TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8904:2011 (EN 12631:1999) VỀ NƯỚC RAU QUẢ – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT D- VÀ L-LACTIC (LACTAT) BẰNG ENZYM – PHƯƠNG PHÁP ĐO PHỔ NAD

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8904:2011

EN 12631:1999

NƯỚC RAU QUẢ – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT D- VÀ L-LACTIC (LACTAT) BẰNG ENZYM – PHƯƠNG PHÁP ĐO PHỔ NAD

Fruit and vegetable juices – Enzymatic determination of D- and L-lactic acid (lactate) content – NAD spectrometric method

Lời nói đầu

TCVN 8904:2011 hoàn toàn tương đương với EN 12631:1999;

TCVN 8904:2011 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F10 Rau quả và sản phẩm rau quả biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

NƯỚC RAU QUẢ – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT D- VÀ L-LACTIC (LACTAT) BẰNG ENZYM – PHƯƠNG PHÁP ĐO PHỔ NAD

Fruit and vegetable juices – Enzymatic determination of D- and L-lactic acid (lactate) content – NAD spectrometric method

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp enzym để xác định hàm lượng tổng số của axit D- và L-lactic cùng các muối lactat trong nước rau quả và các sản phẩm có liên quan.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kĩ thuật và phương pháp thử.

3. Kí hiệu và chữ viết tắt

3.1. Kí hiệu

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các kí hiệu sau:

c          nồng độ chất;

ρ          nồng độ khối lượng;

φ          phần thể tích;

g          gia tốc trọng trường trên bề mặt trái đất (9,81 m/s2).

3.2. Chữ viết tắt

Trong tiêu chuẩn này sử dụng các chữ viết tắt sau:

GPT                  Glutamat-pyruvat-transaminaza;

L-LDH               L-lactat dehydrogenaza; D-LDH D-lactat dehydrogenaza;

NAD                 β-Nicotinamit-adenin-dinucleotit;

NADH               β-Nicotinamit-adenin-dinucleotit, dạng khử;

IU                     1 đơn vị quốc tế (IU) hoạt độ enzym xúc tác chuyển đổi được 1 µmol cơ chất mỗi phút ở 25 ^oC trong điều kiện chuẩn.

4. Nguyên tắc

Axit L-lactic (lactat) bị oxy hóa bởi nicotinamit-adenin-dinucleotit (NAD) trong sự có mặt của L-lactat dehydrogenaza (L-LDH), tạo thành pyruvat. Axit D-lactic (lactat) bị oxy hóa theo cách tương tự khi có mặt D-lactat dehydrogenaza (D-LDH).

L-lactat + NAD+  pyruvat + NADH + H⁺                      (1)

D-lactat + NAD+  pyruvat + NADH + H⁺                     (2)

Điểm cân bằng của phản ứng (1) và (2) nằm gần như hoàn toàn về phía lactat. Tuy nhiên, bằng cách cho pyruvat tham gia phản ứng với enzym glutamat-pyruvat-transaminaza (GPT) làm xúc tác khi có mặt L-glutamat (phản ứng 3), thì điểm cân bằng có thể thay đổi theo chiều tạo ra pyruvat và NADH:

Pyruvat + L-glutamat  L-alanin + α-xetoglutarat                          (3)

Lượng NADH tạo thành (đo được do độ tăng độ hấp thụ ở các bước sóng 334 nm, 340 nm hoặc 365 nm) tương đương với lượng axit D- và L-lactic có trong mẫu thử.

5. Thuốc thử

5.1. Yêu cầu chung

Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích và nước loại 3 nêu trong TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987).

CHÚ THÍCH: Việc xác định có thể được thực hiện bằng cách sử dụng bộ kit thử phức hợp có bán sẵn trên thị trường.

5.2. Glyxylglyxin.

5.3. Axit L-glutamic.

5.4. Dung dịch natri hydroxit

5.4.1. Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = 10 mol/l.

5.4.2. Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = 10 mmol/l.

5.5. Nicotinamit-adenin dinucleotit.

5.6. Glutamat-pyruvat transaminaza, dạng huyền phù, ρ(GPT) = 10 mg/l, hoạt độ riêng khoảng 80 IU/mg.

5.7. L-lactat dehydrogenaza, dung dịch trong glyxerol, φ(L-LDH) = 50 %, hoạt độ riêng khoảng 550 IU/mg.

5.8. D-lactat dehydrogenaza, dạng huyền phù, c(D-LDH) = 3,2 mol/l, hoạt độ riêng khoảng 300 IU/mg.

5.9. Dung dịch chuẩn axit L-lactic, c(axit L-lactic) = 1,0 mol/l.

5.10. Muối liti D-lactat.

5.11. Dung dịch đệm, pH = 10,0

Hòa tan 4,75 g glyxylglyxin (5.2) và 0,88 g axit L-glutamic (5.3) trong khoảng 50 ml nước. Chỉnh đến pH 10,0 bằng khoảng 4,6 ml natri hydroxit (5.4.1) và thêm nước đến 60 ml. Dung dịch đệm này bền được ít nhất 3 tháng ở + 4 ^oC.

5.12. Dung dịch nicotinamit-adenin dinucleotit

Hòa tan 420 mg NAD (5.5) trong 12 ml nước. Dung dịch đã pha bền được ít nhất 4 tuần ở + 4 ^oC.

5.13. Huyền phù glutamat-pyruvat transaminaza

Li tâm 2 ml huyền phù GPT (5.6) trong 10 min với tốc độ khoảng 4 000 r/min. Hút bỏ 1,0 ml dịch nổi trong, lắc kĩ huyền phù trước khi sử dụng. Huyền phù đã pha bền được ít nhất 1 năm ở + 4 ^oC.

5.14. Dung dịch L-lactat dehydrogenaza

Sử dụng dung dịch L-LDH (5.7) không pha loãng. Dung dịch bền được ít nhất 1 năm ở + 4 ^oC.

5.15. Huyền phù D-lactat dehydrogenaza

Sử dụng huyền phù D-LDH (5.8) không pha loãng. Huyền phù bền được ít nhất 1 năm ở + 4 ^oC.

5.16. Dung dịch chuẩn axit L-lactic, c(CH₃CHOHCOOH) = 0,5 mmol/l

Pha loãng 2 000 lần dung dịch chuẩn axit L-lactic (5.9) bằng natri hydroxit (5.4.2). Chuẩn bị dung dịch mới trước khi sử dụng.

5.17. Dung dịch chuẩn axit D-lactic, c(CH₃CHOHCOOLi) = 0,5 mmol/l

Hòa tan 48 mg muối liti D-lactat (5.10) trong 100 ml nước. Pha loãng dung dịch bằng nước với tỉ lệ 1:9 (thể tích). Chuẩn bị mới dung dịch trước khi sử dụng.

6. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

6.1. Pipet dùng để thử nghiệm enzym, có chia vạch dọc thân pipet và đầu tip phân phối dài, không chia vạch.

6.2. Pipet, có độ chính xác tương đương 6.1 (thay thế cho 6.1), ví dụ có thể thay đổi thể tích pipet.

6.3. Cuvet, làm bằng thủy tinh hoặc bằng nhựa, có chiều dài đường quang 1 cm và có độ hấp thụ không đáng kể ở các bước sóng 334 nm, 340 nm và 365 nm.

6.4. Máy đo quang đơn phổ, có đèn thủy ngân và màng lọc đo được ở các bước sóng 334 nm hoặc 365 nm.

6.5. Máy đo quang phổ, (bước sóng có thể thay đổi) để đo ở 340 nm (thay thế cho 6.4).

6.6. Máy li tâm, có thể tạo gia tốc li tâm 3000g trên các ống li tâm (6.8).

CHÚ THÍCH: Tần số quay cần thiết để tạo gia tốc li tâm chính xác có thể được tính từ công thức sau:

a = 11,18 x r x (n/1 000)²                                                (4)

Trong đó:

a          là gia tốc li tâm;

r           là bán kính của máy li tâm, tính bằng centimet (cm), được đo từ trung điểm (trên trục li tâm) đến đáy của ống li tâm khi quay;

n          là số vòng quay trong một phút.

6.7. Thiết bị lọc màng, với màng lọc có cỡ lỗ 0,45 µm.

6.8. Ống li tâm.

7. Cách tiến hành

7.1. Chuẩn bị mẫu thử

Pha loãng nước quả sao cho hàm lượng axit D- và L-lactic trong mỗi cuvet có khoảng từ 2 µg đến 35 µg. Hàm lượng này tương đương với 20 mg đến 350 mg axit lactic trên lít mẫu thử (dạng dung dịch). Nếu nồng độ axit lactic trong mẫu thử (dạng dung dịch) nhỏ hơn 20 mg/l, thể tích mẫu được cho vào cuvet có thể tăng đến 1,5 ml. Trong trường hợp này, thể tích nước được thêm vào phải giảm đi sao cho thể tích cuối cùng trong cuvet là không đổi.

Sử dụng ngay mẫu (đã pha loãng), kể cả khi mẫu có màu nhạt.

Việc phân tích theo phương pháp này phải thực hiện dựa vào đơn vị thể tích, kết quả được biểu thị theo lít mẫu thử. Việc phân tích các mẫu cô đặc có thể được thực hiện theo thể tích sau khi pha loãng đến một tỉ trọng tương đối đã biết. Trong trường hợp này, phải đưa ra được tỉ trọng tương đối. Dựa trên lượng mẫu đã cân và đưa hệ số pha loãng khi phân tích vào phép tính, kết quả có thể được biểu thị theo kilogam sản phẩm. Đối với các sản phẩm có độ nhớt cao và/hoặc có hàm lượng tế bào rất cao (ví dụ thịt quả), việc xác định dựa trên lượng mẫu thử đã cân theo quy trình thông thường.

Đối với mẫu đục thì trộn kĩ trước khi pha loãng. Làm trong các mẫu đục có hàm lượng axit D- và L-lactic thấp bằng cách lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi li tâm.

7.2. Tiến hành thử

7.2.1. Yêu cầu chung

Phép xác định phải thực hiện trong điều kiện nhiệt độ không đổi, trong khoảng từ 20 ^oC đến 25 ^oC. Có thể sử dụng nhiệt độ không đổi trong khoảng từ 25 ^oC đến 37 ^oC, với điều kiện thu được các kết quả tương đương.

NADH có độ hấp thụ cực đại tại bước sóng 340 nm. Khi sử dụng máy đo phổ thay đổi được bước sóng (6.5), thì chỉ đo tại bước sóng hấp thụ cực đại. Khi sử dụng máy đo quang vạch đơn dùng đèn hóa hơi thủy ngân, thì đo tại bước sóng 334 nm hoặc 365 nm.

Không sử dụng pipet một vạch để hút dung dịch. Các dung dịch enzym, coenzym và đệm có thể được lấy bằng pipet tự động thích hợp. Chỉ sử dụng pipet dùng để thử nghiệm enzym (6.1) hoặc dụng cụ tương đương (6.2) để lấy dung dịch mẫu thử.

Sử dụng dung dịch chuẩn axit D- và L-lactic trong mỗi dãy phân tích.

7.2.2. Dung dịch mẫu trắng

Xem thêm về tiến trình lấy dung dịch mẫu thử bằng pipet tại 7.2.3 và 7.2.4.

Dùng pipet lấy 1,00 ml dung dịch đệm (5.11), 0,20 ml dung dịch NAD (5.12), 1,50 ml nước và 0,02 ml huyền phù GPT (5.13) cho vào cuvet.

Trộn và đọc độ hấp thụ A1 sau 5 min.

Thêm 0,02 ml dung dịch L-LDH (5.14) hoặc 0,05 ml dung dịch D-LDH (5.15) (tương ứng với việc xác định axit L-lactic hay axit D-lactic). Trộn và đọc độ hấp thụ A₂ sau 20 min.

7.2.3. Dung dịch thử axit L-lactic

Dùng pipet lấy 1,00 ml dung dịch đệm (5.11), 0,20 ml dung dịch NAD (5.12), 1,40 ml nước, 0,02 ml huyền phù GPT (5.13) và 0,10 ml dung dịch mẫu thử (7.1) cho vào cuvet.

Trộn và đọc độ hấp thụ A₁ sau 5 min.

Thêm 0,02 ml dung dịch L-LDH (5.14). Trộn và đọc độ hấp thụ A₂ sau 20 min.

Kiểm tra phản ứng đã kết thúc hay chưa bằng cách cứ sau 2 min trong khoảng thời gian 10 min, đọc các độ hấp thụ cuối cùng. Nếu cần, điều chỉnh phản ứng “phụ” (giá trị tăng lên không đổi) bằng cách ngoại suy độ hấp thụ về thời điểm thêm L-LDH (xem Phụ lục B).

Bảng 1

Tính chênh lệch độ hấp thụ trước và sau khi phản ứng (A₂ – A₁) đối với dung dịch thử trắng và đối với dung dịch mẫu thử.

Lấy chênh lệch độ hấp thụ của mẫu thử trừ đi chênh lệch độ hấp thụ của mẫu trắng:

ΔA = ΔA_Mẫu – ΔA_{Mẫu trắng}                          (5)

7.2.4. Dung dịch thử axit D-lactic

Dùng pipet lấy 1,00 ml dung dịch đệm (5.11), 0,20 ml dung dịch NAD (5.12), 1,40 ml nước, 0,02 ml huyền phù GPT (5.13) và 0,10 ml dung dịch mẫu thử (7.1) cho vào cuvet.

Trộn và đọc độ hấp thụ A1 sau 5 min.

Thêm 0,05 ml dung dịch D-LDH (5.15). Trộn và đọc độ hấp thụ A2 sau 30 min.

Nếu dung dịch được ủ ở 37 ^oC, độ hấp thụ có thể được đọc sau 20 min.

Kiểm tra xem phản ứng đã kết thúc chưa bằng cách cứ sau 2 min trong khoảng 10 min, đọc độ hấp thụ thu được. Nếu cần, điều chỉnh phản ứng “phụ” (giá trị tăng lên không đổi) bằng cách ngoại suy độ hấp thụ về thời điểm thêm D-LDH (xem Phụ lục B).

Bảng 2

Tính chênh lệch độ hấp thụ trước và sau khi phản ứng (A₂ – A₁) đối với dung dịch thử trắng và đối với dung dịch mẫu thử.

Lấy chênh lệch độ hấp thụ của mẫu thử trừ đi chênh lệch độ hấp thụ của mẫu trắng:

Δ_A = Δ_Mẫu – ΔA_{Mẫu trắng}                                          (6)

8. Tính kết quả

Hàm lượng axit lactic, ρ, biểu thị bằng miligam trên lít (mg/l) được tính theo công thức sau:

                                            (7)

trong đó:

V₁         là thể tích cuối cùng, tính bằng mililit (ml);

M         là khối lượng phân tử của axit lactic (90,1 g/mol);

F          là hệ số pha loãng dung dịch mẫu thử;

V₂         là thể tích của dung dịch mẫu thử, tính bằng mililit (ml);

d           là chiều dài đường quang của cuvet, tính bằng centimet (cm);

ε           là hệ số hấp thụ của NADH

tại bước sóng 340 nm, ε = 6,3 [l × mmol^{– 1} × cm^{– 1}];

tại bước sóng 365 nm, ε = 3,4 [l × mmol^{– 1} × cm^{– 1}];

tại bước sóng 334 nm, ε = 6,18 [l × mmol^{– 1} × cm^{– 1}].

Nếu không thay đổi các thể tích trong 7.2.3 và 7.2.4 thì tính hàm lượng axit L-lactic và axit D-lactic bằng miligam trên lít (mg/l) theo công thức sau:

– Đối với hàm lượng axit L-lactic:

                       (8)

– Đối với hàm lượng axit D-lactic:

                       (9)

Khi sử dụng bộ kit thử phức hợp có bán sẵn trên thị trường, thì các hệ số 2 469 và 2 496 trong các công thức (8) và (9) nêu trên có thể thay đổi.

Trong phần tính kết quả, cần tính đến hệ số pha loãng và mối tương quan giữa giá trị với thể tích hoặc khối lượng. Nếu sản phẩm cô đặc đã được pha loãng đến nồng độ đơn thì ghi lại tỉ trọng tương đối của mẫu nồng độ đơn.

Tính hàm lượng axit lactic theo miligam trên lít đến số nguyên hoặc theo miligam trên kilogam, phụ thuộc vào việc chuẩn bị mẫu (7.1).

9. Độ chụm

Chi tiết về phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được đưa ra trong Phụ lục A. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và chất nền khác với dải nồng độ và chất nền nêu trong Phụ lục A.

9.1. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp vượt quá giá trị độ lặp lại r.

Giá trị độ lặp lại:

r = 11 % đối với cả axit D-lactic và axit L-lactic.

9.2. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành thử trên vật liệu giống thử hệt nhau, trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 5 % các trường hợp vượt quá giá trị độ tái lập R.

Giá trị độ tái lập:

R = 32 % đối với cả axit D-lactic và axit L-lactic.

10. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

– mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử (loại mẫu, nguồn gốc của mẫu, tên gọi);

– viện dẫn tiêu chuẩn này;

– ngày và phương pháp lấy mẫu, nếu biết;

– ngày nhận mẫu;

– ngày thử nghiệm;

– kết quả thử và đơn vị biểu thị kết quả;

– độ lặp lại, nếu được kiểm tra;

– bất kỳ điểm ngoại lệ nào quan sát được trong khi thực hiện phép thử;

– mọi thao tác không quy định trong phương pháp hoặc tùy chọn mà có thể ảnh hưởng đến kết quả.

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

Kết quả thống kê phép thử liên phòng thử nghiệm

Theo ISO 5725:1986*, các thông số sau đây đã được xác định trong một phép thử liên phòng thử nghiệm (xem Thư mục tài liệu tham khảo). Phép thử được tiến hành bởi Intermational Federal of Fruit Juice Producers (IFU), Paris, Pháp.

Bảng A.1 – Axit L-lactic

Mẫu	A	B	C	D
Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ Số lượng ngoại lệ (phòng thử nghiệm) Số lượng kết quả được chấp nhận	17 2 69	17 2 68	18 1 71	19 2 92
Giá trị trung bình () (mg/l)	182	141	268	149
Độ lệch chuẩn lặp lại (sr) (mg/l) Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (RSDr) (%)	9,24 5,1	5,10 3,6	12,80 4,8	4,52 3,0
Giới hạn lặp lại (r) (mg/l)	26	14	36	13
Độ lệch chuẩn tái lập (sR) (mg/l) Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (RSDR) (%)	18,91 10,4	18,20 12,9	36,07 13,5	12,63 8,5
Giới hạn tái lập (R) (mg/l)	59	51	101	35

Bảng A.2 – Axit D-lactic

Mẫu	A	B	C	D
Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ Số lượng ngoại lệ (phòng thử nghiệm) Số lượng kết quả được chấp nhận	19 – 77	19 – 75	19 – 76	21 – 108
Giá trị trung bình () (mg/l)	179	136	233	91
Độ lệch chuẩn lặp lại (sr) (mg/l) Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (RSDr) (%)	6,97 3,9	4,91 3,6	7,80 3,3	4,18 4,6
Giới hạn lặp lại (r) (mg/l)	20	14	22	12
Độ lệch chuẩn tái lập (sR) (mg/l) Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (RSDR) (%)	20,02 11,2	16,58 12,2	30,50 13,1	9,50 10,4
Giới hạn tái lập (R) (mg/l)	56	46	85	27

PHỤ LỤC B

(Tham khảo)

Thông tin về cách xử lí các phản ứng “phụ”

Các phản ứng “phụ” nói chung do tác dụng phụ của enzym, sự có mặt của các enzym khác trong chất nền mẫu thử, hoặc do tương tác của một hoặc một số thành phần của chất nền với thuốc thử của phản ứng enzym.

Trong phản ứng thông thường, độ hấp thụ thu được là giá trị không đổi sau khoảng thời gian xác định, thông thường từ 10 min đến 20 min, phụ thuộc vào tốc độ của phản ứng enzym cụ thể. Tuy nhiên, khi phản ứng phụ xảy ra, độ hấp thụ không đạt được giá trị không đổi mà tăng đều theo thời gian và dạng phản ứng này được gọi chung là phản ứng “phụ”.

Nếu phản ứng “phụ” xuất hiện, độ hấp thụ của dung dịch phải được đo trong các khoảng thời gian cách đều (2 min đến 5 min) sau thời gian cần thiết để dung dịch đạt độ hấp thụ cuối cùng. Khi độ hấp thụ tăng theo tỉ lệ không đổi (dA/dt = hằng số), đọc từ 5 lần đến 6 lần và sau đó ngoại suy, dùng biểu đồ hoặc dùng phép tính, để thu được độ hấp thụ của dung dịch tại thời điểm cuối cùng mà enzym được thêm vào (T_o). Chênh lệch của độ hấp thụ đã được ngoại suy tại thời điểm này (A_f – A_i) được sử dụng để tính nồng độ chất nền.

Hình B.1 – Phản ứng phụ

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] ISO 5725:1986 Precision of test methods – Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests (Độ chụm của phương pháp thử – Xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp thử bằng thử nghiệm liên phòng).

[2] Determination of lactic acid: Enzymatic method: No. 53,1983. In: Analyses [Collection]/International Federation of Fruit Juice Producers. Loose-leaf edition, as of 1995. Zug: Swiss Fruit Union.

[3] Determination of L-lactic acid/D-lactic acid: Enzymatic method. In: Methods of biochemical analysis and food analysis, using single reagents. Boehringer Mannheim.