm.

6.5. Máy đo quang phổ, (bước sóng có thể thay đổi) để đo ở 340 nm (thay thế cho 6.4).

7. Cách tiến hành

7.1. Chuẩn bị mẫu thử

Đối với các sản phẩm thông thường, không xử lí trước và việc phân tích theo phương pháp này phải thực hiện dựa vào đơn vị thể tích, kết quả được biểu thị theo lít mẫu thử. Việc phân tích các sản phẩm cô đặc có thể cũng được thực hiện dựa theo thể tích sau khi pha loãng đến tỉ trọng tương đối đã biết. Trong trường hợp này, phải đưa ra được tỉ trọng tương đối. Dựa trên lượng mẫu đã cân và đưa hệ số pha loãng khi phân tích vào phép tính, kết quả có thể được biểu thị theo kilogam sản phẩm. Đối với các sản phẩm có độ nhớt cao và/hoặc có hàm lượng tế bào rất cao (ví dụ thịt quả), việc xác định dựa trên lượng mẫu thử đã cân theo quy trình thông thường.

Trộn kĩ các mẫu dạng đục trước khi pha loãng; các mẫu này cũng như các mẫu có màu rất đậm có thể cần phải được pha loãng tiếp theo để có hàm lượng malat yêu cầu. Các mẫu dạng đục chứa nồng độ axit malic rất nhỏ được làm trong bằng cách li tâm trước.

Pha loãng mẫu để kiểm tra sao cho nồng độ axit L-malic trong khoảng từ 0,02 g/l đến 0,35 g/l. Dung dịch này thường được sử dụng ngay cho phép xác định, kể cả nó có màu đậm.

7.2. Tiến hành thử

7.2.1. Yêu cầu chung

Phép xác định phải thực hiện trong điều kiện nhiệt độ không đổi, khoảng từ 20 ^oC đến 25 ^oC. Có thể sử dụng nhiệt độ không đổi trong khoảng từ 25 ^oC đến 37 ^oC, miễn là thu được các kết quả tương đương.

NADH có độ hấp thụ cực đại tại bước sóng 340 nm. Khi sử dụng máy đo phổ thay đổi được bước sóng, chỉ đo tại bước sóng hấp thụ cực đại. Khi sử dụng máy đo quang vạch đơn dùng đèn hơi thủy ngân, đo tại bước sóng 334 nm hoặc 365 nm.

Không sử dụng pipet một vạch để hút dung dịch. Các dung dịch enzym, coenzym và đệm có thể được lấy bằng pipet tự động thích hợp. Pipet dùng để thử nghiệm enzym (6.1) hoặc dụng cụ tương đương (6.2) phải được sử dụng để lấy dung dịch mẫu thử.

Trong phép xác định này có thể sử dụng bộ kit thử phức hợp có bán sẵn trên thị trường.

Nếu chất cần xác định có sẵn ở dạng tinh khiết thích hợp, thì có thể dùng để pha dung dịch chuẩn.

7.2.2. Dung dịch mẫu trắng

Dùng pipet lấy 1,00 ml dung dịch đệm (5.2), 0,20 ml dung dịch NAD (5.3), 1,50 ml nước và 0,01 ml huyền phù enzym GOT (5.4) cho vào cuvet. Trộn và đọc độ hấp thụ (A₁)_{Mẫu trắng} của dung dịch so với không khí (không có cuvet trên đường quang) sau khoảng 3 min.

7.2.3. Dung dịch mẫu thử

Dùng pipet lấy 1,00 ml dung dịch đệm (5.2), 0,20 ml dung dịch NAD (5.3), 1,40 ml nước, 0,01 ml huyền phù enzym GOT (5.4) và 0,1 ml mẫu thử cho vào cuvet. Trộn và đọc độ hấp thụ (A1)_Mẫu của dung dịch so với không khí (không có cuvet trên đường quang) sau khoảng 3 min.

Nếu nồng độ axit L-malic trong dung dịch mẫu thử nhỏ hơn 0,02 g/l, thì thể tích mẫu thử có thể được tăng lên đến 1,50 ml tương ứng với việc giảm lượng nước thêm vào, sao cho tổng thể tích không đổi (2,71 ml).

7.2.4. Phản ứng enzym và định lượng

Thực hiện phản ứng bằng cách thêm 0,01 ml huyền phù enzym L-MDH (5.5) vào từng dung dịch 7.2.2 và 7.2.3. Trộn, và sau khi phản ứng xảy ra hoàn toàn (khoảng 5 min đến 10 min) thì đọc độ hấp thụ (A₂) của các dung dịch. Đọc độ hấp thụ sau 2 min để kiểm tra phản ứng đã kết thúc hoàn toàn chưa.

8. Tính kết quả

Tùy theo phản ứng, tính hàm lượng NADH tạo thành (và chênh lệch độ hấp thụ, ΔA) tỉ lệ tuyến tính với nồng độ axit malic.

ΔA = (A₂ – A₁)_Mẫu – (A₂ – A₁)_{Mẫu trắng}

Việc tính nồng độ của một chất trong dung dịch pha loãng bằng cách đo độ hấp thụ dựa trên định luật Beer-Lambert.

Hàm lượng axit L-malic, ρ, tính bằng gam trên lít mẫu thử (g/l) được tính theo công thức sau:

trong đó:

M         là khối lượng phân tử của axit L-malic, M = 134,09 g/mol;

V₁         là tổng thể tích của dung dịch trong cuvet, tính bằng mililit (ml);

V₂         là thể tích của dung dịch mẫu thử lấy vào cuvet, tính bằng mililit (ml);

F          là hệ số pha loãng dung dịch mẫu thử;

δ          là chiều dài đường quang của cuvet, tính bằng centimet (cm);

ε           là hệ số hấp thụ của NADH;

tại bước sóng 340 nm, ε = 6,3 [l × mmol^– 1 × cm^{– 1}];

tại bước sóng 365 nm, ε = 3,4 [l × mmol^{– 1} × cm^{– 1}];

tại bước sóng 334 nm, ε = 6,18 [l × mmol^– 1 × cm^{– 1}].

Nếu không thay đổi thể tích trong 7.2.3 thì tính nồng độ như sau:

Khi sử dụng bộ kit thử phức hợp có bán sẵn trên thị trường, thì hệ số 3,647 của công thức nêu trên sẽ thay đổi phụ thuộc vào tổng thể tích thử nghiệm.

Trong phần tính kết quả, cần tính đến hệ số pha loãng và mối tương quan giữa giá trị với thể tích hoặc khối lượng. Nếu sản phẩm cô đặc đã được pha loãng đến nồng độ đơn thì ghi lại tỉ trọng tương đối của mẫu nồng độ đơn.

Ghi lại nồng độ axit L-malic tính bằng gam trên lít đến hai chữ số thập phân.

9. Độ chụm

Chi tiết về phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được đưa ra trong Phụ lục A. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và chất nền khác với dải nồng độ và chất nền nêu trong Phụ lục A.

9.1. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp vượt quá giá trị độ lặp lại r.

Giá trị độ lặp lại:

r = 0,014 + 0,030 ρ (g/l)

trong đó: ρ là hàm lượng đo được, tính theo giá trị trung bình của hai kết quả thử riêng rẽ.

9.2. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành thử trên vật liệu giống thử hệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 5 % các trường hợp vượt quá giá trị độ tái lập R.

Giá trị độ tái lập:

R = 0,032 + 0,070 ρ (g/l)

trong đó: ρ là hàm lượng đo được, tính theo giá trị trung bình của hai kết quả thử riêng rẽ.

10. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

– mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử (loại mẫu, nguồn gốc của mẫu, tên gọi);

– viện dẫn tiêu chuẩn này;

– ngày và phương pháp lấy mẫu, nếu biết;

– ngày nhận mẫu;

– ngày thử nghiệm;

– kết quả thử và đơn vị biểu thị kết quả;

– độ lặp lại, nếu được kiểm tra;

– bất kỳ điểm ngoại lệ nào quan sát được trong khi thực hiện phép thử;

– mọi thao tác không quy định trong phương pháp hoặc tùy chọn mà có thể ảnh hưởng đến kết quả.

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

Kết quả thống kê phép thử liên phòng thử nghiệm

Theo ISO 5725:1986, các thông số sau đây đã được xác định trong một phép thử liên phòng thử nghiệm (xem Thư mục tài liệu tham khảo). Phép thử được tiến hành bởi Viện Max von Pettenkofer (Max von Pettenkofer Institute) thuộc Cơ quan Y tế liên bang (Federal Health Office), Food Chemistry Department, Berlin, BRD.

Năm tiến hành thử nghiệm:                    1983

Số lượng phòng thử nghiệm tham gia:   24

Số lượng mẫu thử:                                4

Bảng A.1

Mẫu	A	B	C	D
Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ Số lượng ngoại lệ (phòng thử nghiệm) Số lượng kết quả được chấp nhận	22 2 110	20 4 99	21 3 104	23 1 119
Giá trị trung bình () (g/l)	1,26	2,54	7,22	8,92
Độ lệch chuẩn lặp lại (sr) (g/l) Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (RSDr) (%)	0,0232 3,36	0,0284 1,12	0,065 0,90	0,114 1,28
Giới hạn lặp lại (r) (g/l)	0,06	0,08	0,18	0,32
Độ lệch chuẩn tái lập (sR) (g/l) Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (RSDR) (%)	0,0486 3,86	0,0675 2,66	0,187 2,60	0,235 2,63
Giới hạn tái lập (R) (g/l)	0,14	0,19	0,52	0,66

CHÚ THÍCH: Giữa r, R và  có mối quan hệ tuyến tính.

Tên mẫu:

A – nước cam,

B – dung dịch chuẩn,

C – nước táo,

D – nectar anh đào.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Untersuchung von Lebensmitteln: Bestimmung von L-Äpfelsäure (L-malat) in Fruchtsäften: L31.00-15, 1984-11 [Food Analysis ; Determination of citric acid (citrate) in fruit juices: L31.00-15, 1984-11] – In: Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG: Vetfahren zur Probenahme und Untersuchung von Lebensmitteln, Thbakerzeugnissen, kosmetischen Mitteln und Bedarfsffegenständen/ Bundesgesundheitsamt [In: Collection of official methods under article 35 of the German Federal Foods Act: Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods/ Federal Health Office] – Loseblattausgabe, Stand 31.12.1991, Bd.l. [Loose-leaf edition, as of 1991-12-31, Vol.1.] – Berlin, Köln: Beuth Verlag GmbH.

[2] Determination of L-malic acid: Enzymatic method: No 21, 1989.

– In: Analyses[Collection]/International Federation of Fruit Juice Producers.

– Loose-leaf edition, as of 1989. – Zug: Swiss Fruit Union.