TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9130:2011 (ISO 14902:2011) VỀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ CHẤT ỨC CHẾ TRYPSIN TRONG CÁC SẢN PHẨM ĐẬU TƯƠNG

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 9130:2011

THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ CHẤT ỨC CHẾ TRYPSIN TRONG CÁC SẢN PHẨM ĐẬU TƯƠNG

Aminal feeding stuffs – Determination of trypsin inhibitor activity of soya products

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hoạt độ chất ức chế trypsin (TIA) trong các sản phẩm đậu tương.

Hoạt độ chất ức chế trypsin này biểu thị mức độ rang của các sản phẩm.

Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,5 mg/g.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987) Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

3. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau đây:

3.1. Hoạt độ chất ức chế trypsin (trypsin inhibitor activity)

TIA

Khối lượng của trypsin bị ức chế chia cho khối lượng của mẫu thử xác định được theo quy trình quy định trong tiêu chuẩn này.

CHÚ THÍCH: Hoạt độ chất ức chế trypsin được biểu thị bằng miligam trên gam.

4. Nguyên tắc

Chất ức chế trypsin được chiết khỏi mẫu ở pH 9,5.

Hoạt độ trypsin còn lại được đo bằng cách bổ sung cơ chất benzoyl-L-arginine-p-nitroanilide (L-BAPA). Lượng p-nitroanilin giải phóng được đo bằng phương pháp đo phổ.

5. Thuốc thử và vật liệu thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử đạt chất lượng tinh khiết phân tích.

5.1. Nước, ít nhất phải là loại 3 theo TCVN 4851 (ISO 3696).

5.2. Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = 0,01 mol/l.

5.3. Axit clohydric, c(HCl) = 6 mol/l.

5.4. Axit clohydric, c(HCl) = 1 mol/l.

5.5. Axit clohydric, c(HCl) = 0,1 mol/l.

5.6. Axit clohydric, c(HCl) = 0,001 mol/l.

5.7. Axit axetic, c(CH₃COOH) = 5,3 mol/l.

5.8. Canxi clorua ngậm hai phân tử nước, CaCl₂.2H₂O.

5.9. Dung dịch canxi clorua trong axit clohydric.

Hòa tan 735 mg canxi clorua ngậm hai phân tử nước (5.8) trong 1 lít axit clohydric (5.6) và kiểm tra pH. pH phải đạt 3,0 ± 0,1.

5.10. Trypsin bò (Merck No. 24579 hoặc loại tương đương).1)

Xem 9.4 đối với phép đo hoạt độ. Bảo quản trong tủ lạnh (6.3).

5.11. Dung dịch gốc trypsin

Để trypsin (5.10) đạt đến nhiệt độ phòng. Hòa tan 27,0 mg trypsin trong dung dịch canxi clorua (5.9) trong bình định mức 100 ml (6.1) và pha loãng đến vạch bằng dung dịch canxi clorua. Phần lớn các dung dịch này có thể sử dụng được trong 5 ngày khi được bảo quản trong tủ lạnh (6.3).

5.12. Dung dịch làm việc trypsin

Dùng pipet lấy 5 ml dung dịch gốc trypsin (5.11) cho vào bình định mức 100 ml (6.1) và pha loãng đến vạch bằng dung dịch canxi clorua (5.9).

5.13. Benzoyl-L-arginine-p-nitroanilide (L-BAPA).

5.14. Tris-(hydroxymethyl) aminomethane (Tris).

5.15. Dimethyl sulfoxide (DMSO).

5.16. Dung dịch đệm Tris/canxi clorua

Hòa tan 6,05 g Tris (5.14) và 735 mg canxi clorua (5.8) bằng 900 ml nước đựng trong ống đong chia độ 1 lít. Chỉnh pH đến 8,2 ± 0,1 bằng axit clohydric (5.3) và pha loãng đến 1 lít bằng nước.

5.17. Thuốc thử L-BAPA

Chuẩn bị thuốc thử này trong ngày sử dụng. Hòa tan 60 mg L-BAPA (5.13) trong 1 ml DMSO (5.15) vào bình định mức 100 ml (6.1) và pha loãng đến vạch bằng dung dịch đệm Tris/canxi clorua (5.16).

6. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

6.1. Bình định mức, dung tích 100 ml.

6.2. Cuvet, chiều dài đường quang 10 mm.

6.3. Tủ lạnh, kiểm soát được nhiệt độ ở (4 ± 3) ^oC.

6.4. Máy đo pH, có độ chính xác đến 0,05 đơn vị.

6.5. Máy trộn dùng cho ống nghiệm.

6.6. Máy đo phổ, thích hợp đo ở bước sóng 410 nm.

6.7. Đồng hồ bấm.

6.8. Nồi cách thủy, có bơm tuần hoàn, có khả năng duy trì nhiệt độ ở (37 ± 0,25) ^oC.

6.9. Máy nghiền, được trang bị sàng cỡ lỗ 0,5 mm.

6.10. Máy ly tâm, hoạt động ở gia tốc hướng tâm khoảng 1 500 g_n.

6.11. Ống ly tâm.

7. Lấy mẫu

Điều quan trọng là phòng thử nghiệm nhận đúng mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Phương pháp lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 4325 (ISO 6497) [5].

8. Chuẩn bị mẫu thử

Sử dụng máy nghiền (6.9), nghiền phần mẫu đại diện sao cho ít bị sinh nhiệt nhất. Trộn kỹ mẫu đã nghiền.

9. Cách tiến hành

9.1. Số lần xác định

Nếu cần kiểm tra sự thỏa mãn về giới hạn lặp lại (11.2), thì tiến hành hai phép xác định đơn lẻ theo 9.2 và 9.5 dưới các điều kiện lặp lại.

9.2. Chiết mẫu

Cân 1 g ± 0,001 g mẫu thử đã chuẩn bị (Điều 8) vào bình nón 100 ml và thêm 50 ml dung dịch natri hydroxit (5.2). Hòa mẫu thử. Chỉnh pH đến 9,5 ± 0,1 bằng axit clohydric (5.4 và 5.5). Tráng điện cực bằng lượng nước ít nhất có thể. Đậy bình nón và bảo quản qua đêm (15 h đến 24 h) trong tủ lạnh (6.3). Đặt trong tủ lạnh một lượng nước cần thiết để pha dịch chiết mẫu.

Chuyển dịch chiết mẫu sang bình định mức 100 ml (6.1), dùng nước được để trong tủ lạnh để pha loãng đến vạch và trộn. Bảo quản bình trong tủ lạnh. Dịch chiết mẫu bền được trong một ngày. Sau khi để lắng trong 15 min, dịch chiết mẫu có thể được sử dụng để phân tích và được pha loãng theo yêu cầu. Độ pha loãng tùy thuộc vào trị số TIA dự kiến trong mẫu và được pha loãng bằng nước ở nhiệt độ phòng.

9.3. Pha loãng dịch chiết mẫu

Ước tính trị số TIA của mẫu và chuẩn bị ba độ pha loãng khác nhau của dịch chiết mẫu dựa vào sơ đồ pha loãng nêu trong Bảng A.1, sao cho có thể cho kết quả dự kiến của phép đo TIA (9.5) tại ít nhất một trong ba kết quả đo nằm trong dải từ 40% đến 60%.

Nếu ba kết quả không nằm trong phạm vi của dải này, thì phải ước tính lại và lặp lại cách tiến hành.

9.4. Đo hoạt độ trypsin của dung dịch làm việc

Kiểm tra hoạt độ trypsin (5.10) của từng mẻ. Chênh lệch giữa độ hấp thụ của dung dịch làm việc (5.12) và dung dịch trắng (A_r             A_br) cần bằng 0,380 ± 0,050. Nếu không, thì kiểm tra chất lượng của trysin (5.10). Lấy bình trypsin mới, nếu cần.

Dùng pipet để lấy các lượng sau đây cho vào ống ly tâm:

Trộn các lượng chứa trong các ống nghiệm bằng máy trộn dùng cho ống nghiệm (6.5) và đặt các ống này vào nồi cách thủy (6.8) trong 10 min, sau đó bổ sung như sau:

Trộn đều lượng chứa trong bình bằng máy trộn dùng cho ống nghiệm và để lại các ống ly tâm vào nồi cách thủy. Sau khi ủ ấm 10 min ± 5s, bổ sung như sau:

Trộn lượng chứa trong các ống nghiệm bằng máy trộn dùng cho ống nghiệm.

Ly tâm các ống nghiệm này 10 min trong máy ly tâm (6.10) ở gia tốc khoảng 1 500 g_n.

Đo độ hấp thụ của các dung dịch trong so với nước bằng máy đo phổ (6.6) ở 410 nm trong cuvet 10 mm (6.2).

Các dung dịch này bền được trong ít nhất 2 h.

9.5. Đo hoạt độ ức chế trypsin

Dùng pipet cho vào các ống ly tâm theo phương án sau đây.

Chuẩn bị cho mỗi độ pha loãng của dịch chiết mẫu (9.3), một dung dịch trắng tương ứng. Các dung dịch chiết mẫu và các dung dịch trắng tương ứng phải được thực hiện theo một quy trình, kể cả ly tâm.

Trộn các lượng chứa trong các ống nghiệm bằng máy trộn dùng cho ống nghiệm (6.5) và đặt ống vào nồi cách thủy (6.8) trong 10 min. Bổ sung như sau:

Trộn các lượng chứa trong ống bằng máy trộn dùng cho ống nghiệm (6.5) và đặt ống ly tâm trở lại nồi cách thủy (6.8). Sau khi ủ tấm 10 min ± 5 s, bổ sung như sau:

Trộn các lượng chứa trong các ống nghiệm bằng máy trộn dùng cho ống nghiệm.

Ly tâm các ống 10 min trong máy ly tâm (6.10) ở gia tốc khoảng 1 500 g_n.

Đo độ hấp thụ của các dung dịch trong suốt này so với nước bằng máy đo phổ (6.6) ở bước sóng 410 mm trong cuvet 10 mm (6.2).

Dung dịch này bền được ít nhất 2 h.

10. Tính kết quả

10.1. Phần trăm ức chế của các dung dịch chiết mẫu

Tính phần trăm ức chế của dung dịch chiết mẫu bằng công thức:

Trong đó:

i là phần trăm ức chế, tính bằng phần trăm (%);

A_r là độ hấp thụ của dung dịch bổ sung chất chuẩn;

A_br là độ hấp thụ của mẫu trắng bổ sung chất chuẩn;

A_s là độ hấp thụ của dung dịch bổ sung mẫu;

A_bs là độ hấp thụ của mẫu trắng có mẫu.

10.2. Hoạt độ chất ức chế trypsin

Tính hoạt độ chất ức chế trypsin, bằng miligam trypsin bị ức chế trên gam mẫu, theo công thức sau:

trong đó

TIA là hoạt độ chất ức chế trypsin, tính bằng miligam trên gam (mg/g);

i là phần trăm ức chế, tính bằng phần trăm (%);

m₀ là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g);

m₁ là khối lượng trypsin, tính bằng miligam (mg);

f₁ là độ pha loãng của dịch chiết mẫu [(100 ml x 100 ml)/V, trong đó V là thể tích lấy từ Bảng A.1, tính bằng mililít];

f₂ là hệ số chuyển đổi (2,8 x 10^-4) tùy thuộc vào độ tinh khiết của trypsin (56%, xem [1] và [2]) và tùy thuộc vào độ pha loãng của trypsin theo 5.11 và 5.12.

Làm tròn kết quả chính xác đến 0,1 mg/g.

11. Độ chụm

11.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm

Các chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp nêu trong Phụ lục B.

Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và chất nền khác với các dải nồng độ và chất nền đã nêu.

11.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn, không quá 5% các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại (r) được đề cập hoặc được tính từ Bảng 1.

Bảng 1 – Giới hạn lặp lại (r) và giới hạn tái lập (R)

11.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau do những người khác nhau thực hiện, trong hai phòng thử nghiệm khác nhau, không được quá 5% các trường hợp vượt quá giới hạn tái lập (R) được đề cập hoặc được nêu trong Bảng 1.

12. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải chỉ ra được:

– mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

– phương pháp lấy mẫu sử dụng, nếu biết;

– phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

– mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc tùy chọn cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng đến kết quả;

– kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếu độ lặp lại được kiểm tra thì nêu hai kết quả cuối cùng thu được.

Phụ lục A

(quy định)

Phương án pha loãng dịch chiết mẫu

Bảng A.1 đưa ra phương án pha loãng cần được thực hiện. Hình A.1 và A.2 đưa ra ví dụ về phương án pha loãng.

Bảng A.1 – Phương án pha loãng

Hình A.1 – Mối quan hệ giữa hoạt độ ức chế trypsin và độ pha loãng mẫu theo lý thuyết

Hình A.2 – Mối quan hệ giữa hoạt độ ức chế trypsin và độ pha loãng mẫu theo lý thuyết

Phụ lục B

(tham khảo)

Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm

Độ chụm của phương pháp được thiết lập vào năm 1998 bởi các phép thử liên phòng thử nghiệm tiến hành theo TCVN 6910-1 (ISO 5725-1) [3] và TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) [4] để xác định độ tái lập. Đối với phép xác định giới hạn lặp lại, có bảy phòng thử nghiệm thực hiện phân tích trên mẫu đậu tương lặp lại hai lần. Đối với phép xác định giới hạn tái lập, bảy phòng thử nghiệm thực hiện các phép phân tích riêng rẽ trên hai mẫu đậu tương và một mẫu hạt đậu tương rang.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] KAKADE M. L., SIMONS N., LIENER I. E. An Evaluation of Natural vs. synthetic Substrates for Measuring the Antitryptic Activity of Soybean Samples. Cereal Chem., 46, 1969, pp. 518-526.

[2] SMITH C., VAN MEGEN W., TWAALFHOVEN L., HITCHCOCK C. The Determination of Trypsin Inhibitor Levels in Foodstuffs. J. Sci. Food Agric., 31. 1980, pp. 341-350

[3] TCVN 6910-1:2001 (ISO 5725-1:1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung.

[4] TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2:1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.

[5] TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002), Thức ăn chăn nuôi – Lấy mẫu

[6] TCVN 6952:2001 (ISO 6498:1998), Thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử.