TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9513:2012 (EN 14663:2005) VỀ THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH VITAMIN B6 (BAO GỒM CÁC DẠNG GLYCOSYL) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 9513:2012

EN 14663:2005

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH VITAMIN B6 (BAO GỒM CÁC DẠNG GLYCOSYL) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Foodstuffs – Determination of vitamin B₆ (including its glycosylated forms) by HPLC

Lời nói đầu

TCVN 9513:2012 hoàn toàn tương đương với EN 14663:2005;

TCVN 9513:2012 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH VITAMIN B6 (BAO GỒM CÁC DẠNG GLYCOSYL) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Foodstuffs – Determination of vitamin B₆ (including its glycosylated forms) by HPLC

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định vitamin B6 trong thực phẩm bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Hàm lượng vitamin B₆ là tổng của pyridoxin, pyridoxal và pyridoxamin, bao gồm các dẫn xuất phosphoryl cũng như các dạng b-glycosyl của chúng, được tính theo pyridoxin.

Phương pháp này được đánh giá xác nhận trên bột tấm lõi có chứa sữa (thức ăn cho trẻ sơ sinh), khoai tây nghiền, rau trộn dăm bông (các sản phẩm ăn liền) và các loại đồ uống bổ sung multivitamin ở các mức từ 0,034 mg/100 g đến 1,21 mg/100 g.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau là rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhẩt, bao gồm cả các sửa đổi.

TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

3. Nguyên tắc

Pyridoxin, pyridoxamin và pyridoxal được chiết ra khỏi thực phẩm bằng thủy phân axit và tách phospho và glycosyl bằng enzym sử dụng phosphataza và b-glycosidaza trong axit.

Các dẫn xuất khác nhau của vitamin B₆ (pyridoxin. pyridoxamin và pyridoxal) được tách bằng HPLC vá định lượng bằng detector huỳnh quang [1]. [2]

4. Thuốc thử

4.1. Yêu cầu chung

Trong quá trình phân tích, chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước sử dụng là nước cất hai lần hoặc loại 1 được quy định trong TCVN 4851 (ISO 3696), trừ khi có quy định khác.

4.2. Dikali hydro phosphat, w(K₂HPO₄.3H₂O) ≥ 99,9 % khối lượng.

4.3. Natri axetat, không chứa tinh thể nước, w(CH₃COONa) ≥ 99,0 % khối lượng.

4.4. Axit tricloaxetic (TCA), w(CI₃CCOOH) ≥ 99,0 % khối lượng.

4.5. Dung dịch natri axetat, nồng độ chất c(CH₃COONa) = 2,5 mol/l.

Hòa tan 205 g natri axetat (4.3) trong 1 lít nước.

4.6. Thuốc thử sau cột (tùy chọn), dung dịch K₂HPO₄, _C(K₂HPO₄) = 0,15 mol/l.

Hòa tan 34,2 g dikali hydro phosphat (4.2) trong nước, pha loãng bằng nước đến 1 000 ml, trộn và loại khí.

4.7. Axit clohydric, c(HCI) = 1 mol/l.

4.8. Axit clohydric, c(HCI) = 0,1 mol/l.

4.9. Axit clohydric, c(HCI) = 0,2 mol/l.

4.10. Axit sulfuric, c(H₂SO₄) = 1 mol/l.

4.11. Dầu nhẹ, dải sôi từ 40 ^oC đến 60 ^oC.

4.12. Phosphataza trong axít, từ khoai tây, có hoạt độ enzym khoảng 5,3 U/mg1)

Enzym được sử dụng cần có hoạt độ phù hợp khi được kiểm tra theo 4.13.2, chi tiết xem [2], [7].

4.13. Dung dịch phosphataza trong axit

4.13.1. Yêu cầu chung

Hòa tan 60 mg phosphataza trong axit (4.12) vào 10 ml nước trong cốc có mỏ, bằng cách khuấy trong 2 min. Chuẩn bị dung dịch này trong ngày phân tích.

4.13.2. Kiểm tra hoạt độ của phosphataza trong axit

Cân 10 g thịt lợn, 5 g khoai tây nghiền hoặc 5 g bột cho vào cốc có mỏ rồi chiết bằng axit như trong 6.2.1. Thêm 1 ml dung dịch phosphataza trong axit (4.13.1) và 1 ml dung dịch b-glucosidaza (4.15) (tùy chọn) vào 12,5 ml dung dịch mẫu chiết được và trộn. Ủ dung dịch ít nhất 12 h hoặc qua đêm ở 37 ^oC trong khi vẫn khuấy liên tục. Lặp lại bước này với lượng dung dịch phosphataza trong axit lớn gấp đôi.

Xác định nồng độ khối lượng của các vitamin theo 6.6. Hoạt độ của enzym được sử dụng là đủ, nếu các nồng độ khối lượng của các hợp chất vitamin B6 tạo thành trong các dung dịch mẫu là tương đương. Sắc đồ không được có pic từ pyridoxamin phosphat.

CHÚ THÍCH: Trong phép thử liên phòng thử nghiệm, đã sử dụng phosphataza trong axit của hãng Sigma Nr p 3752¹⁾.

4.14. b-glucosidaza, từ quả hạnh. Hoạt độ enzym khoảng 3,2 U/mg.

