TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8977:2011 (EN 14130 : 2003) VỀ THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH VITAMIN C BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 8977 : 2011

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH VITAMIN C BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Foodsuffs – Determination of vitamin C by high-performance liquid chromatography (HPLC)

CẢNH BÁO – Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể cần phải sử dụng các vật liệu, thiết bị và các thao tác nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đề cập đến các vấn đề an toàn khi sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn này.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định vitamin C trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Hàm lượng vitamin C là tổng axit ascorbic L(+) và axit ascorbic L(+) đã khử hydro.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi.

TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

3. Nguyên tắc

Vitamin C được chiết ra khỏi mẫu phân tích bằng dung dịch axit metaphosphoric. Dùng dung dịch khử để chuyển axit ascorbic L(+) đã khử hydro thành axit ascorbic L(+). Hàm lượng axit ascorbic L(+) tổng số được xác định bằng HPLC có detector UV ở bước sóng 265 nm [1], [2].

4. Thuốc thử

4.1. Yêu cầu chung

Trong quá trình phân tích, chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước sử dụng là nước cất hai lần hoặc ít nhất là loại 1 của TCVN 4851 (ISO 3696), trừ khi có quy định khác.

4.2. Hóa chất và các dung dịch

4.2.1. Axit metaphosphoric (HPO₃)_n.

4.2.2. Trinatri phosphat, w(Na₃PO₄.12H₂O) ³ 98,0% (phần khối lượng).

4.2.3. Kali dihydro phosphat, w(KH₂PO₄) ³ 99,0%.

4.2.4. L-cystein hoặc chất khử thích hợp khác, w(C₃H₇NO₂S) ³ 99,0%.

4.2.5. N-cestyl-N,N,N-trimethylamoni bromua, w(C₁₉H₄₂BrN) ³ 99,0%.

4.2.6. Metanol, (loại dùng cho HPLC), w(CH₃OH) ³ 99,0%.

4.2.7. Dung dịch axit metaphosphoric, r[(HPO₃)_n] = 200g/l.

Hòa tan 200 g axit metaphosphoric (4.2.1) trong nước đựng trong bình định mức 1 lít, thêm nước đến vạch. Dung dịch này khi được bảo quản ở 4 °C có thể bền đến một tháng.

4.2.8. Dung dịch axit metaphoshoric, r[(HPO₃)_n] = 20g/l

Dùng pipet lấy 50 ml dung dịch metaphosphoric (4.2.7) cho vào bình định mức 500 ml. Thêm nước đến vạch. Chuẩn bị dung dịch này trong ngày sử dụng.

4.2.9. Dung dịch trinatri phosphat, r(Na₃PO₄.12H₂O) = 200 g/l

Hòa tan 200g trinatri phosphat (4.2.2) trong nước trong bình định mức 1 lít, thêm nước đến vạch.

4.2.10. Dung dịch L-cystein, r(C₃H₇NO₂S) = 40 g/l.

Hòa tan 20 g L-cystein (4.2.4) trong nước trong bình đựng bình định mức 500 ml. Thêm nước đến vạch. Chuẩn bị dung dịch này trong ngày sử dụng.

4.2.11. Pha động dùng cho HPLC.

Hòa tan 13,6g kali dihydro phosphat (4.2.3) trong 900 ml nước đựng trong cốc có mỏ. Lọc qua bộ lọc cỡ lỗ 0,45µm (dung dịch A). Hòa tan 1,82 g N-cetyl-N,N,N-trimethylamoni bromua (4.2.5) trong 100 ml metanol (4.2.6) đựng trong cốc có mỏ. Trộn kỹ rồi lọc qua bộ lọc cỡ lỗ 0,45µm (dung dịch B). Trộn 900 ml dung dịch A với 100 ml dung dịch B. Khử khí dung dịch trước khi sử dụng, nếu cần.

4.2.12. Dung dịch tinh bột (tùy chọn), r(tinh bột hòa tan) = 1g/100 ml.

4.2.13. Dung dịch iot (tùy chọn), c(I₂) = 0,1 mol/l.

4.2.14. Axit sulfuric loãng, c(H₂SO₄) = 0,1 mol/l.

4.3. Chất chuẩn

4.3.1. Axit ascorbic, axit ascorbic L(+), w(C₆H₈O₆) ³ 99,7%

(R)-5-[(R)-1,2-Dihdroxyetyl]-3,4-dihydroxy-5-H-furan-2-on.

4.3.2 Axit erythorbic (isoascorbic), axit ascorbic D(-),w(C₆H₈O₆) ³ 99,0%

(R)-5-[(R)-1,2-Dihydroxyetyl-3,4-dihydroxy-5-H-furan-2-on.

4.4. Dung dịch gốc

4.4.1. Dung dịch gốc axit ascorbic, r(C₆H₈O₆) » 1mg/ml.

Hòa tan một lượng axit ascorbic (4.3.1) đã được cân chính xác đến 0,1mg, ví dụ khoảng 100 mg, trong một thể tích xác định, ví dụ 100 ml dung dịch axit metaphosphoric (4.2.8). Chuẩn bị dung dịch mới trong ngày sử dụng.

Có thể tăng tính ổn định của dung dịch gốc bằng cách bổ sung L-cystein.

4.4.2. Dung dịch gốc axit erythorbic, r(C₆H₈O₆) » 1 mg/ml.

Hòa tan một lượng axit erythorbic (4.3.2) đã được cân chính xác đến 0,1 mg, ví dụ khoảng 100 mg, trong một thể tích xác định, ví dụ 100 ml dung dịch axit metaphosphoric (4.2.8). Chuẩn bị dung dịch mới trong ngày sử dụng.

4.4.3. Phép thử độ tinh khiết (tùy chọn)

Cân chính xác khoảng 150 mg chất chuẩn axit ascorbic cho vào bình nón và hòa tan bằng cách thêm 10 ml axit sulfuric loãng (4.2.14) và 80 ml nước không chứa cacbon dioxit. Sau khi thêm tinh bột hoặc dung dịch tinh bột hoặc dung dịch tinh bột (4.2.12), thì chuẩn độ với dung dịch iot (4.2.13) cho đến khi có màu ổn định, 1 ml dung dịch iot tương ứng với 8,81mg axit ascorbic.

Tính độ tinh khiết của chất chuẩn, w_st, bằng phần trăm theo Công thức (1):

Trong đó

V₁ là thể tích dung dịch được sử dụng, tính bằng mililit (ml);

m là khối lượng mẫu, tính bằng milgam (mg);

8,81 là hệ số chuyển đổi;

100 là hệ số chuyển đổi để có được kết quả bằng phần trăm.

4.5. Dung dịch hiệu chuẩn

4.5.1. Dung dịch hiệu chuẩn axit ascorbic, r(C₆H₈O₆) = 5 µg/ml đến 50 µg/ml

Dùng pipet lấy 0,5 ml đến 5 ml dung dịch gốc axit ascorbic (4.4.1) cho vào bình định mức 100 ml và pha loãng bằng axit metaphosphoric (4.2.8) đến vạch. Chuẩn bị dung dịch mới trong ngày sử dụng.

4.5.2. Dung dịch hiệu chuẩn axit erythorbic (tùy chọn), r(C₆H₈O₆)

Dùng pipet lấy 1 ml dung dịch gốc axit erythorbic (4.4.2) cho vào bình định mức 100 ml và pha loãng bằng axit metaphosphoric (4.2.8) đến vạch. Dung dịch chuẩn này cần có nồng độ axit erythorbic từ 5 µg/ml đến 20 µg/ml. Chuẩn bị dung dịch mới trong ngày sử dụng.

5. Thiết bị, dụng cụ

5.1. Yêu cầu chung

Sử dụng các thiết bị phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.2. Máy đo phổ UV

Có thể đo các độ hấp thụ ở các bước sóng xác định.

5.3. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

Gồm có bơm, bộ bơm mẫu, detetor UV được cài đặt ở bước sóng 265 nm và có hệ thống đánh giá là bộ tích phân.

5.4. Cột HPLC

5.4.1. Yêu cầu chung

Có thể sử dụng các kích cỡ hoặc cỡ hạt khác với quy định trong tiêu chuẩn này. Các thông số tách cần phù hợp với vật liệu sử dụng để đảm bảo các kết quả tương đương. Tiêu chí thực hiện đối với các cột phân tích thích hợp là độ phân giải nền của axit L-ascorbic và axit erythorbic [3].

5.4.2. Cột phân tích

Cột phân tích, ví dụ Lichropher^® 100 RP[1]⁾ có cỡ hạt 5µm, đường kính 4,0 mm, dài 250 mm.

5.5. Dụng cụ lọc

Bộ lọc màng, ví dụ cỡ lỗ 0,2 µm hoặc 0,45 µm. Lọc pha động cũng như dung dịch mẫu thử qua bộ lọc màng, trước khi sử dụng hoặc trước khi bơm sẽ kéo thời gian sử dụng của cột.

6. Cách tiến hành

6.1. Yêu cầu chung

Các dung dịch chuẩn và các dung dịch mẫu cần phân tích càng sớm càng tốt, giữ nhiệt độ dưới 25°C trong suốt quá trình phân tích và loại bỏ sau 8h.

6.2. Chuẩn bị mẫu thử

Đồng hóa mẫu thử. Nghiền thô nguyên liệu trong máy thích hợp và trộn lại. Tiến hành phân tích ngay sau khi đồng hóa. Để chuẩn bị mẫu thử với rau và trái cây nguyên liệu, cần phải qua quá trình chiết (6.3.1).

6.3. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử

6.3.1. Chiết mẫu

Cân một lượng mẫu thích hợp, ví dụ: 3 g nếu hàm lượng vitamin C khoảng 50µg/100g, chính xác đến 1mg, cho vào bình định mức 100ml. Thêm 80 ml dung dịch axit metaphosphoric (4.2.8) và lắc bình. Thêm axit metaphosphoric đến vạch, lắc và lọc để thu được dung dịch chiết mẫu.

Đối với rau và trái cây nguyên liệu, dùng dao để thái nhỏ, trộn và cân một lượng mẫu thích hợp, chính xác đến miligam, ví dụ: từ 2 đến 10 g mẫu thử cho trực tiếp vào trong cốc có mỏ 100 ml có chứa axit metaphosphoric (4.2.8). Đồng hóa rồi chuyển định lượng vào bình định mức 100 ml. Lắc và lọc để thu được dịch chiết mẫu.

CHÚ THÍCH: Có thể tăng tính ổn định của dung dịch axit ascorbic, ví dụ bằng cách bổ sung 125 ml dung dịch cystein (4.2.10) hoặc dithitheitol (DTTA) hoặc axit phosphoric triamin diethylen (DTPA) vào dung dịch axit metaphosphoric. Tuy nhiên, các chất ổn định này có thể ảnh hưởng đến phép sắc ký và chưa được sử dụng cho phép thử liên phòng thử nghiệm.

6.3.2. Bước khử

Cho ngay 20 ml dung dịch mẫu chiết (6.3.1) vào cốc có mỏ 50 ml. Thêm 10 ml dung dịch L-cystein (4.2.10). Khuấy dung dịch bằng que khuấy từ và chỉnh pH đến khoảng 7,0 và 7,2 bằng cách thêm dung dịch trinatri phosphat (4.2.9) và khuấy đúng 5 min. Sau đó giảm pH đến khoảng từ 2,5 đến 2,8 bằng cách thêm dung dịch axit metaphosphoric (4.2.7). Chuyển định lượng sang bình định mức 50 ml, tráng rửa điện cực, que khuấy từ và cốc có mỏ bằng nước. Thêm nước đến vạch. Lọc qua bộ lọc màng (5.5), sử dụng dịch lọc này để phân tích sắc ký.

Nếu mẫu có chứa các chất làm đặc hoặc chất làm rắn thì làm kết tủa chúng để tránh làm tắc nghẽn cột. Trong trường hợp đó, thêm 1 ml metanol (4.2.6) vào 4 ml dung dịch mẫu khử. Lọc qua bộ lọc màng (5.5), sử dụng dịch lọc này để phân tích sắc ký.

6.4. Nhận biết

Nhận biết axit L-ascorbic bằng cách so sánh thời gian lưu của các pic riêng rẽ trong sắc ký đồ thu được từ dung dịch mẫu thử và dung dịch chuẩn. Việc nhận biết pic cũng có thể được thực hiện bằng cách thêm chuẩn vào dung dịch mẫu thử.

Việc tách và định lượng được chứng minh là thỏa mãn nếu các điều kiện thực nghiệm sau đây được thực hiện (xem Hình Α.1). Các điều kiện sau đây được sử dụng trong nghiên cứu liên phòng thử nghiệm:

Quy trình này có thể được sử dụng để định lượng axit erythorbic không được tính là vitamin C.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng các điều kiện sắc ký thích hợp khác như: pha động có 10% axetontril và 90% nước có chứa kali dihydro phosphat 13,6g/l và cetrimid 2g/l, cột C8 cỡ hạt 10µm, kích thước 250 mm x 4,6 mm và tốc độ dòng (1,0 ± 0,1) ml/min.

6.5. Xác định

Tùy thuộc vào hệ thống, bơm các thể tích thích hợp (không quá 50 µl) dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu thử vào hệ thống HPLC. Tiến hành xác định hiệu chuẩn dùng phương pháp ngoại chuẩn, tích phân các diện tích pic hoặc chiều cao pic, so sánh kết quả với các giá trị tương ứng của chất chuẩn hoặc sử dụng đường chuẩn. Kiểm tra độ tuyến tính của đường chuẩn.

7. Tính kết quả

Tính theo đường chuẩn hoặc sử dụng các chương trình thích hợp của bộ tích phân hoặc sử dụng công thức giản lược sau đây.

Tính phần khối lượng của axit ascorbic, w, bằng miligam trên 100 g (mg/100g) mẫu, theo Công thức (2) sau đây:

                     (2)

Trong đó:

A_s là diện tích pic hoặc chiều cao pic của axit L-ascorbic thu được với dung dịch mẫu thử (6.3.2), tính bằng đơn vị chiều cao hoặc diện tích.

A_st là diện tích pic hoặc chiều cao pic của axit L-ascorbic thu được với dung dịch hiệu chuẩn (4.5.1), tính bằng đơn vị chiều cao hoặc diện tích;

r là nồng độ của axit L-ascorbic trong dung dịch chuẩn, tính bằng microgam trên mililit (µg/ml);

m là khối lượng mẫu, tính bằng gam (g);

V là tổng thể tích dung dịch mẫu thử (6.3.1) trước bước khử, tính bằng mililit (ml);

F là hệ số pha loãng của bước khử (trong trường hợp này là 2,5);

1000 là hệ số chuyển đổi miligam thành gam.

100 là hệ số để tính hàm lượng trên 100 g;

Báo cáo kết quả vitamin C bằng miligam trên 100g (mg/100g).

Nếu có bước kết tủa (6.3.2), thì trong Công thức (2) phải nhân với 5/4.

8. Độ chụm

8.1. Yêu cầu chung

Dữ liệu về độ chụm của phép xác định vitamin C được thiết lập năm 1997 từ phép thử liên phòng thử nghiệm phù hợp với ISO 5725 do Arella et al. thực hiện [2], [4]. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ phân tích và chất nền khác với dải nồng độ và chất nền nêu trong Phụ lục B.

8.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ, thu được khi tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5% các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại r.

Các giá trị đối với tổng số vitamin C là:

Nước cam	= 54,6 mg/100g	r = 6,4 mg/100g
Xúp lỏng	= 35,6 mg/100g	r = 3,7 mg/100g
Sữa bột	= 100,3 mg/100g	r = 17,9 mg/100g
Xúp đông khô	= 169,3 mg/100g	r = 42,0 mg/100g
Ngũ cốc ăn nhanh	= 102,6 mg/100g	r = 28,7 mg/100g
Thức ăn cho trẻ nhỏ từ trái cây	= 47,1mg/100g	r = 7,1 mg/100g

8.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử riêng rẽ, thu được bởi hai phòng thử nghiệm khi tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, không quá 5% các trường hợp vượt quá giới hạn tái lập R.

Các giá trị đối với tổng số vitamin C là:

Nước cam	= 54,6 mg/100g	R = 30,3 mg/100g
Xúp lỏng	= 35,6 mg/100g	R = 21,7 mg/100g
Sữa bột	= 100,3 mg/100g	R = 32,2 mg/100g
Xúp đông khô	= 169,3 mg/100g	R = 74,3 mg/100g
Ngũ cốc ăn nhanh	= 102,6 mg/100g	R = 56,2 mg/100g
Thức ăn cho trẻ nhỏ từ trái cây	= 47,1mg/100g	R = 23,9 mg/100g

9. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm ít nhất phải bao gồm các thông tin sau đây:

a) mọi thông tin cần thiết thiết nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) viện dẫn tiêu chuẩn này hoặc phương pháp thử đã sử dụng;

c) ngày và quy trình lấy mẫu (nếu có);

d) ngày nhận mẫu;

e) ngày thử nghiệm;

f) các kết quả và các đơn vị biểu thị kết quả;

g) các điểm đặc biệt quan sát được trong khi tiến hành thử nghiệm;

h) mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy chọn có thể ảnh hưởng đến kết quả.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Ví dụ về sắc ký đồ

CHÚ DẪN

a) axit L-ascorbic

b) thời gian

Hình Α.1 – Ví dụ về định lượng axit ascorbic trong nước cam bằng HPLC

Điều kiện vận hành:

Phụ lục B

(Tham khảo)

Dữ liệu về độ chụm

Trong Bảng B.1 đưa ra các thông số về độ chụm đã được xác định trong nghiên cứu cộng tác [2], [4]. Trong phép thử liên phòng này, các dữ liệu thu được bằng cách bỏ qua các bước khử.

CHÚ THÍCH: Sau khi thực hiện các thử nghiệm này, ISO 5725:1986 đã được thay thế bằng ISO 5725-1, ISO 5725-2, ISO 5725-3, ISO 5725-4 và ISO 5725-6 (tất cả xuất bản năm 1994) và ISO 5725-5:1998.

Bảng B.1 – Dữ liệu về độ chụm đối với vitamin C

Mẫu	1	2	3	4	5	6
Năm thử nghiệm	1997	1997	1997	1997	1997	1997
Số lượng phòng thử nghiệm	15	15	15	15	15	15
Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ	14	15	14	14	14	14
Số lượng kết quả được giữ lại	28	30	28	28	28	28
Giá trị trung bình, (mg/100g)	54,6	35,6	100,3	169,3	102,6	47,1
Độ lệch chuẩn lập lại, sr (mg/100g)	2,3	1,3	6,3	14,8	10,2	2,5
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại,%	4,2	3,6	6,3	8,8	9,9	5,3
Độ lặp lại (2,8 x sr) (mg/100g)	6,4	3,7	17,9	42,0	28,7	7,1
Độ lệch chuẩn tái lập, SR (mg/100g)	10,7	7,7	11,4	26,2	19,8	8,5
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại	19,7%	21,6%	11,4%	15,5%	19,3%	18,0%
Độ tái lập (2,8 x sR) (mg/100g)	30,3	21,7	32,2	74,3	56,2	23,9
a 1 Nước cam, 2 xúp lỏng, 3 Sữa bột, 4 Xúp đông khô, 5 Ngũ cốc ăn nhanh, 6 Thức ăn cho trẻ nhỏ từ trái cây.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Dennison D.B., Brawley T.G., Hunter G.L.K., (1981), J. Agric. Food Chem., 29, 925-927.

[2] Arella F., Deborde J.L., Bourgulgnon J.B., Hasselmann C., (1997), Ann. Fals. Exp. Chim., 90. N°940:217-233.

[3] Coustard J.M., Sudraud G., (1981), Journal of Chromatography, 219. 388-342.

[4] ISO 5725:1986, Precision of test methods – Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests.