TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8975:2018 (EN 14152:2014) VỀ THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH VITAMIN B2 BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8975:2018

EN 14152:2014

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH VITAMIN B₂ BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Foodstuffs – Determination of vitamin B₂ by high perfomance liquid chromatography

Lời nói đầu

TCVN 8975:2018 thay thế TCVN 8975:2011

TCVN 8975:2018 hoàn toàn tương đương với EN 14152:2014;

TCVN 8975:2018 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH VITAMIN B₂ BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Foodstuffs – Determination of vitamin B₂ by high perfomance liquid chromatography

CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đưa ra được tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1  Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng vitamin B₂ trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và detector huỳnh quang. Phương pháp này được đánh giá xác nhận trong hai nghiên cứu thử nghiệm liên phòng. Nghiên cứu đầu tiên phân tích các mẫu sữa bột và gan lợn trong dải từ 1,45 mg/100 g đến 10,68 mg/100 g. Nghiên cứu thứ hai phân tích thức ăn dùng bằng đường xông, thức ăn trẻ em, sữa bột, thức ăn bổ sung rau quả, men, bột ngũ cốc và bột sôcôla trong dải từ 0,21 mg/100 g đến 87,1 mg/100 g. Vitamin B2 là tổng các phần khối lượng của riboflavin bao gồm các dẫn xuất phosphoryl hóa.

Xem Điều 8 và Phụ lục B để biết thêm thông tin về đánh giá xác nhận.

2  Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

3  Nguyên tắc

Riboflavin được chiết từ thực phẩm bằng cách thủy phân axit, sau đó dephospharyl hóa bằng enzym, được tách bằng HPLC và phát hiện bằng detector huỳnh quang. Sử dụng chất ngoại chuẩn để định lượng. Để biết thêm thông tin xem [1] đến [11].

4  Thuốc thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước ít nhất đạt loại 1 của TCVN 4851 (ISO 3696) hoặc nước cất hai lần, trừ khi có qui định khác.

4.1  Metanol, w(CH₃OH) ≥ 99,8 % phần khối lượng, loại dùng cho HPLC.

4.2  Natri axetat ngậm ba phân tử nước, w(CH₃COONa.3H₂O) = 99 %.

4.3  Dung dịch natri axetat, nồng độ chất c(CH₃COONa.3H₂O) = 0,1 mol/l.

4.4  Dung dịch natri axetat, c(CH₃COONa.3H₂O) = 2,5 mol/l.

4.5  Axit axetic băng, w(CH₃COOH) = 99,8 %.

4.6  Dung dịch axit axetic, c(CH₃COOH) = 0,02 mol/l

4.7  Axit clohydric, w(HCl) = 36 %.

4.8  Axit clohydric, c(HCl) = 0,1 mol/l.

4.9  Axit clohydric, c(HCl) = 0,01 mol/l.

4.10  Axit sulfuric, c(H₂SO₄) = 0,05 mol/l.

4.11  Natri hydroxit, w(NaOH) ≥ 99 %.

4.12  Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = 0,5 mol/l.

4.13  Phospho pentoxit, w(P₂O₅) = 98 %.

4.14  Enzym hoặc hỗn hợp enzym, có khả năng giải phóng vitamin B₂ ra khỏi thực phẩm thành riboflavin tự do.

CHÚ THÍCH  Taka-Oiastase1) được sử dụng để xác định dữ liệu về độ chụm trong Bảng B.1. Hỗn hợp enzym β-amylase từ lúa mạch và Taka-Diastase¹⁾ từ Serva được sử dụng để xác định dữ liệu về độ chụm trong Bảng B.2 và Bảng B.3.

4.15  Pha động HPLC

Các ví dụ về hỗn hợp thích hợp: ví dụ từ 10 % đến 50 % metanol (4.1) trong nước hoặc sử dụng đệm phosphat hoặc đệm axetat nêu trong Phụ lục A và Phụ lục C. Cũng có thể sử dụng các tác nhân tạo cặp ion.

4.16  Đệm phosphat (pH = 3,5), c(KH₂PO₄) = 9,0 mmol/l.

4.17  Tetraetylamoniclorua, w(C₈H₂₀NCl) ≥ 98 %.

4.18  Natri heptansulfonat, w(C₇H₁₅NaO₃S) ≥ 98 %.

4.19  Chất chuẩn

4.19.1  Riboflavin, w(C₁₇H₂₀N₄O₆) = 98 %

Có thể sử dụng vitamin B2 ở dạng riboflavin từ các nhà cung cấp khác nhau. Độ tinh khiết của chất chuẩn riboflavin có thể khác nhau. Do đó cần xác định nồng độ của dung dịch hiệu chuẩn bằng phép đo phổ UV (xem phép kiểm tra nồng độ 4.20.3).

4.19.2  Riboflavin–5’-phosphat, w(C₁₇H₂₀N₄NaO₉P) = 95 %

Muối natri ribofIavin-5′-phosphat (để kiểm tra enzym và thời gian lưu trong sắc ký đồ).

4.20  Dung dịch gốc

4.20.1  Chú ý phòng ngừa

Vitamin B₂ rất nhạy với ánh sáng. Cần có các biện pháp để bảo vệ vitamin B₂ và các dung dịch tương ứng trong quá trình chuẩn bị mẫu ví dụ: đựng trong dụng cụ bằng thủy tinh màu nâu.

4.20.2  Dung dịch chuẩn gốc riboflavin, M = 376,36, p(C₁₇H₂₀N₄O₆) ≈ 100 µg/ml

Hòa tan một lượng chất chuẩn riboflavin (4.19.1) đã được sấy khô và được bảo quản ở nơi tối trong bình hút ẩm chân không hoặc/và trên phospho pentoxit (4.13), đã được cân chính xác đến miligam, ví dụ khoảng 50 mg, trong một thể tích xác định, trong dung môi thích hợp, ví dụ 500 ml axit axetic loãng (4.6) sử dụng các bình định mức màu nâu. Dung dịch này có thể bền được hai tháng khi bảo quản ở 4 °C ở nơi tối.

Riboflavin khó hòa tan. Để dễ hòa tan, làm ấm khoảng 300 ml axit axetic loãng (4.6) trên nồi hấp, liên tục khuấy cho đến khi hòa tan hết, để nguội và thêm axit axetic loãng (4.6) đến vạch 500 ml. Cách khác, thêm 5 ml dung dịch natri hydroxit (4.12) vào chất chuẩn trong bình định mức 500 ml. Vì tính không ổn định trong dung dịch kiềm ngay sau khi hòa tan, do đó thêm 1,5 ml axit axetic băng (4.5) và pha loãng tới vạch bằng axit axetic loãng (4.6), hoặc axit thích hợp khác. Nếu cần, kiểm tra nồng độ của dung dịch mới được chuẩn bị và dung dịch được bảo quản (4.20.3).

4.20.3  Kiểm tra nồng độ

Trộn 20 ml dung dịch gốc riboflavin (4.20.2) với 3,5 ml dung dịch natri axetat (4.3) trong bình định mức 200 ml và pha loãng bằng nước đến vạch. Để chuẩn bị dung dịch trắng, trộn 20 ml dung dịch axit axetic (4.6) với 3,5 ml dung dịch natri axetat (4.3) trong bình định mức 200 ml và pha loãng bằng nước đến vạch. Lấy các dung dịch này để đo phổ.

Đo độ hấp thụ của dung dịch riboflavin ở bước sóng cực đại khoảng 444 nm (A₄₄₄) trong cuvet 1 cm bằng máy đo phổ (5.1), dùng dung dịch trắng để làm đối chứng. Tính nồng độ khối lượng riboflavin của dung dịch gốc (4.20.2), p, bằng microgam trên mililit, theo Công thức (1):

Trong đó:

ε là hệ số hấp thụ phân tử của riboflavin ở bước sóng tối đa khoảng 444 nm. Giá trị là 12 340 l.mol^-1.cm^–1. Giá trị này có thể tính được từ hệ số tắt,  = 328, trong đệm axetat (pH = 3,8) ở 444 nm [9] và khối lượng phân tử M = 376,36. Giá trị đưa ra với bốn chữ số có nghĩa.

M là khối lượng phân tử, tính bằng gam trên mol. Giá trị là 376,36;

A₄₄₄ là độ hấp thụ của dung dịch riboflavin.

4.21  Dung dịch chuẩn

4.21.1  Dung dịch chuẩn riboflavin, p(C₁₇H₂₀N₄O₆) ≈ 10 μg/ml

Chuẩn bị dung dịch pha loãng 1:10 của dung dịch gốc riboflavin (4.20.2), ví dụ, dùng pipet lấy 10 ml dung dịch gốc riboflavin cho vào bình định mức màu nâu dung tích 100 ml và thêm axit axetic loãng (4.6) hoặc dung môi thích hợp khác đến vạch. Chuẩn bị dung dịch mới trong ngày sử dụng.

4.21.2  Dung dịch thử chuẩn riboflavin, p(C₁₇H₂₀N₄O₆) ≈ 0,1 μg/ml đến 1 μg/ml

Dùng pipet lấy các thể tích tương ứng, ví dụ từ 1,0 ml đến 10,0 ml dung dịch chuẩn (4.21.1) cho vào các bình định mức màu nâu, ví dụ dung tích 100 ml và pha loãng bằng pha động (4.15) đến vạch. Chuẩn bị dung dịch mới trong ngày sử dụng.

5  Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.1  Máy đo phổ UV, máy đo phổ UV để đo độ hấp thụ ở bước sóng xác định (444 nm), với các cuvet thích hợp, ví dụ chiều dài 1 cm.

5.2  Nồi hấp áp lực hoặc thiết bị gia nhiệt

Nồi hấp áp lực với mục đích chiết, ví dụ kiểu nồi áp suất, có dụng cụ đọc áp suất hoặc nhiệt độ; thiết bị gia nhiệt bằng điện hoặc nồi cách thủy.

5.3  Hệ thống HPLC, gồm có bơm, bộ bơm mẫu, detector huỳnh quang cài đặt bước sóng kích thích và phát xạ, ví dụ 468 nm và 520 nm tương ứng (xem Phụ lục C) và hệ thống đánh giá kết quả như bộ tích phân.

5.4  Cột HPLC

Cột phân tích pha đảo, ví dụ: đường kính từ 4,0 mm đến 4,6 mm, chiều dài từ 100 mm đến 250 mm, được nhồi bằng hạt cỡ từ 3 μm đến 10 μm. Có thể sử dụng các hệ thống khác (xem Phụ lục A) với điều kiện là tách được riboflavin ra khỏi các chất bị chiết cùng.

Có thể sử dụng các cỡ hạt và các kích thước cột khác với quy định trong tiêu chuẩn này. Các thông số tách phải phù hợp với vật liệu đó để đảm bảo cho các kết quả tương đương.

5.5  Thiết bị lọc

Việc lọc pha động cũng như lọc dung dịch mẫu qua bộ lọc màng, ví dụ cỡ lỗ 0,45 µm, trước khi sử dụng hoặc bơm sẽ làm tăng thời gian sử dụng của cột

6  Cách tiến hành

6.1  Lưu ý phòng ngừa

Vitamin B₂ rất nhạy với ánh sáng. Cần có các biện pháp để bảo vệ mẫu và các dung dịch tương ứng trong suốt quá trình phân tích ví dụ đựng trong dụng cụ thủy tinh màu nâu.

6.2  Chuẩn bị mẫu thử

Đồng hóa mẫu thử. Nghiền nguyên liệu thô trong máy nghiền thích hợp và trộn lại. Cần thực hiện các biện pháp như làm nguội sơ bộ để tránh mẫu tiếp xúc với nhiệt độ cao trong thời gian dài.

6.3  Chuẩn bị dung dịch mẫu thử

6.3.1  Chiết mẫu

Cân một lượng mẫu thích hợp, ví dụ từ 2 g đến 10 g, chính xác đến miligam, cho vào cốc có mỏ hoặc bình nón. Thêm một thể tích xác định từ 50 ml đến 200 ml axit clohydric (4.8) hoặc axit sulfuric (4.10). Độ pH của dung dịch phải ≤ 2,0. Đậy vật chứa bằng mặt kính đồng hồ và hấp áp lực phần mẫu thử 30 min ở 121 °C, hoặc làm nóng 60 min ở 100 °C.

Dữ liệu từ nghiên cứu BCR cho thấy có thể áp dụng một dải rộng các điều kiện để thủy phân axit (nhiệt độ từ 95 °C tới 130 °C, thời gian từ 15 min đến 60 min). Nhiệt độ cao hơn thì thời gian ngắn hơn. Tuy nhiên, việc gia nhiệt kéo dài có thể làm thất thoát riboflavin và riboflavin-5′-phosphat. Đặc biệt với các loại thực phẩm chứa socola, thực tế cho thấy hiệu quả quá trình chiết có thể giảm khi pH lớn hơn 2.

6.3.2  Xử lý bằng enzym

Sau khi làm nguội đến nhiệt độ phòng, chỉnh dịch chiết đến pH tối ưu đối với enzym được sử dụng bằng dung dịch natri axetat (4.4) và thêm một lượng thích hợp enzym khử phosphoryl hóa (4.14) vào mẫu. Ủ hỗn hợp với khoảng thời gian và nhiệt độ tối ưu đối với enzym được sử dụng. Sau khi làm nguội đến nhiệt độ phòng, chuyển dung dịch vào bình định mức được bảo vệ tránh ánh sáng, sử dụng axit axetic loãng (4.6) hoặc dung môi thích hợp khác và pha loãng đến thể tích xác định (V_E).

Đối với từng enzym được sử dụng, phải kiểm tra pH, thời gian ủ và nhiệt độ ủ tối ưu.

Để đảm bảo khử phosphoryl hóa tối ưu, bước sử dụng enzym phải được kiểm tra bằng cách phân tích mẫu được bổ sung muối natri riboflavin-5’-phosphat (4.19.2) và vật liệu mẫu tương tự mẫu thử này. Chất này phải là vật liệu chuẩn.

Nếu lượng riboflavin có thể sinh ra cùng với enzym thì phải được xem xét khi tính kết quả.

CHÚ THÍCH  Để xác định các dữ liệu về độ chụm nêu trong Bảng B.1, Bảng B.2 và Bảng B.3, Taka-Diastase¹⁾ (Bảng B.1) hoặc Taka-Diastase kết hợp với β-amylase từ lúa mì (Bảng B.2 và Bảng B.3) đã được sử dụng để khử phosphoryl hóa trong các điều kiện sau. Dịch chiết được chỉnh đến pH = 4,0 và pH = 4,5 tương ứng, bằng dung dịch natri axetat (4.4) và cứ một gam mẫu thì bổ sung 100 mg Taka-Diastase và 10 mg β-amytase. Hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ từ 37 °C đến 45 °C trong khoảng từ 4 h đến 24 h, xem [9], [10] và [13].

6.3.3  Dung dịch mẫu thử

Lọc dung dịch mẫu (6.3.2) qua giấy lọc hoặc bộ lọc màng 0,45 µm, nếu cần. Có thể cho ly tâm ở gia tốc g thích hợp. Pha loãng một lượng dịch lọc trong (V_A) đến một thể tích xác định (V) bằng hỗn hợp dung môi tương thích với hệ thống HPLC được sử dụng, nếu cần. Ví dụ pha loãng 1,0 ml dịch chiết (6.3.2) với 1,0 ml metanol (4.1). Dung dịch mẫu thử này được dùng để phân tích HPLC.

6.4  Nhận biết

Bơm cùng thể tích thích hợp của các dung dịch chuẩn, mẫu và mẫu trắng vào hệ thống HPLC. Nhận biết riboflavin bằng cách so sánh thời gian lưu của pic trong sắc ký đồ thu được với dung dịch mẫu thử và với dung dịch chuẩn. Có thể thực hiện phép nhận biết pic bằng cách thêm các lượng nhỏ dung dịch chuẩn thích hợp vào dung dịch mẫu thử.

CHÚ THÍCH  Việc tách và định lượng cho thấy là thỏa đáng nếu tuân theo các điều kiện thí nghiệm sau đây (xem thêm Hình A.1). Đối với các hệ thống HPLC thay thế, xem Bảng C.1.

Pha tĩnh: Supelco^® LC-18-DB2), 5 μm, 250 mm x 4,6 mm

Pha động: metanol (4.1): đệm phosphat, pH 3,5 (4.16) có chứa tetraetylamoniclorua 1 g/l (4.17) và natri heptansulfonat 5 mmol/l (4.18) (35:65)

Tốc độ dòng: 1,0  ml/min

Thể tích bơm: 20 μl

Detector: huỳnh quang; bước sóng kích thích là 468 nm; bước sóng phát xạ là 520 nm.

6.5  Phép xác định

Bơm các thể tích bằng nhau (đến 100 μl) của dung dịch riboflavin (4.20.2) cũng như dung dịch mẫu thử (6.3.3) vào trong hệ thống HPLC. Tiến hành định lượng bằng phương pháp ngoại chuẩn, tích phân các diện tích pic hoặc xác định chiều cao pic và so sánh các kết quả với các giá trị tương ứng của chất chuẩn. Kiểm tra độ tuyến tính của hàm hiệu chuẩn.

7  Tính kết quả

Tính kết quả dựa trên đồ thị chuẩn hoặc sử dụng chương trình tương ứng của bộ tích phân hoặc sử dụng theo công thức dưới đây. Tính phần khối lượng vitamin B₂ của mẫu thử, w, bằng miligam trên 100 g (mg/100 g), sử dụng Công thức (2):

 (2)

Trong đó:

As là diện tích pic hoặc chiều cao pic của riboflavin thu được từ dung dịch mẫu thử (6.3.3), tính bằng đơn vị diện tích hoặc chiều cao;

A_ST  là diện tích pic hoặc chiều cao pic của riboflavin thu được với dung dịch reiboflavin (4.20.2), tính bằng đơn vị diện tích hoặc chiều cao;

V  là tổng thể tích của dung dịch mẫu thử cuối cùng (6.3.3), tính bằng mililit (ml);

V_E  là thể tích của mẫu chiết (6.3.2), tính bằng mililit (ml);

V_A  là thể tích phần mẫu thử được dùng để pha loãng cuối cùng (6.3.3), tính bằng mililit (ml);

p  là nồng độ khối lượng của riboflavin trong dung dịch riboflavin (4.20.2), tính bằng microgam trên mllilit (µg/ml);

m_s  là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g);

1000  là hệ số chuyển đổi từ microgam thành miligam;

100  là hệ số chuyển đổi của phần khối lượng trên 100 g;

E  là phần khối lượng riboflavin có trong enzym, tính bằng miligam trên 100 g (mg/100 g);

m_E  là khối lượng enzym đã sử dụng trong phép phân tích, tính bằng gam (g).

Báo cáo kết quả vitamin B₂ bằng miligam trên 100 g (mg/100 g).

8  Độ chụm

8.1  Yêu cầu chung

Dữ liệu về độ chụm của các phương pháp HPLC khác nhau áp dụng cho phép xác định riboflavin bằng nghiên cứu so sánh quốc tế do Chương trình Tiêu chuẩn, Đo lường và Thử nghiệm của Ủy ban tiêu chuẩn châu Âu tổ chức thực hiện trên mẫu bột mì nguyên cám (CRM 121), mẫu sữa bột/sữa bột sấy phun (CRM 421), rau hỗn hợp đông khô (CRM 485) và gan lợn đông khô (CRM 487). Nghiên cứu này cung cấp thông tin thống kê nêu trong Bảng B.1, Phụ lục B. Hơn nữa, dữ liệu về độ chụm bao gồm các kết quả nghiên cứu hợp tác của Pháp trong thức ăn dùng bằng đường xông, thức ăn trẻ em bổ sung rau, sữa bột, thức ăn bổ sung rau quả, men, ngũ cốc, bột sô cô la và thực phẩm bổ sung. Kết quả của nghiên cứu này được nêu trong Bảng B.2 và Bảng B.3, Phụ lục B.

8.2  Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử độc lập, đơn lẻ thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn lặp lại r.

Các giá trị riboflavin là:

8.3  Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử riêng rẽ, thu được khi tiến hành thử trên vật liệu giống nhau bởi hai phòng thử nghiệm khác nhau, không quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn tái lập R.

Các giá trị riboflavin là:

9  Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm nên phù hợp với TCVN ISO/IEC 17025 và ít nhất bao gồm các thông tin sau:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) viện dẫn tiêu chuẩn này hoặc phương pháp thử đã sử dụng;

c) ngày và quy trình lấy mẫu (nếu biết);

d) ngày nhận mẫu;

e) ngày thử nghiệm;

f) các kết quả và các đơn vị biểu thị kết quả;

g) bất kỳ điểm đặc biệt nào quan sát được trong quá trình thử nghiệm;

h) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn cùng với các có thể ảnh hưởng tới kết quả.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Ví dụ về sắc ký đồ HPLC

CHÚ DẪN

Y  huỳnh quang

X  thời gian (min)

1  vitamin B₂ trong dung dịch chuẩn riboflavin (c = 0,5 μg/ml) ở 2,3 min

2  vitamin B₂ trong thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh ở 2.3 min

Pha tĩnh: SymmetiyShleld RP18,5 μm, 150 mm x 3,0 mm

Pha động: matanol (4.1): natri axetat (0,05 mol/l) (30:70)

Tốc độ dòng: 1,0 ml/min

Thể tích bơm: 10 μl

Detector: huỳnh quang; bước sóng kích thích: 468 nm; bước sóng phát xạ: 520 nm

Hình A.1 – Ví dụ về tách a) dung dịch chuẩn riboflavin và b) thức ăn công thức dành cho trẻ sơ sinh bằng HPLC

Phụ lục B

(Tham khảo)

Dữ liệu về độ chụm

Dữ liệu trong Bảng B.1 được xác định trong phép thử nghiệm liên phòng [9] theo Hướng dẫn Nghiên cứu Chứng nhận SMT của EU. Viện Nghiên cứu Thực phẩm, Norwich, Anh thay mặt cho Văn phòng Tham chiếu Cộng đồng Châu Âu, tiến hành nghiên cứu. Dữ liệu nêu trong Bảng B.2 và Bảng B.3 đã được xác định trong phép thử liên phòng thử nghiệm của Pháp [10].

Bảng B.1 – Dữ liệu về độ chụm đối với sữa bột và gan lợn

Mẫu	CRM 421, Sữa bột	CRM 487, Gan lợn
Chất phân tích	riboflavin	riboflavin
Năm nghiên cứu liên phòng	1996	1996
Số lượng phòng thử nghiệm	13	11
Số lượng mẫu	1	1
Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ	12	11
Số ngoại lệ	1	0
Số kết quả chấp nhận được	60	55
Giá trị trung bình, , mg/100 g	1,45	10,5
Độ lệch chuẩn lặp lại, sr, mg/100 g	0,046	0,181
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, %	3,2	1,7
Giá trị lặp lại, r[r = 2,83 x sr], mg/100 g	0,130	0,511
Độ lệch chuẩn tái lập, sR, mg/100 g	0,106	0,832
Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, %	7,3	7,9
Giá trị tái lập, R[R = 2,83 x sR], mg/100 g	0,30	2,35
Giá trị HorRat, theo [14]	0,6	1,0

CHÚ THÍCH  Dữ liệu thu được trong nghiên cứu so sánh quốc tế này thu được bằng phương pháp tương đương khác với quy trình thử nghiệm thông thường trong các phòng thử nghiệm dùng hệ thống HPLC mô tả trong Phụ lục C.

Bảng B.2 – Dữ liệu về độ chụm đối với thức ăn dùng bằng đường xông, thức ăn cho trẻ có bổ sung rau, sữa bột, thức ăn có bổ sung hoa quả và nấm

Mẫu	Thức ăn dùng bằng đường xông	Thức ăn cho trẻ bổ sung rau	Sữa bột	Thức ăn bổ sung quả	Nấm
Năm nghiên cứu liên phòng thử nghiệm	1995	1995	1995	1995	1995
Số lượng phòng thử nghiệm	8	11	11	11	11
Số lượng mẫu	1	1	1	1	1
Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ	7	10	10	10	11
Số ngoại lệ	1	1	1	1	0
Số kết quả chấp nhận được	14	20	20	20	22
Giá trị trung bình, , mg/100 g	0,21	0,30	1,13	0,60	4,34
Độ lệch chuẩn lặp lại sr, mg/100 g	< 0,01	0,01	0,03	0,02	0,13
Hệ số biến thiên lặp lại, %	< 1	3	3	4	3
Giá trị lặp lại, r, [r = 2,83 x sr], mg/100 g	–	0,02	0,08	0,06	0,37
Độ lệch chuẩn tái lập sR, mg/100 g	0,01	0,03	0,1	0,03	0,43
Hệ số biến thiên tái lập, %	4	10	9	6	10
Giá trị tái lập R[R = 2,83 x sR], mg/100 g	0,02	0,09	0,27	0,09	1,2
Trị số HorRat, theo [14]	0,3	0,7	0,8	0,5	1,1

Bảng B.3 – Dữ liệu chính xác cho ngũ cốc, bột socola và thực phẩm bổ sung

Mẫu	Ngũ cốc	Ngũ cốc	Bột socola	Thực phẩm bổ sung
Năm nghiên cứu liên phòng thử nghiệm	1995	1995	1995	1995
Số lượng phòng thử nghiệm	11	11	11	9
Số lượng mẫu	1	1	1	1
Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ	10	10	11	9
Số ngoại lệ	1	1	0	0
Số kết quả chấp nhận được	20	20	22	18
Giá trị trung bình, , mg/100 g	0,43	2,48	1,26	87,1
Độ lệch chuẩn lặp lại sr, mg/100 g	0,02	0,07	0,05	3,4
Hệ số biến thiên lặp lại, %	5	3	4	4
Giá trị lặp lại, r, [r – 2,83 x sr], mg/100 g	0,06	0,18	0,14	9,5
Độ lệch chuẩn tái lập sR, mg/100 g	0,07	0,19	0,13	5,9
Hệ số biến thiên tái lập, %	16	8	11	7
Giá trị tái lập R[R = 2,83 * sR], mg/100 g	0,19	0,53	0,37	16,6
Trị số HorRat, theo [14]	1,2	0,8	1,0	1,2

Phụ lục C

(Tham khảo)

Các hệ thống HPLC thay thế

Việc tách và định lượng đã được chứng minh là đáp ứng nếu áp dụng các điều kiện sắc ký đang được áp dụng [2].

Bảng C.1 – Các hệ thống HPLC thay thế

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] LUMLEV I.D., WIGGINS R.A. Determination of riboflavin and flavin mononucleotide in foodstuffs using high-performance liquid chromatography and a column-enrichment technique. Analyst (Lond.). 1981, 106 pp. 1103-1108

[2] FINGLAS P.M., FAULKS R. M: Critical review of HPLC methods for the determination of thiamin, riboflavin and niacin in food. J. Micronutr. Anal. 1987, 3 pp. 251-283

[3] BALL F.M. in g. F. M. Ball (Ed.): Water-Soluble Vitamin Assays in Food Analysis. Elsevier Applied Science, London, 1994, 237-246

[4] HASSELMANN C., FRANCK D. grimm, P., Diop, PA and Soules, C.: High-performance liquid chromatographic analysis of thiamin and riboflavin in dietic foods. J. Micronutr. Anal. 1989, 5 pp. 269279

[5] OLLILAINEN V., MATTILA P., VARO P., KOIVISTOINEN P.. HUTTUNEN J. The HPLC determination of total riboflavin in foods. J. Micronutr. Anal 1990, 8 pp. 199-207

[6] HAGG M., KUMPULAINEN J. Thiamin and riboflavin contents in domestic and imported cereal products in Finland. J. Food Compos. Anal. 1993, 6 pp. 299-306

[7] HAGG M. Effect of various commercially available enzymes in the liquid chromatographic determination with external standardization of thiamin and riboflavin in foods. J. AOAC Int 1994, 77 pp. 681-686

[8] EITENMILLER R.R., LANDEN W.O. Vitamin Analysis for the Health and Food Sciences. CRC Press, Boca Raton, London, New York, Washington, D.C., 1999, pp. 299-337.

[9] FINGLAS P.M., SCOTT K.J., WITTHOFT C.M., VAN DEN BERG H., DE FROIDMONT-GORTZ I. The certification of the mass fractions of vitamins in four reference materials: Wholemeal flour (CRM 121), milk powder (CRM 421), lyophitised mixed vegetables (CRM 485) and lyophilised pig’s liver (CRM 487). EUR- report 18320. Office for Official Publications of the European Communities, Luxembourg, 1999

[10] ARELLA F., LAHELY S„ BOURGUIGNON J.B., HASSELMANN C. Liquid chromatographic determination of vitamin B1 and B2 in foods. A collaborative study. Food Chem. 1996, 56 pp. 81-86

[11] OLLILAINEN V., FINGLAS P.M., VAN DEN BERG H., DE FROIDMONT-GORTZ I. Certification of B-Group Vitamins (B1, B2, B6, and B12) in Four Food Reference Materials. J. Agric. Food Chem. 2001, 49 pp. 315-321

[12] European Pharmacopoeia 1997: 1997: 0292; Riboflavine. 1442-1443

[13] NDAW S., BERGAENZLE M., AOUOE–WERNER D„ HASSELMANN C. Extraction procedures for the liquid chromatography determination of thiamine, riboflavin and vitamin BQ in foodstuffs. Food Chem. 2000, 71 pp. 129-138

[14] HORWITZ W., ALBERT R. The Horwitz Ration (HorRat): A useful Index of Method Performance with Respect to Precision. J. AOAC Int. 2006, 89 pp. 1095-1109

[15] THOMPSON M. Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb concentrations in relation to fitness for purpose criteria in proficiency testing. Analyst (Lond.). 2000, 125 pp. 385-386

[16] JAKOBSEN J. Food Chem. 2008, 106 pp. 1209-1217. Available at: Optimisation of the determination of thiamin, 2-(1-hydroxyethyl)thiamin, and riboflavin in food samples by use of HPLC

[17] TCVN ISO/IEC 17025:2007 (ISO/IEC 17025:2005), Yêu cầu chung về năng lực của phòng thử nghiệm và hiệu chuẩn