Enzym được sử dụng cần có hoạt độ phù hợp khi được kiểm tra theo 4.15.2, chi tiết xem [2], [7].

4.15. Dung dịch b-glucosidaza

4.15.1. Yêu cầu chung

Hòa tan 100 mg b-glucosidaza (4.14) vào 10 ml nước trong cốc có mỏ, bằng cách khuấy trong 2 min. Chuẩn bị dung dịch này trong ngày phân tích.

4.15.2. Kiểm tra hoạt độ của b-glucosidaza

Cân 10 g thịt lợn, 5 g khoai tây nghiền hoặc 5 g bột cho vào cốc có mỏ rồi chiết bằng axit như trong 6.2.1. Thêm 1 ml dung dịch phosphataza trong axit (4.13.1) và 1 ml dung dịch b-glucosidaza (4.15.1) vào 12,5 ml dung dịch mẫu chiết được và trộn. Ủ dung dịch ít nhất 12 h hoặc qua đêm ở 37 ^oC trong khi vẫn khuấy liên tục. Lặp lại bước này với lượng dung dịch b-glucosidaza lớn gấp đôi.

Xác định nồng độ khối lượng của các hợp chất vitamin B₆ theo 6.6. Hoạt độ của enzym được sử dụng là đủ, nếu các nồng độ khối lượng của các hợp chất vitamin B₆ tạo thành trong các dung dịch mẫu là tương đương. Sắc đồ không được có pic pyridoxamin phosphat.

CHÚ THÍCH: Trong phép thử liên phòng thử nghiệm, đã sử dụng b-glucosidaza của hãng Sigma Nr G-03951)

4.16. Pha động dùng cho HPLC [axit sulfuric, c(H₂SO₄) = 0,015 mol/l có chứa 0,005 mol/l TCA]

Hòa tan 817 mg ± 5 mg axit tricloaxetic (4.4) trong 15 ml axit sulfuric 1 mol/l (4.10), chuyển sang bình định mức 1 000 ml, pha loãng bằng nước đến vạch, trộn và khử khí.

4.17. Dầu Silicon, để khử bọt.

4.18. Chất chuẩn

4.18.1. Yêu cầu chung

Pyridoxamin (PM). pyridoxal (PL) và pyridoxin (PN) có thể có được từ nhiều nhà cung cấp khác nhau. Độ tinh khiết của các chất này có thể khác nhau, do đó cần xác định nồng độ và độ tinh khiết của chúng (xem 4.19.4 và 4.20.7).

4.18.2. Pyridoxamin (PM) dihydro clorua, w(C₈H₁₂N₂O₂.2HCl) ≥ 98 %.

4.18.3. Pyridoxal (PL) hydro clorua, w(C₈H₉NO₃.HCI) ≥ 98 %.

4.18.4. Pyridoxin (PN) hydro clorua, w(C₈H₁₁NO₃.HCI) ≥ 98 %.

4.19. Dung dịch gốc

4.19.1. Dung dịch gốc pyridoxamin (PM), nồng độ khối lượng r(PM) khoảng 500 mg/ml

Hòa tan 71,7 mg pyridoxamin dihydro clorua (4.18.2) trong axit clohydric 0,1 mol/l (4.8) đựng trong bình định mức 100 ml và thêm axit clohydric 0,1 mol/l đến vạch. Dung dịch này khi được bảo quản ở 4 ^oC có thể bền đến một tuần hoặc ở – 18 ^oC có thể bền được hai tháng.

4.19.2. Dung dịch gốc pyridoxal (PL), nồng độ khối lượng r(PL) khoảng 500 mg/ml

Hòa tan 60,9 mg pyridoxal hydro clorua (4.18.3) trong axit clohydric 0,1 mol/l (4.8) đựng trong bình định mức 100 ml và thêm axit clohydric 0,1 mol/l đến vạch. Dung dịch này khi được bảo quản ở 4 ^oC có thể bền đến một tuần hoặc ở – 18 ^oC có thể bền được hai tháng.

4.19.3. Dung dịch gốc pyridoxin (PN), nồng độ khối lượng r(PN) khoảng 500 mg/ml

Hòa tan 60,8 mg pyridoxin hydro clorua (4.18.4) trong axit clohydric 0,1 mol/l (4.8) đựng trong bình định mức 100 ml và thêm axit clohydric 0,1 mol/l đến vạch. Dung dịch này khi được bảo quản ở 4 ^oC có thể bền đến một tuần hoặc ở – 18 ^oC có thể bền được hai tháng.

4.19.4 Phép kiểm tra nồng độ

Dùng pipet lấy các dung dịch gốc pyridoxamin (4.19.1), pyridoxal (4.19.2) và pyridoxin (4.19.3) tương ứng cho vào bình định mức 50 ml và thêm dung dịch axit clohydric 0,1 mol/l (4.8) đến vạch. Đo độ hấp thụ của các dung dịch trong cuvet thạch anh 1 cm dựa vào axit clohydric 0,1 mol/l ở bước sóng cực đại sử dụng máy đo phổ UV (xem Bảng 1).

Tính nồng độ khối lượng của từng hợp chất vitamin B₆, p_i, sử dụng hệ số tắt phân tử như trong Công thức (1):

(1)

Trong đó

p_i là nồng độ khối lượng của pyridoxamin, pyridoxal và pyridoxin tương ứng, tính bằng microgam trên mililit dung dịch gốc;

A là độ hấp thụ của các dung dịch pyridoxamin, pyridoxal và pyridoxin ở bước sóng cực đại l_max (xem Bảng 1);

ε_i là hệ số hấp thụ phân tử của PM, PL hoặc PN ở pH thích hợp được xác định trong Bảng 1;

M_i là khối lượng phân tử của các chất chuẩn PM, PL hoặc PN tương ứng được xác định trong Bảng 1;

V là hệ số pha loãng, trong trường hợp này V = 50;

F là hệ số để tính các hợp chất vitamin B₆ không chứa HCI.

Sử dụng các nồng độ khối lượng này để tính các nồng độ chính xác của 4.19.1 đến 4.19.3 và 4.20.1 đến 4.20.6.

Bảng 1 – Các ví dụ về hệ số tắt phân tử của các hợp chất vitamin B₆

4.20. Dung dịch chuẩn

4.20.1. Dung dịch chuẩn pyridoxamin (PM) I, r(PM) khoảng 10 mg/ml

Pha loãng 2 ml dung dịch gốc pyridoxamin (4.19.1) bằng axit clohydric 0,1 mol/l (4.8) đến 100 ml. Chuẩn bị dung dịch ngay trong ngày sử dụng.

4.20.2. Dung dịch chuẩn pyridoxal (PL) I, r (PL) khoảng 10 mg/ml

Pha loãng 2 ml dung dịch gốc pyridoxal (4.19.2) bằng axit clohydric 0,1 mol/l (4.8) đến 100 ml. Chuẩn bị dung dịch ngay trong ngày sử dụng.

4.20.3 Dung dịch chuẩn pyridoxin (PN) I, r (PL) khoảng 10 mg/ml

Pha loãng 2 ml dung dịch gốc pyridoxin (4.19.3) bằng axit clohydric 0,1 mol/l (4.8) đến 100 ml. Chuẩn bị dung dich ngay trong ngày sử dụng.

4.20.4 Dung dịch chuẩn pyridoxamin (PM) II, r (PM) khoảng 1 mg/ml

Pha loãng 10 ml dung dịch chuẩn PM I (4.20.1) bằng axit clohydric 0,1 mol/l (4.8) đến 100 ml. Chuẩn bị dung dịch ngay trong ngày sử dụng.

4.20.5. Dung dịch chuẩn pyridoxal (PL) II, p(PL) khoảng 1 mg/ml

Pha loãng 10 ml dung dịch chuẩn PL I (4.20.2) bằng axit clohydric 0,1 mol/l (4.8) đến 100 ml. Chuẩn bị dung dịch ngay trong ngày sử dụng.

4.20.6 Dung dịch chuẩn pyridoxin (PN) II, p (PN) khoảng 1 mg/ml

Pha loãng 10 ml dung dịch chuẩn PN I (4.20.3) bằng axit clohydric 0,1 mol/l (4.8) đến 100 ml. Chuẩn bị dung dịch ngay trong ngày sử dụng.

4.20.7. Kiểm tra độ tinh khiết sắc kí bằng HPLC

Độ tinh khiết của các chất chuẩn cỏ thể kiểm tra bằng HPLC như sau:

Bơm các thể tích thích hợp của các dung dịch chuẩn I của PM, PL và PN (4.20.1, 4.20.2 và 4.20.3) vào hệ thống HPLC và phân tích theo 6.4.

Tính độ tinh khiết của các chất chuẩn theo Công thức (2):

R_i =                             (2)

Trong đó:

R_i là độ tinh khiết của chất chuẩn i tính bằng phần trăm (%);

x_i là diện tích pic của chất chuẩn i;

B là tổng các diện tích pic của các chất nhiễm bẩn (không có pic của dung môi).

Độ tinh khiết sắc kí của các chất chuẩn cần ≥ 98 %, nếu không thì sử dụng các chất chuẩn mới hoặc chuẩn bị các dung dịch chuẩn mới.

4.21. Dung dịch hiệu chuẩn hỗn hợp, ví dụ r(PM, PL, PN) = 0,1 mg/ml đến 10 mg/ml

Dùng pipet lấy các thể tích thích hợp của các dung dịch gốc của PM, PL và PN (4.19.1 đến 4 19.3) hoặc các dung dịch chuẩn (4.20 1 đến 4.20.6) cho vào bình định mức 20 ml, pha loãng bằng axit clohydric 0,1 mol/l (4 8) đến 6,5 ml, nếu cần. Chỉnh pH đến 4,8 bằng dung dịch natri axetat 2,5 mol/l (4.5) và sau đó chỉnh pH đến 3,0 bằng axit sulfuric (4.10), pha loãng bằng nước đến vạch và trộn (dung dịch hiệu chuẩn). Nên sử dụng ít nhất ba điểm hiệu chuẩn. Các dung dịch hiệu chuẩn hỗn hợp có thể cần được pha loãng bằng pha động trước khi bơm vào HPLC, nếu cần.

5. Thiết bị, dụng cụ

5.1. Yêu cầu chung

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thủy tinh của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.2 Máy đo phổ UV, có thể đo độ hấp thụ ở các bước sóng xác định.

5.3 Thiết bị gia nhiệt

Thiết bị hấp áp lực và tủ sấy hoặc nồi cách thủy kèm theo bộ phận khuấy, của phòng thử nghiệm, có thể kiểm soát được nhiệt độ ở 37 ^oC.

5.4. Hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao

Gồm có bơm, bộ bơm mẫu, detector huỳnh quang có bước sóng kích thích ở 290 nm và bước sóng phát xạ ở 390 nm và có hệ thống đánh giá như bộ tích phân và thiết bị tạo dẫn xuất sau cột, tùy chọn.

5.5. Cột HPLC, ví dụ: cột pha đảo như:

Luna™ RP C₁₈, 5 mm1), cỡ hạt 5 mm, đường kính 4,0 mm, dài 250 mm2). Các ví dụ thích hợp khác được nêu trong Phụ lục B.

5.6. Dụng cụ lọc

Lọc pha động cũng như dung dịch mẫu thử qua bộ lọc màng, ví dụ cỡ lỗ 0,45 mm, trước khi sử dụng hoặc trước khi bơm sẽ kéo dài thời gian sử dụng của cột.

6. Cách tiến hành

6.1. Chuẩn bị mẫu thử

Cắt nhỏ và đồng hoá mẫu thử. Nghiền thô nguyên liệu trong máy nghiền thích hợp và trộn lại. Cần làm lạnh sơ bộ để tránh mẫu tiếp xúc với nhiệt độ cao trong thời gian dài. Tiến hành phân tích ngay sau khi mẫu được đồng hóa.

6.2. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử

6.2.1 Chiết mẫu

6.2.1.1 Yêu cầu chung

Đối với các mẫu chứa hàm lượng chất béo cao (> 25 %) thì cần loại bớt chất béo, ví dụ: xử lý nhiều lần với dầu nhẹ trước khi phân hủy bằng axit.

Để xử lý các mẫu có tạo bọt, nên sử dụng vài giọt dầu Silicon (4.17).

Độ pH của dung dịch chiết được cần xấp xỉ 1. Nếu không thì giảm khối lượng mẫu hoặc dùng axit clohydric có nồng độ cao hơn [ví dụ: 0,2 mol/l (4.9) hoặc 1 mol/l (4.7)].

6.2.1.2 Chiết các sản phẩm khô (hàm lượng nước nhỏ hơn 20 %, ví dụ: ngũ cốc, sữa bột, rau khô)

Cân từ 1 g đến 10 g mẫu thử đồng nhất (6.1), chính xác đến miligam, cho vào bình nón 150 ml, thêm 50 ml axit clohydric 0,1 mol/l (4.8), trộn và kiểm tra để chắc chắn pH xấp xỉ 1.

Làm nóng trong thiết bị áp lực (5.3) trong 30 min ở nhiệt độ 120 ^oC, làm nguội đến nhiệt độ phòng, chuyển sang bình định mức 100 ml và pha loãng bằng nước đến 100 ml (với lớp silicon cao hơn vạch) và trộn.

Lọc hoặc li tâm một lượng (khoảng 50 ml) dung dịch mẫu đã xử lý bằng axit ở gia tốc 3 000g và chuyển lớp nổi phía trên sang chai thủy tinh có thể đậy kín (đây là dung dịch chiết mẫu).

6.2.1.3 Chiết các mẫu dạng lỏng và ướt (hàm lượng nước lớn hơn 20 %, ví dụ: thịt, rau. nước quả)

Cân từ 2 g đến 40 g mẫu thử đồng nhất (6.1), chính xác đến miligam, cho vào bình nón 150 ml, thêm 10 ml axit clohydric 1 mol/l (4.7), pha loãng bằng nước đến khoảng 50 ml, trộn và kiểm tra để chắc chắn pH xấp xỉ 1.

Làm nóng trong thiết bị áp lực (5.3) trong 30 min ở nhiệt độ 120 ^oC, làm nguội đến nhiệt độ phòng, chuyển sang bình định mức 100 ml và pha loãng bằng nước đến 100 ml (với lớp silicon cao hơn vạch) và trộn.

Lọc hoặc li tâm một lượng (khoảng 50 ml) dung dịch mẫu đã xử lý bằng axit ở gia tốc 3 000g và chuyển lớp nổi phía trên sang chai thủy tinh có thể đậy kín (đây là dung dịch chiết mẫu).

CHÚ THÍCH Trong quá trình hấp áp lực có thể có sự thay đổi các dạng khác nhau của vitamin, ví dụ: chuyển hóa vitamin. Điều này quan sát được đối với các mẫu thịt đã làm chín hoặc các mẫu có chứa cac nhóm amin tự do cao. xem từ [2] đến [7]

6.2.2. Xử lý enzym và các bước chuyển hóa

Đối với các mẫu thực phẩm có nguồn gốc động vật (thịt lợn, sữa, cá…) không chứa pyridoxin liên kết b-glucosidaza, thì không cần xử lý bằng enzym với b-glucosidaza. Kinh nghiệm cho thấy rằng các kết quả tổng hàm lượng vitamin B₆ của các loại thực phẩm có nguồn gốc động vật được phân tích có sử dụng hoặc không sử dụng b-glucosidaza để xử lý enzym là như nhau [2], [7].

Dùng pipet lấy 12,5 ml dung dịch chiết mẫu từ 6.2.1.2 và 6.2.1.3 cho vào bình nón 20 ml và chỉnh pH đến 4,8 ± 0,1 bằng dung dịch natri axetat (4.5). Thêm 1 ml dung dịch phosphataza trong axit (4.13) và 1 ml dung dịch b-glucosidaza (4.15) và trộn. Đậy nắp bình nón và ủ dung dịch ở 37 ^oC ít nhất 12 h hoặc để qua đêm trong khi vẫn khuấy liên tục.

Sau khi để nguội đến nhiệt độ phòng, chỉnh pH đến xấp xỉ 3 bằng axit sunfuric (4.10), chuyển định lượng dung dịch đã chỉnh này sang bình định mức 20 ml và pha loãng bằng nước đến vạch. Lắc và lọc qua giấy lọc gấp nếp khô, loại bỏ 5 ml dịch lọc đầu tiên. Dung dịch mẫu thử này khi được bảo quản trong tủ lạnh ở khoảng 4 ^oC có thể bền được 3 ngày.

Để phân tích HPLC, chuyển một lượng (khoảng 2 ml) qua bộ lọc màng (5.6) và pha loãng bằng pha động, nếu cần.

6.3. Chuẩn bị dung dịch mù thuốc thử

Dùng pipet lấy 12,5 ml dung dịch axit clohydric 0,1 mol/l (4.8) cho vào bình nón 20 ml và chỉnh pH đến 4,8 ± 0,1 bằng dung dịch natri axetat 2,5 mol/l (4.5). Thêm 1 ml dung dịch phosphataza trong axit (4.13) và 1 ml dung dịch b-glucosidaza (4.15) và trộn. Ủ dung dịch ở 37 ^oC ít nhất 12 h hoặc để qua đêm trong khi vẫn khuấy liên tục.

Sau khi để nguội đến nhiệt độ phòng, chỉnh pH đến khoảng 3 bằng axit sulfuric (4.10), chuyển dung dịch này sang bình định mức 20 ml và pha loãng bằng nước đến vạch, lắc và lọc qua giấy lọc gấp nếp khô, loại bỏ 5 ml dịch lọc đầu tiên.

Để phân tích HPLC, chuyển một lượng (khoảng 2 ml) qua bộ lọc màng (5.6) và pha loãng bằng pha động, nếu cần.

6.4. Điều kiện HPLC

Thực hiện tách bằng hệ thống HPLC phải sao cho tách được đường nền của các pic thu được đối với PM, PL và PN ra khỏi tất cả các chất khác có trong mẫu thử.

Việc tách và định lượng đã chứng minh là thoả mãn khi áp dụng các điều kiện thực nghiệm sau đây (xem Hình trong Phụ lục B):

Cột HPLC theo 5.5;

Pha động theo 4.16;

Tốc độ dòng: 1,5 ml/min;

Thể tích bơm: từ 1 ml đến 50 ml;

Detector: huỳnh quang; bước sóng kích thích: 290 nm; bước sóng phát xạ: 390 nm.

6.5. Nhận biết

Bơm các thể tích thích hợp của dung dịch mẫu thử (6.2.2), các dung dịch mù thuốc thử (6.3) và các dung dịch hiệu chuẩn hỗn hợp (4.21) vào hệ thống HPLC với các điều kiện quy định trong 6.4.

Nhận biết PM, PL và PN bằng cách so sánh thời gian lưu của các pic riêng rẽ trong sắc phổ thu được với dung dịch mẫu thử và với dung dịch thử chuẩn. Việc nhận biết pic cũng có thể thực hiện bằng cách thay đổi pH sau cột đến các giá trị lớn hơn, ví dụ: pH = 6,6 sử dụng thiết bị tạo dẫn xuất sau cột (5.4) với tốc độ dòng của thuốc thử sau cột (4.6) là 0,1 ml/min. Việc phát hiện được thực hiện ở bước sóng kích thích 330 nm và bước sóng phát xạ 390 nm [2], [4], [5].

CHÚ THÍCH: Việc tăng giá trị pH bằng thuốc thử sau cột (4.6) dẫn đến trượt bước sóng kích thích đến 330 nm. Ngoài ra, độ chọn lọc của một số chất nền được cải thiện do giảm một số pic nền [2], [4], [5].

6.6. Phép xác định

Bơm các thể tích thích hợp của dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu thử vào hệ thống HPLC với các điều kiện quy định trong 6.4. Tiến hành phép xác định ngoại chuẩn, tích phân các diện tích pic hoặc chiều cao pic, so sánh kết quả với các giá trị tương ứng của chất chuẩn.

7. Tính kết quả

7.1. Dựa vào đường chuẩn, các chương trình thích hợp của bộ tích phân để tính hoặc sử dụng các công thức từ (3) đến (6) dưới đây.

	(3)
	(4)
	(5)
	(6)

Trong đó

y_i là khối lượng của PM, PL hoặc PN, tính bằng microgam trên 20 ml dung dịch mẫu thử (6.2.2) xác định được bằng diện tích pic hoặc chiều cao pic sử dụng hồi quy tuyến tính hoặc đường chuẩn;

m là khối lượng mẫu, tính bằng gam (g);

b_i, a_i, là các hệ số hồi quy đối với PM, PL hoặc PN tính được từ hồi quy tuyến tính theo nồng độ và diện tích pic trong các dung dịch hiệu chuẩn;

a_i là giá trị y của đường chuẩn đối với PM, PL và PN;

b_i là gradient của đường chuẩn;

x_i là diện tích pic PM, PL hoặc PN đã hiệu chính của dung dịch mẫu thử;

P_i là các diện tích pic PM, PL và PN của dung dịch mẫu thử;

Bi là các diện tích pic PM, PL hoặc PN của dung dịch thử trắng thuốc thử;

F là thương số tính được trong Công thức (6);

w là phần khối lượng pyridoxamin (PM), pyridoxal (PL) hoặc pyridoxin (PN), tính bằng miligam trên 100 g mẫu;

V là tổng thể tích dung dịch mẫu chiết bằng axit (6.2.1.2); (6.2.1.3), tính bằng mililit (ml);

V₁ là thể tích dung dịch chiết bằng axit dùng để xử lý enzym (6.2.2), tính bằng mililit (ml).

7.2. Tính phần khối lượng của vitamin B₆, w, biểu thị theo pyridoxin bằng mg/100 g mẫu, theo Công thức (7):

(7)

Trong đó:

W_PM là hàm lượng pyridoxamin, tính bằng mg/100 g mẫu;

W_PL là hàm lượng pyridoxal, tính bằng mg/100 g mẫu;

W_PN là hàm lượng pyridoxin, tính bằng mg/100 g mẫu;

1,006 là hệ số đổi với PM để tính theo PN;

1,012 là hệ số đối với PL để tính theo PN.

7.3. Báo cáo kết quả đối với vitamin B₆ được tính theo pyridoxin bằng mg/100 g

CHÚ THÍCH: Nếu cần tính kết quả theo pyridoxin hydro clorua thì sử dụng hệ số chuyển đổi là 1,216 . Việc chuyển đổi này phải được ghi rõ trong báo cáo thí nghiệm

8. Độ chụm

8.1. Yêu cầu chung

Dữ liệu về độ chụm của phép xác định vitamin B₆ được thiết lập từ phép thử liên phòng thử nghiệm phù hợp với ISO 5725 do BgVV (Bundesinstitut fur gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinarmedizin, German Federal Institute for Consumer protection and veterinary medicine) trước đây thực hiện.

Các chi tiết của phép thử cộng tác về độ chụm của phương pháp nêu trong Phụ lục A. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ phân tích và chất nền khác với dải nồng độ và chất nền nêu trong Phụ lục A.

Khả năng áp dụng và độ tin cậy của phương pháp này đã được thử nghiệm bằng các nghiên cứu khác trên các loại thực phẩm khác nhau như thịt, cá, sữa, rau, quả và ngũ cốc [2], [3]. Các kết quả phân tích này có độ tái lập tốt và chỉ có một vài pic gây nhiễu từ chất nền thực phẩm, mà có thể tách được dễ dàng. Có mối tương quan tốt và hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của PM, PL và PN trong dung dịch hiệu chuẩn. Các độ lệch chuẩn tương đối của tổng hàm lượng vitamin B₆ trong dãy từ ba đến năm phép xác định thông thường trong các loại thực phẩm khác nhau dao động từ 2 % đến 6 %.

Độ thu hồi của PM, PL và PN được bổ sung vào thực phẩm dao động từ 85 % đến 105 % [2], [3]. Xác định tổng vitamin B₆ bằng phương pháp này cho các giá trị cao hơn rõ rệt trong các loại thực phẩm có nguồn gốc thực vật (có chứa pyridoxin đã glycosyl hóa) so với các phương pháp khác không xử lý bằng b-glucosidaza [2], [3], [7].

8.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử thử riêng rẽ, thu được khi tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại r. Các giá trị đó là:

Đối với bột tấm lõi (semolina) chứa sữa:

Pyridoxamin	= 0,065 mg/100 g	r = 0,008
Pyridoxal	= 0,080 mg/100 g	r = 0,022
Pyridoxin	= 0,523 mg/100 g	r = 0,067
Vitamin B6	= 0,667 mg/100 g	r = 0,084

Đối với bột khoai tây nghiền:

Pyridoxamin	= 0,163 mg/100 g	r = 0,016
Pyridoxal	= 0,032 mg/100 g	r = 0,012
Pyridoxin	= 1,008 mg/100 g	r = 0,080
Vitamin B6	= 1,204 mg/100 g	r = 0,089

Đối với rau trộn thịt xông khói (thức ăn cho trẻ nhỏ)

Pyridoxamin	= 0,043 mg/100 g	r = 0,005
Pyridoxal	= 0,009 mg/100 g	r = 0,004
Pyridoxin	= 0,047 mg/100 g	r = 0,010
Vitamin B6	= 0,107 mg/100 g	r = 0,011

Đối với đồ uống chứa nhiều loại vitamin:

Pyridoxamin	= 0,004 mg/100 g	r = 0,003
Pyridoxal	= 0,004 mg/100 g	r = 0,003
Pyridoxin	= 0,374 mg/100 g	r = 0,056
Vitamin B6	= 0,380 mg/100 g	r = 0,056

8.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử riêng rẽ, thu được bởi hai phòng thử nghiệm khi tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau, không được quá 5% các trường hợp vượt quá giới hạn tái lập R. Các giá trị đó là:

Đối với bột tấm lõi (semolina) chứa sữa

Pyridoxamin	= 0,065 mg/100 g	R = 0,035
Pyridoxal	= 0,080 mg/100 g	R = 0,071
Pyridoxin	= 0,523 mg/100 g	R = 0,151
Vitamin B6	= 0,667 mg/100 g	R = 0,193

Đối với bột khoai tây nghiền:

Pyridoxamin	= 0,163 mg/100 g	R = 0,089
Pyridoxal	= 0,032 mg/100 g	R = 0,022
Pyridoxin	= 1,008 mg/100 g	R = 0,314
Vitamin B6	= 1,204 mg/100 g	R = 0,369

Đối với rau trộn thịt xông khói (thức ăn cho trẻ nhỏ)

Pyridoxamin	= 0,043 mg/100 g	R = 0,013
Pyridoxal	= 0,009 mg/100 g	R = 0,013
Pyridoxin	= 0,047 mg/100 g	R = 0,021
Vitamin B6	= 0,107 mg/100 g	R = 0,039

Đối với đồ uống chứa nhiều loại vitamin:

Pyridoxamin	= 0,004 mg/100 g	R = 0,005
Pyridoxal	= 0,004 mg/100 g	R = 0,005
Pyridoxin	= 0,373 mg/100 g	R = 0,086
Vitamin B6	= 0,380 mg/100 g	R = 0,095

9. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm ít nhất phải bao gồm các thông tin sau đây:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) viện dẫn tiêu chuẩn này hoặc phương pháp thử đã sử dụng;

c) ngày và loại quy trình lấy mẫu (nếu biết);

d) ngày nhận mẫu;

e) ngày thử nghiệm;

f) các kết quả và các đơn vị biểu thị kết quả;

g) các điểm đặc biệt quan sát được trong khi tiến hành thử nghiệm;

h) mọi chi tiết thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy chọn có thể ảnh hưởng đến kết quả.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Dữ liệu về độ chụm

Các dữ liệu hiện hành thu được bằng các phương pháp HPLC được nêu trong Phụ lục C. Dữ liệu về độ chụm đối với phương pháp xác định vitamin B6 đã được thiết lập bởi phép thử liên phòng theo ISO 5725 do BgVV (Bundesinstitut fur gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinarmedizin, German Federal Institute for Consumer protection and veterinary medicine) trước đây thực hiện.

Bảng A.1 – Dữ liệu về độ chụm đối với bột tấm lõi chứa sữa

Mẫu	Bột tấm lõi chứa sữa
Chất phân tích	Pyridoxamin	Pyridoxal	Pyridoxin	Vitamin B6a
Năm thử nghiệm	2000	2000	2000	2000
Số lượng phòng thử nghiệm	11	11	11	11
Số lượng mẫu thử	5	5	5	5
Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ	10	10	10	10
Số lượng kết quả được giữ lại	53	53	53	53
Giá trị trung bình, , mg/100 g	0,065	0,080	0,523	0,667
Độ lệch chuẩn lặp lại, sr, mg/100g	0,003	0,008	0,024	0,030
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại RSDr, %	4,6	10,0	4,6	4,5
Giới hạn lặp lại r(2,8 x sr), mg/100 g	0,008	0,022	0,067	0,084
Độ lệch chuẩn tái lập, sR, mg/100 g	0,013	0,025	0,053	0,068
Độ lệch chuẩn tương đối tái lập RSDR, %	20,5	31,3	10,1	10,2
Giới hạn tái lập R (2,8 X sR), mg/100 g	0,035	0,071	0,151	0,193
Giá trị trung bình độ thu hồi, %	97,2	94,7	93,9
Độ lệch chuẩn thu hồi, %	9	8,2	9,7
Số lượng kết quả sử dụng để tính độ thu hồi	23	20	23
a Vitamin B6 = 1,006 pyridoxamin + 1,012 pyridoxal + pyridoxin.

Bảng A.2 – Dữ liệu về độ chụm đối với bột khoai tây nghiền

Mẫu	Bột khoai tây nghiền
Chất phân tích	Pyridoxamin	Pyridoxal	Pyridoxin	Vitamin B
Năm thử nghiệm	2000	2000	2000	2000
Số lượng phòng thử nghiệm	10	10	10	10
Số lượng mẫu thử	5(9)	5(9)	5(9}	5(9)
Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ	9	9	9	9
Số lượng kết quả được giữ lại	49	49	49	49
Giá trị trung bình,  , mg/100 g	0,163	0,032	1,008	1,204
Độ lệch chuẩn lặp lại, sr, mg/100g	0,006	0,004	0,028	0,032
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại RSDr, %	3,7	12,3	2,8	2,7
Giới hạn lặp lại r (2,8 x sr), mg/100 g	0,016	0,012	0,080	0,089
Độ lệch chuẩn tái lập, sR, mg/100 g	0,031	0,008	0,111	0,131
Độ lệch chuẩn tương đối tái lập RSDR, %	19,0	25,0	11,0	10,9
Giới hạn tái lập R (2,8 x sR), mg/100 g	0,089	0,022	0,314	0,369
Giá trị trung bình độ thu hồi, %	97,7	85,2	90,8
Độ lệch chuẩn thu hồi, %	9,4	7,4	9,9
Số lượng kết quả sử dụng để tính độ thu hồi	19	20	20
a Vitamin B6 = 1,006 pyridoxamin + 1,012 pyridoxal + pyridoxin.

Bảng A.3 – Dữ liệu về độ chụm đối với rau trộn dăm bông (thức ăn cho trẻ nhỏ)

Mẫu	Rau trộn dăm bông (thức ăn cho trẻ nhỏ)
Chất phân tích	Pyridoxamin	Pyridoxal	Pyridoxin	Vitamin B6
Năm thử nghiệm	2000	2000	2000	2000
Số lượng phòng thử nghiệm	9	9	9	9
Số lượng mẫu thử	5(2)	5(2)	5(2)	5(2)
Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ	8	8	8	8
Số lượng kết quả được giữ lại	37	37	37	37
Giá trị trung bình,  ,(mg/100 g)	0,043	0,009	0,047	0,107
Độ lệch chuẩn lặp lại, sr, mg/100g	0,002	0,001	0,003	0,004
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại RSDr, %	4,4	15,4	7,2	3,6
Giới hạn lặp lại r (2,8 x sr), mg/100 g	0,005	0,004	0,010	0,011
Độ lệch chuẩn tái lập, sR, mg/100 g	0,005	0,005	0,007	0,014
Độ lệch chuẩn tương đối tái lặp RSDR, %	11,0	50,5	15,7	12,8
Giới hạn tái lập R (2,8 X sR), mg/100 g	0,013	0,013	0,021	0,039
Giá trị trung bình độ thu hồi, %	95,1	90,6	88,9
Độ lệch chuẩn thu hồi, %	4,5	12,0	10,2
Số lượng kết quả sử dụng để tính độ thu hồi	18	16	19
a Vitamin B6 = 1,006 pyridoxamin + 1,012 pyridoxal + pyridoxin.

Bảng A.4 – Dữ liệu về độ chụm đối với đồ uống chứa nhiều loại vitamin

Mẫu	Đồ uống chứa nhiều loại vitamin
Chất phân tích	Pyridoxamin	Pyridoxal	Pyridoxin	Vitamin B6
Năm thử nghiệm	2000	2000	2000	2000
Số lượng phòng thử nghiệm	11	11	11	11
Số lượng mẫu thử	5	5	5	5
Số lượng phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ	10	10	10	10
Số lượng kết quả được giữ lại	53	53	53	53
Giá trị trung bình,  , mg/100 g	0,004	0,004	0,373	0,380
Độ lệch chuẩn lặp lại, sr, mg/100g	0,001	0,001	0,020	0,020
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại RSDr, %	25,0	25,0	5,4	5,3
Giới hạn lặp lại r (2,8 x sr), mg/100 g	0,003	0,003	0,056	0,056
Độ lệch chuẩn tái lập, sR, mg/100 g	0,002	0,002	0,030	0,034
Độ lệch chuẩn tương đối tái lập RSDR, %	38,6	49	8,0	8,8
Giới hạn tái lập R (2,8 X sR), mg/100 g	0,005	0,005	0,086	0,095
Giá trị trung bình độ thu hồi, %	98,1	94,5	98,2
Độ lệch chuẩn thu hồi, %	11,4	6,2	8,4
Số lượng kết quả sử dụng để tính độ thu hồi	23	23	23
a Vitamin B6 = 1,006 pyridoxamin + 1,012 pyridoxal + pyridoxin.

Phụ lục B

(tham khảo)

Bảng B.1 – Ví dụ về các điều kiện HPLC thích hợp để xác định các hợp chất vitamin B₆

Phụ lục C

(Tham khảo)

Các ví dụ về các hệ số tắt phân tử

Bảng C.1 – Các ví dụ về hệ số tắt phân tử (E) của các hợp chất vitamin B₆ [3], [4]

Phụ lục D

(Tham khảo)

Hình vẽ

CHÚ DẪN

LU là cường độ huỳnh quang

Hình D.1 – Các chất chuẩn và mẫu khoai tây nghiền

Điều kiện vận hành:

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] Bognár. A Bestimmung von Vitamin B₆ in Lebensmitteln mit Hilfe der Hochdruckflussig- Chromatographie (HPLC). Z Lebensm Unters Forsch A. 1985, 181: 200 – 205

[2] Bognár A., Ollilainen, V.: Influence of Extraction on the Determination of Vitamin B₆ in Food by HPLC. Z Lebensm Unters Forsch A, 1S97. 204: 327 – 335

[3] Melzler, O. E., and Snelt, E.E: Spectra and lonisation Constants of the Vitamin 86- Group and Related 3-Hydroxypyridine Dehvatos. Journal of the American Chemical Society. 1955, 77: 2431 – 2437

[4] Bilsch. R., Moller. X., J Chromatogr., 1989. 463: 207-211

[5] Ollilainen, V.: HPLC Analysis of Vitamin 86 in Agricultural and Food Science in Finland. Department of Applied Chemistry and Microbiology University of Helsinki 1999. Vol. 8: No. 5: 515-619

[6] Bergaentzle. M., Arella. F., Bourguignon, J.B., Hasselmann, C.: Determination of vitamin B₆ in foods by HPLC; A collaborative study. Food Chemistry, 1995, 52: 81-86

[7] Ndaw. S., Bergaentzle, M., Aoude-Wemer, D., Hasselmann. C.: Extraction procedures tor the liquid chromatographic determination of thiamin Riboflavin and vitamin B₆ in foodstuffs. Food Chemistry 2000, 71, 129-136

[8] ISO 5725, Precision of test methods – Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by intor-laboratory tests6)