TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9050:2012 VỀ THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH XƠ TỔNG SỐ, XƠ HÒA TAN VÀ XƠ KHÔNG HÒA TAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ENZYM-KHỐI LƯỢNG

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 9050:2012

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH XƠ TỔNG SỐ, XƠ HÒA TAN VÀ XƠ KHÔNG HÒA TAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ENZYM-KHỐI LƯỢNG

Foodstuffs – Determination of total, soluble, and insoluble dietary fiber by enzymatic-gravimetric method

Lời nói đầu

TCVN 9050:2012 được xây dựng dựa trên cơ sở AOAC 991.43 Total, Soluble, and Insoluble Dietary Fiber in Foods. Enzymatic-Gravimetric Method, MES-TRIS Buffer;

TCVN 9050:2012 do Cục An toàn vệ sinh thực phẩm tổ chức biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH XƠ TỔNG SỐ, XƠ HÒA TAN VÀ XƠ KHÔNG HÒA TAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ENZYM-KHỐI LƯỢNG

Foodstuffs – Determination of total, soluble, and insoluble dietary fiber by enzymatic-gravimetric method

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp enzym-khối lượng để xác định hàm lượng xơ tổng số, xơ hòa tan và xơ không hòa tan trong thực phẩm chế biến, ngũ cốc và sản phẩm ngũ cốc, rau và quả.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

AOAC 960.52 Microchemical determination of nitrogen. Micro-Kjeldahl method (Xác định nitơ bằng phương pháp hóa học vi lượng. Phương pháp Kjeldahl vi lượng).

3. Nguyên tắc

Hai phần mẫu thử lặp lại của thực phẩm khô, nếu chứa hàm lượng chất béo lớn hơn 10 % thì chiết chất béo, sau đó được phân hủy bằng a-amylaza bền nhiệt, proteaza và amyloglucosidaza để loại tinh bột và protein.

Đối với chất xơ tổng số (TDF), dịch phân hủy bằng enzym được xử lí với etanol để làm kết tủa chất xơ hòa tan trước khi lọc và cặn TDF được rửa với etanol và axeton, sấy khô và cân. Đối với các chất xơ hòa tan (SDF) và không hòa tan (IDF), dịch phân hủy bằng enzym được lọc và cặn (IDF) được rửa bằng nước ấm, sấy khô và cân. Đối với SDF thì hỗn hợp dịch lọc với nước rửa được kết tủa với etanol, sau đó lọc rồi sấy khô và cân. Các giá trị TDF, IDF và SDF còn lại được hiệu chỉnh theo protein, tro và mẫu trắng.

4. Thuốc thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đã loại ion hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

4.1. Dung dịch etanol.

4.1.1. Dung dịch etanol, 95 %.

4.1.2. Dung dịch etanol, 85 %

Cho 895 ml etanol 95 % vào bình định mức 1 lít, thêm nước đến vạch.

4.1.3. Dung dịch etanol, 78 %

Cho 821 ml etanol 95 % vào bình định mức 1 lít, thêm nước đến vạch.

4.2. Dung dịch a-amylaza bền nhiệt, có hoạt độ:

a) (10 000 + 1 000) đơn vị/ml khi xác định bằng phương pháp sử dụng đường khử Nelson/Somogyi với cơ chất là tinh bột hòa tan (1 đơn vị là lượng enzym cần thiết để giải phóng 1 mmol đương lượng đường khử trong 1 min ở nhiệt độ 40 °C và pH 6,5).

b) (3 000 + 300) đơn vị Ceralpha/ml khi xác định bằng phương pháp Ceralpha sử dụng cơ chất r-nitrophenyl-maltosaccarit với sự có mặt của alpha-glucosidaza bền nhiệt (1 đơn vị là lượng enzym cần thiết để giải phóng 1 mmol r-nitrophenyl trong 1 min ở nhiệt độ 40 °C và pH 6,5).

Bảo quản dung dịch a-amylaza bền nhiệt ở nhiệt độ từ 0 °C đến 5 °C.

4.3. Proteaza, có hoạt độ:

a) từ 300 đơn vị/ml đến 400 đơn vị/ml khi xác định bằng phép thử casein [1 đơn vị proteaza là lượng enzym cần thiết để thủy phân 1 mmol đương lượng tyrosin trong 1 min từ casein hòa tan ở nhiệt độ 40 °C và pH 8,0] hoặc từ 7 đơn vị/mg đến 15 đơn vị/mg (1 đơn vị là lượng enzym thủy phân casein tạo màu tương đương với 1,0 mmol tyrosin trong 1 min ở nhiệt độ 37 °C và pH 7,5) (tạo màu do thuốc thử Folin-Ciocalteau).

b) từ 300 đơn vị/ml đến 400 đơn vị/ml khi xác định bằng phép thử azo-casein [1 đơn vị hoạt độ endo-peptidaza là lượng enzym cần thiết để thủy phân 1 mmol đương lượng tyrosin trong 1 min từ casein hòa tan ở nhiệt độ 40 °C và pH 8,0].

Chuẩn bị 50 mg/ml dung dịch enzym trong dung dịch đệm MES-TRIS được chuẩn bị mới trong ngày sử dụng. Bảo quản dung dịch này ở nhiệt độ từ 0 °C đến 5 °C.

4.4. Amyloglucosidaza, có hoạt độ:

a) từ 2 000 đơn vị/ml đến 3300 đơn vị/ml khi xác định bằng phương pháp tinh bột/glucoza oxidaza- peroxidaza (1 đơn vị hoạt độ enzym là lượng enzym cần thiết để giải phóng 1 mmol glucoza trong 1 min ở nhiệt độ 40 °C và pH 4,5).

b) từ 130 đơn vị/ml đến 200 đơn vị/ml 2 khi xác định bằng phương pháp PNPBM (p-nitrophenyl beta-maltosidaza) [1 đơn vị hoạt độ enzym (đơn vị PNP) là lượng enzym cần thiết để giải phóng 1 mmol p-nitrophenyl từ p-nitrophenyl-beta maltosidaza trong 1 min ở nhiệt độ 40 °C khi có mặt các lượng dư beta-glucosidaza].

Bảo quản dung dịch amyloglucosidaza ở nhiệt độ từ 0 °C đến 5 °C.

CHÚ THÍCH: Chỉ có amyloglucosidaza là enzym bị nhiễm bẩn đáng kể, gây nhiều hoạt động. Alpha-amylaza bền nhiệt và proteaza từ các nguồn thương mại thường không có các enzym gây nhiễu. Các mức thấp của beta-glucanaza đã được phát hiện trong các chế phẩm proteaza, nhưng ở dưới mức có thể ảnh hưởng đến việc phân tích chất xơ tổng số. Chất nhiễm bẩn chính trong chế phẩm amyloglucosidaza là endo-xelulaza và là kết quả khử polyme-endo của hỗn hợp liên kết beta-glucan từ lúa mạch và yến mạch, làm giảm kết quả tính hàm lượng chất xơ. Sự nhiễm bẩn endo-cellulaza (beta-glucanaza) trong amyloglucosidaza có thể dễ dàng phát hiện. Ngoài ra, có các loại kit thử có chứa tất cả 3 enzym (được thử nghiệm trước) có sẵn trên thị trường.

LƯU Ý: Đối với các chế phẩm enzym từ 4.2 đến 4.4, để đảm bảo có mặt các hoạt tính enzym mong muốn cũng như không có mặt các hoạt tính enzym không mong muốn, cần chạy các chất chuẩn nêu trong Phụ lục A mỗi khi thay đổi lô enzym hoặc tối đa sáu tháng một lần.

4.5. Diatomit, celite được rửa bằng axit.

4.6. Dung dịch rửa

Chất tẩy rửa phòng thử nghiệm dạng lỏng, được dùng để làm sạch. Chuẩn bị bằng cách hòa 2 % dung dịch này trong nước.

4.7. MES, axit 2-(n-morpholino)etansulfonic.

4.8. TRIS, tris (hydroxymetyl)aminometan.

4.9. Dung dịch đệm MES-TRIS, MES 0,05 M và TRIS 0,05 M, pH 8,2 ở 24 °C

Hòa tan 19,52 g MES và 12,2 g TRIS trong 1700 ml nước đựng trong bình định mức 2 000 ml. Chỉnh pH đến 8,2 bằng dung dịch natri hydroxit 6 M và thêm nước đến vạch.

CHÚ THÍCH: Cần phải chỉnh pH đến 8,2 ở 24 °C. Tuy nhiên, nếu nhiệt độ của dung dịch đệm là 20 °C thì chỉnh pH đến 8,3, nếu nhiệt độ là 28 °C thì chỉnh pH đến 8,1. Chỉnh độ lệch trong khoảng từ 20 °C đến 28 °C bằng cách nội suy.

4.10. Dung dịch axit clohydric, 0,561 M

Cho 93,5 ml dung dịch HCI 6 M vào khoảng 700 ml nước đựng trong bình định mức 1 000 ml. Thêm nước đến vạch.

4.11. Dung dịch axit clohydric, 1 M.

4.12. Dung dịch natri hydroxit, 1 M.

4.13. Axeton.

5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể các thiết bị, dụng cụ sau:

5.1. Cốc có mỏ, dung tích 400 ml hoặc 600 ml.

5.2. Chén lọc, bằng đĩa xốp, cỡ lỗ từ 40 mm đến 60 mm, dung tích 60 ml (ví dụ: Pyrex 60 ml), được chuẩn bị như sau:

Nung qua đêm ở nhiệt độ 525 °C trong lò múp. Để nhiệt độ của lò giảm xuống dưới 130 °C trước khi lấy chén ra. Ngâm chén lọc 1 h trong dung dịch làm sạch 2 % (4.6) ở nhiệt độ phòng. Rửa sạch bằng nước và sau đó tráng lại bằng nước đã loại ion, tráng lần cuối cùng bằng 15 ml axeton và sau đó để khô trong không khí. Thêm khoảng 1,0 g celite vào chén lọc khô và sấy khô ở 130 °C đến khối lượng không đổi. Làm nguội chén lọc 1 h trong bình hút ẩm và cân chén cùng với celite, chính xác đến 0,1 mg.

5.3. Hệ thống hút chân không

Gồm có bơm chân không hoặc bộ hút chân không có bộ phận điều chỉnh. Bình cầu lọc có tay cầm bên cạnh, dung tích 1 lít. Có gioăng cao su để làm kín bình lọc.

5.4. Nồi cách thủy lắc, có thể duy trì nhiệt độ ở 98 °C ± 2 °C, có cài đặt tự động thời gian bật-tắt.

5.5. Nồi cách thủy lắc, có thể duy trì nhiệt độ ổn định ở 60 °C.

5.6. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến ± 0,1 mg.

5.7. Lò múp, có thể duy trì nhiệt độ ở 525 °C ± 5 °C.

5.8. Tủ sấy, có thể duy trì nhiệt độ ở 105 °C và 130 °C ± 3 °C.

5.9. Tủ sấy chân không, có thể duy trì nhiệt độ ở 70 °C.

5.10. Bình hút ẩm, có chất làm khô silic dioxit, hoặc loại tương đương. Cứ hai tuần, sấy chất làm khô qua đêm ở 130 °C.

5.11. Máy đo pH, có bù nhiệt, được chuẩn hóa bằng các dung dịch đệm pH 4,0, 7,0 và 10,0.

5.12. Pipet, có các đầu tip dùng một lần, dung tích 100 ml đến 300 ml và 5 ml.

5.13. Bộ phận phân phối, có thể phân phối 15 ml ± 0,5 ml etanol 78 %, etanol 95 % và axeton, 40 ml ± 0,5 ml dung dịch đệm.

5.14. Máy khuấy từ và thanh khuấy từ.

5.15. Bình định mức một vạch, dung tích 1 000 ml và 2 000 ml.

6. Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

7. Cách tiến hành

7.1. Chuẩn bị mẫu thử

Đồng hóa mẫu thử nghiệm và sấy khô qua đêm trong tủ sấy chân không ở 70 °C (5.9) hoặc trong tủ sấy ở 105 °C (5.8), làm nguội trong bình hút ẩm (5.10) và nghiền mẫu đến cỡ hạt từ 0,3 mm đến 0,5 mm.

Nếu mẫu thử không thể làm nóng được thì làm đông khô trước khi nghiền.

Nếu hàm lượng chất béo lớn hơn 10 % gây khó khăn cho việc nghiền mẫu thì loại bớt chất béo bằng ete dầu mỏ (chiết 3 lần, mỗi lần dùng 25 ml cho mỗi gam mẫu thử) trước khi nghiền. Ghi lại hao hụt khối lượng do loại bỏ chất béo và hiệu chỉnh thích hợp cho chất xơ cuối cùng thu được.

Bảo quản mẫu đã nghiền nhỏ trong bình hút ẩm cho đến khi tiến hành phân tích.

Đối với các mẫu có hàm lượng đường cao thì loại đường trước khi xác định hàm lượng xơ bằng cách chiết mỗi mẫu khoảng 2 lần đến 3 lần, mỗi lần dùng 10 ml etanol 85 % (4.1.2) cho mỗi gam mẫu thử, gạn và sấy khô qua đêm ở nhiệt độ 40 °C.

7.2. Phép thử trắng

Chạy hai phép thử trắng cho một phép xác định để kiểm tra phần cặn của thuốc thử.

7.3. Phân hủy mẫu thử

Cân lặp lại hai lần mỗi lần 1,000 g ± 0,005 g mẫu thử (m₁ và m₂), chính xác đến 0,1 mg, cho vào cốc có mỏ 400 ml (hoặc 600 ml) (5.1). Thêm 40 ml dung dịch đệm MES-TRIS pH 8,2 (4.9). Khuấy trên máy khuấy từ (5.14) cho đến khi dung dịch mẫu phân tán hoàn toàn (nếu tạo thành các màng thì mẫu thử sẽ không thể tiếp xúc được với các enzym).

Thêm 50 ml dung dịch a-amylaza bền nhiệt (4.2), khuấy với tốc độ thấp. Đậy cốc có mỏ bằng lá nhôm và ủ trong nồi cách thủy (5.4) ở nhiệt độ từ 95 °C đến 100 °C khoảng 15 min trong khi vẫn khuấy liên tục. Bắt đầu tính thời gian khi nồi cách thủy đạt nhiệt độ 95 °C (thường khoảng 35 min là đủ).

Lấy các cốc có mỏ ra khỏi nồi cách thủy và để nguội đến 60 °C. Tháo lá nhôm ra. Dùng thìa để lấy hết phía bên trong cốc và phần dưới đáy cốc. Tráng rửa thành cốc và thìa bằng 10 ml nước.

Thêm 100 ml dung dịch proteaza (4.3) vào mỗi cốc. Đậy cốc bằng lá nhôm và ủ trong nồi cách thủy (5.5) 30 min ở 60 °C ± 1 °C trong khi vẫn khuấy liên tục. Bắt đầu tính thời gian khi nồi cách thủy đạt nhiệt độ 60 °C.

Tháo lá nhôm ra, dùng bộ phân phối (5.13) lấy 5 ml dung dịch axit clohydric 0,561 M (4.10) vào mỗi cốc trong khi vẫn khuấy. Chỉnh pH đến khoảng từ 4,0 đến 4,7 ở 60 °C bằng dung dịch NaOH 1 M (4.12) hoặc dung dịch HCl 1 M (4.11).

CHÚ Ý: Cần kiểm tra và điều chỉnh độ pH trong khi các dung dịch ở nhiệt độ 60 °C vì pH sẽ tăng lên ở nhiệt độ thấp hơn. Hầu hết các mẫu ngũ cốc, sản phẩm dạng hạt và các sản phẩm rau không cần điều chỉnh pH. Kiểm tra thường xuyên pH của mẫu trắng, nếu nằm ngoài khoảng pH thích hợp thì kiểm tra các dung dịch thử.

Thêm 300 ml dung dịch amyloglucosidaza (4.4) trong khi vẫn khuấy. Tháo lá nhôm ra và ủ trong nồi cách thủy (5.5) 30 min ở nhiệt độ 60 °C ± 1 °C trong khi vẫn khuấy liên tục. Bắt đầu tính thời gian khi nồi cách thủy đạt nhiệt độ 60 °C.

7.4. Xác định

7.4.1. Xác định xơ tổng số

Thêm 225 ml etanol 95 % (4.1.1) sau khi làm nóng ở nhiệt độ 60 °C vào từng dung dịch mẫu thử đã phân hủy. Tỉ lệ giữa etanol và dung dịch mẫu thử là 4:1. Lấy cốc có mỏ ra khỏi nồi cách thủy và đậy cốc bằng tấm lá nhôm lớn. Để cho hình thành kết tủa trong 1 h ở nhiệt độ phòng.

Làm ướt và phân phối lại celite dưới đáy trong chén lọc đã cân trước đó (5.2), sử dụng 15 ml etanol 78 % (4.1.3) từ chai rửa. Rút celite đều sang thủy tinh xốp bằng cách hút vào chén.

Lọc dịch phân hủy enzym đã xử lí bằng etanol sang chén lọc. Sử dụng chai rửa với etanol 78 % và dao trộn bằng cao su, để chuyển định lượng tất cả các hạt còn lại sang chén lọc.

CHÚ THÍCH: Nếu mẫu thử tạo thành keo, giữ lại chất lỏng thì dùng dao trộn để phá vỡ.

Sử dụng bộ lọc chân không, rửa cặn hai lượt, mỗi lượt dùng các phần 15 ml của từng dung dịch etanol 78 % (4.1.3), etanol 95 % (4.1.1) và axeton (4.13). Sấy khô chén lọc cùng với cặn qua đêm trong tủ sấy (5.8) ở 105 °C. Làm nguội chén lọc 1 h trong bình hút ẩm (5.10). Cân chén lọc cùng với lượng chất xơ và celite, chính xác đến 0,1 mg và tính khối lượng còn lại bằng cách trừ đi khối lượng của chén lọc với celite.

Dùng một trong hai phần mẫu kép để xác định hàm lượng protein theo AOAC 960.52, sử dụng hệ số chuyển đổi N x 6,25. Để phân tích tro, nung mẫu kép thứ hai trong 5 h ở 525 °C. Làm nguội trong bình hút ẩm, cân chính xác đến 0,1 mg. Lấy khối lượng thu được trừ đi khối lượng của chén và celite để xác định khối lượng tro.

7.4.2. Xác định xơ không hòa tan

Làm ướt và phân phối lại celite dưới đáy trong chén lọc đã cân trước (5.2), sử dụng khoảng 3 ml nước. Rút celite đều sang thủy tinh xốp bằng cách hút vào chén.

Lọc dịch phân hủy enzym (Điều 6) qua chén lọc sang bình lọc. Tráng rửa cốc có mỏ và tráng rửa cặn 2 lần bằng 10 ml nước ở 70 °C. Gộp dịch lọc và nước rửa, chuyển vào cốc có mỏ 600 ml (5.1) đã cân trước và giữ lại để xác định xơ hòa tan.

Sử dụng bộ lọc chân không, rửa cặn hai lượt, mỗi lượt dùng các phần 15 ml của từng dung dịch etanol 78 % (4.1.3), etanol 95 % (4.1.1) và axeton (4.13).

CHÚ THÍCH: Nếu không rửa cặn IDF bằng etanol 78 %, etanol 95 % và axeton thì giá trị IDF thu được có thể cao hơn.

Sử dụng các mẫu kép để xác định hàm lượng protein và tro theo 7.4.1.

7.4.3. Xác định xơ hòa tan

Tiến hành như phép xác định chất xơ không hòa tan đến bước kết hợp dịch lọc và rửa nước vào cốc có mỏ 600 ml (5.1) đã cân trước. Cân cốc có mỏ với hỗn hợp đã gộp của dịch lọc và nước và ước tính các thể tích.

Thêm 4 thể tích etanol 95 % đã làm nóng sơ bộ đến 60 °C. Sử dụng phần etanol 60 °C để rửa bình lọc từ phép xác định chất xơ không hòa tan (IDF). Ngoài ra, chỉnh lượng hỗn hợp của dịch lọc và nước đến 80 g bằng cách bổ sung nước và thêm 320 ml etanol 95 % ở nhiệt độ 60 °C. Để hình thành kết tủa 1 h ở nhiệt độ phòng.

Thực hiện tiếp như phép xác định xơ tổng số 7.4.1, từ đoạn “làm ướt và phân phối lại celite…”.

8. Tính kết quả

8.1. Hàm lượng xơ không hòa tan

Hàm lượng xơ không hòa tan, X_IDF, tính bằng gam trên 100 g (g/100 g), theo công thức (1):

                                                (1)

Trong đó:

m₁ và m₂ là khối lượng của các phần mẫu thử (xem 7.3), tính bằng miligam (mg);

m_R1 và m_R2 là khối lượng cặn của các phần mẫu thử (xem 7.4.2), tính bằng miligam (mg);

m_P và m_A là khối lượng của protein và tro tương ứng, xác định được trên các cặn của mẫu thử thứ nhất và thứ hai, tính bằng miligam (mg);

m_B là khối lượng xơ không hòa tan có trong cặn của thuốc thử, tính bằng miligam (mg), được tính từ phép thử trắng theo công thức (2):

                                                             (2)

Trong đó:

m_BR1 và m_BR2 là khối lượng cặn, đối với các phép thử trắng, tính bằng miligam (mg);

m_BP và m_BA là khối lượng tương ứng của protein và tro, xác định được trên các cặn của mẫu trắng lần thứ nhất và lần thứ hai, tính bằng miligam (mg).

8.2. Hàm lượng xơ hòa tan

Hàm lượng xơ hòa tan, X_SDF, tính bằng gam trên 100 g (g/100 g), xác định tương tự như xơ không hòa tan theo công thức (1).

8.3. Hàm lượng xơ tổng số

Hàm lượng xơ tổng số, X_TDF, tính bằng gam trên 100 g (g/100 g), được xác định bằng cách phân tích độc lập như trong 7.4.1 [sử dụng công thức (1)] hoặc bằng cách tổng hợp X_IDF và X_SDF, như trong 7.4.2 và 7.4.3.

9. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

– mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

– phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

– phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

– mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

– kết quả thử nghiệm thu được.

Phụ lục A

(Quy định)

Các chuẩn để kiểm tra hoạt độ của enzym

Bảng A.1 – Các chuẩn để kiểm tra hoạt độ của enzym

Phụ lục B

(Tham khảo)

Các chi tiết về phép thử liên phòng thử nghiệm

Bảng B.1 – Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm về xơ tổng số, xơ hòa tan và xơ không hòa tan trong thực phẩm (tính theo khối lượng tươi), bằng phương pháp enzym-khối lượng, sử dụng chất đệm MES-TRIS

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Lee, S.C., Prosky, L., & DeVries, J.W.: Determination of total, soluble, and insoluble dietary fiber in foods, J. AOAC Int., 75, 395(1992).