TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9522:2012 (EN 15851 : 2010) VỀ THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH AFLATOXIN B1 TRONG THỰC PHẨM CHẾ BIẾN TỪ NGŨ CỐC DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH VÀ TRẺ NHỎ – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CÓ LÀM SẠCH BẰNG CỘT ÁI LỰC MIỄN NHIỄM VÀ DETECTOR HUỲNH QUANG

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 9522 : 2012

EN 15851 : 2010

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH AFLATOXIN B₁ TRONG THỰC PHẨM CHẾ BIẾN TỪ NGŨ CỐC DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH VÀ TRẺ NHỎ – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CÓ LÀM SẠCH BẰNG CỘT ÁI LỰC MIỄN NHIỄM VÀ DETECTOR HUỲNH QUANG

Foodstuffs – Determination of aflatoxin B₁ in cereal based foods for infants and young children – HPLC menthod with immunoaffinity column cleanup and fluorescence detection

Lời nói đầu

TCVN 9522 : 2012 hoàn toàn tương đương với EN 15851 : 2010;

TCVN 9522 : 2012 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH AFLATOXIN B₁ TRONG THỰC PHẨM CHẾ BIẾN TỪ NGŨ CỐC DÀNH CHO TRẺ SƠ SINH VÀ TRẺ NHỎ – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CÓ LÀM SẠCH BẰNG CỘT ÁI LỰC MIỄN NHIỄM VÀ DETECTOR HUỲNH QUANG

Foodstuffs – Determination of aflatoxin B₁ in cereal based foods for infants and young children – HPLC menthod with immunoaffinity column cleanup and fluorescence detection

CẢNH BÁO – Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đưa ra được tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn

1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng aflatoxin B₁ trong thức ăn cho trẻ nhỏ bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm và detector huỳnh quang. Phương pháp này đã được kiểm tra xác nhận trong nghiên cứu liên phòng thử nghiệm qua việc phân tích cả hai mẫu: nhiễm tự nhiên và mẫu thêm chuẩn trong khoảng 0,7 μg/kg đến 0,18 μg/kg.

Thông tin thêm về kiểm tra xác nhận, xem Điều 9 và Phụ lục B.

2 Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

3 Nguyên tắc

Phần mẫu thử được chiết bằng hỗn hợp metanol và nước. Dịch chiết được lọc, pha loãng với nước muối trong dung dịch đệm phosphat (PBS) đến nồng độ dung môi quy định và đưa lên cột ái lực miễn nhiễm có chứa các kháng thể đặc hiệu với aflatoxin B₁. Aflatoxin B₁ được tinh sạch và cô đặc trên cột rồi được rửa giải bằng metanol ra khỏi các kháng thể của cột. Aflatoxin B₁ được định lượng bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) có dẫn xuất sau cột (PCD) với brom hóa sau đó bằng detector huỳnh quang.

Việc tạo dẫn xuất sau cột được thực hiện bằng brom được sinh ra từ phương pháp điện hóa hoặc bằng pyridinium hydrobromua perbromua (PBPB).

4 Thuốc thử

4.1 Yêu cầu chung

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước đáp ứng yêu cầu loại 1 quy định trong TCVN 4851 : 1989 (ISO 3696:1987) trừ khi có qui định khác. Các dung môi phải đạt chất lượng sử dụng để phân tích sắc kí, trừ khi có quy định khác. Có thể sử dụng các dung dịch bán sẵn có các đặc tính tương đương với các loại được liệt kê dưới đây.

CẢNH BÁO: Việc thải các dung môi không sử dụng phải tuân thủ các quy định và pháp luật về môi trường. Tổ chức quốc tế nghiên cứu về ung thư (IARC) đã thông báo về quy trình xử lý khử nhiễm đối với chất thải phòng thử nghiệm, xem [4].

4.2 Khí nén heli tinh khiết.

4.3 Nitơ.

4.4 Dinatri hydro phosphat, Na₂HPO₄ khan hoặc Na₂HPO₄.12H₂O.

4.5 Kali bromua.

4.6 Kali clorua.

4.7 Kali dihydro phosphat, KH₂PO₄.

4.8 Natri clorua.

4.9 Natri hydroxit.

4.10 Dung dịch axit clohydric, w(HCl) = 37 % phần khối lượng trong nước.

4.11 Dung dịch axit clohydric, nồng độ mol c(HCl) = 0,1 mol/l.

Pha loãng 8,28 ml dung dịch axit clohydric (4.10) đến 1 lít bằng nước.

4.12 Dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = 0,1 mol/l.

Hòa tan 4 g natri hydoxit (4.9) trong 1 lít bằng nước.

4.13 Dung dịch nước muối trong dung dịch đệm phosphat (PBS), c(NaCl) = 120 mmol/l, c(KCl) = 2,7 mmol/l, c(đệm phosphat) = 10 mmol/l, pH = 7,4.

Hòa tan 8,0 g natri clorua (4.8), 1,2 g dinatri hydro phosphat khan hoặc 2,9 g Na₂HPO₄.12H₂O (4.4), 0,2 g kali dihydro phosphat (4.7) và 0,2 g kali clorua (4.6) trong 900 ml nước. Sau khi hòa tan, chỉnh pH đến 7,4 bằng dung dịch axit clohydric (4.11) hoặc dung dịch natri hydroxit (4.12) một cách thích hợp rồi thêm nước đến 1 lít.

Cách khác,có thể chuẩn bị dung dịch PBS với tỉ lệ tương đương từ nguyên liệu PBS có bán sẵn.

4.14 Pyridinium hydrobromua perbromua (PBPB), [CAS: 39416-48-3].

4.15 Axetonitril

CẢNH BÁO: Axetonitril là chất độc và khi trộn mẫu phải dùng máy nghiền trộn chống nổ đặt trong tủ hút. Sau khi trộn, mẫu phải được lọc bên trong tủ hút.

4.16 Metanol, loại dùng cho HPLC.

4.17 Metanol, loại kỹ thuật.

4.18 Toluen.

4.19 Dung môi chiết.

Trộn tám phần thể tích metanol (4.17) với hai phần thể tích nước.

4.20 Axit nitric, c(HNO₃) = 4 mol/l.

4.21 Pha động A dùng cho HPLC, để dùng với PBPB.

Trộn sáu phần thể tích nước với hai phần thể tích axetonitril (4.15) và ba phần thể tích metanol (4.16). Khử khí pha động, ví dụ bằng khí heli (4.2).

4.22 Pha động B dùng cho HPLC, để dùng với brom được điều chế bằng điện hóa.

Trộn sáu phần thể tích nước với hai phần thể tích axetonitril (4.15) và ba phần thể tích metanol (4.16). Thêm 120 ml kali bromua (4.5) và 350 μl axit nitric (4.20) trên lít pha động. Khử khí pha động B, ví dụ bằng khí heli (4.2).

4.23 Thuốc thử sau cột.

Hòa tan 50 mg PBPB (4.14) trong 1 lít nước. Được sử dụng với dung môi pha động A (4.21). Dung dịch này bền đến bốn ngày nếu được bảo quản nơi tối ở nhiệt độ phòng.

4.24 Hỗn hợp toluen và axetonitril.

Trộn chín phần thể tích toluen (4.18) với một phần thể tích axetonitril (4.15).

4.25 Cột ái lực miễn nhiễm.

Cột ái lực miễn nhiễm này phải chứa các kháng thể miễn nhiễm với aflatoxin B₁. Cột này phải có khả năng giữ đến 100 ng aflatoxin B₁ và phải cho độ thu hồi không nhỏ hơn 80 % khi 5 ng aflatoxin B₁ được sử dụng làm dung dịch chuẩn trong hỗn hợp gồm mười phần thể tích metanol và 90 phần thể tích nước.

4.26 Aflatoxin B₁, dạng tinh thể hoặc dạng màng trong ampule hoặc dạng dung dịch aflatoxin B₁ bán sẵn.

CẢNH BÁO: Aflatoxin bị phân hủy bởi ánh sáng. Bảo vệ khu vực thử nghiệm tránh ánh sáng khi tiến hành phân tích. Có thể sử dụng giấy kim loại hấp thụ tia cực tím (UV) để phủ lên kính cửa sổ kết hợp với việc sử dụng ánh sáng dịu (không được để ánh nắng chiếu trực tiếp) hoặc rèm chắn hoặc màn che mờ kết hợp với ánh sáng nhân tạo (có thể sử dụng đèn ống huỳnh quang).

Bảo vệ dung dịch chứa aflatoxin tránh ánh sáng (giữ bình ở nơi tối, dùng giấy nhôm hoặc bình thủy tinh màu hổ phách).

4.27 Dung dịch gốc aflatoxin B₁, c ≈ 10 μg/ml.

Chuẩn bị dung dịch aflatoxin B_­1 trong hỗn hợp toluen và axetonitril (4.24) để có được dung dịch nồng độ khối lượng khoảng 10 μg/ml.

Để xác định nồng độ khối lượng chính xác, dùng máy đo phổ UV (5.14) ghi đường hấp thụ ở bước sóng từ 330 nm đến 370 nm trong cuvet thạch anh 1 cm chứa hỗn hợp toluen và axetonitril (4.24) làm dung dịch đối chứng. Nhận biết bước sóng cho độ hấp thụ cực đại (trong khoảng từ 330 nm đến 370 nm). Tính nồng độ khối lượng của aflatoxin B₁, ρ_afl, tính bằng μg/ml, theo Công thức (1):

A_max      là độ hấp thụ cực đại xác định được trên đường hấp thụ (bước sóng từ 330 nm đến 370 nm);

M         là khối lượng mol của aflatoxin B₁ (M = 312 g/mol), tính bằng g/mol;

ε           là hệ số hấp thụ mol của aflatoxin B₁, trong hỗn hợp toluen và axetonitril (4.24) (1 930 m²/mol, xem [5]) tính bằng mét vuông trên mol (m²/mol);

b          là chiều dài đường quang của cuvet thạch anh, tính bằng centimet (cm).

Bảo quản dung dịch này trong tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng -18^oC. Để cho dung dịch đạt nhiệt độ phòng trước khi mở. Dung dịch được bảo quản bằng cách này có thể bền được trong 12 tháng. Nếu bảo quản quá 12 tháng thì cần kiểm tra lại nồng độ của dung dịch.

4.28 Dung dịch chuẩn aflatoxin B₁, ρ = 5,00 ng/ml.

Dùng pipet lấy một lượng dung dịch gốc aflatoxin B₁ (4.27) chứa chính xác 1,00 μg aflatoxin B₁ cho vào bình định mức dung tích 200 ml đã hiệu chuẩn, thêm hỗn hợp toluen và axetonitril (4.24) đến vạch. Dung dịch này chứa 5,00 ng/ml aflatoxin B₁.

Bọc kín bình chứa mẫu bằng giấy nhôm và bảo quản ở nhiệt độ dưới 4 ^oC. Trước khi sử dụng, không mở giấy nhôm cho đến khi lượng chứa trong bình đạt đến nhiệt độ phòng để tránh dung dịch hấp thụ nước do ngưng tụ. Dung dịch được bảo quản theo cách này có thể bền ít nhất 4 tuần.

4.29 Dung dịch aflatoxin B₁ để bổ sung vào mẫu, ρ = 2 μg/ml.

Dùng pipet lấy một lượng dung dịch gốc aflatoxin B₁ (4.27) chứa chính xác 20 μg aflatoxin B₁ cho vào bình định mức dung tích 10 ml đã hiệu chuẩn. Cho bay hơi hỗn hợp dung dịch toluen và axetonitril dưới dòng nitơ ở nhiệt độ phòng. Thêm metanol (4.16) đến vạch và lắc mạnh. Nồng độ của dung dịch thêm chuẩn đối với  aflatoxin B₁ là 2 μg/ml.

Bọc kín bình chứa mẫu bằng giấy nhôm và bảo quản ở nhiệt độ dưới 4 ^oC. Trước khi sử dụng, không được mở giấy nhôm cho đến khi lượng chứa trong bình đạt đến nhiệt độ phòng để tránh dung dịch hấp thụ nước do ngưng tụ. Dung dịch được bảo quản theo cách này có thể bền ít nhất 3 tháng.

5 Thiết bị, dụng cụ

CẢNH BÁO – Mọi dụng cụ thủy tinh tiếp xúc với dung dịch aflatoxin phải được rửa bằng dung dịch axit trước khi sử dụng. Cần chú ý khi có nhiều máy rửa dụng cụ thử nghiệm. Cách khác, ngâm dụng cụ thủy tinh đã tiếp xúc với dung dịch aflatoxin trong axit sulfuric (c = 2 mol/l) (ví dụ 15 h) rồi tráng kỹ (ít nhất 3 lần) bằng nước để loại hết các vết axit. Dùng giấy pH để kiểm tra xem có còn axit hay không.

Việc xử lý này là cần thiết vì việc dùng dụng cụ không được rửa bằng axit có thể làm thất thoát aflatoxin. Trong thực tế, việc xử lý cũng cần thiết đối với các bình đáy tròn, bình định mức, ống đong, các lọ hoặc ống nghiệm dùng cho dung dịch hiệu chuẩn và dịch chiết cuối cùng (đặc biệt là các lọ lấy mẫu tự động) và pipet Pasteur, nếu chúng được dùng để chuyển dung dịch hiệu chuẩn hoặc dịch chiết.

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thủy tinh của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.1 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,0001 g.

5.2 Cân phòng thử nghiệm, có thể cân chính xác đến 0,01 g.

5.3 Máy lắc dọc hoặc máy lắc ngang.

5.4 Giấy lọc, ví dụ đường kính 24 cm, được gấp nếp.

5.5 Bình nón, dung tích 500 ml, có nắp vặn hoặc nắp thủy tinh.

5.6 Màng lọc vi sợi thủy tinh, cỡ hạt được giữ lại 1,6 μm hoặc nhỏ hơn.

5.7 Bình chứa, dung tích 75 ml có bộ ống và đầu nối để nối với cột ái lực miễn nhiễm (IAC).

5.8 Bơm tay, xyranh 20 ml có đầu nối hoặc nút cao su để nối với IAC.

5.9 Bình định mức, dung tích 5 ml, 10 ml, 20 ml, 150 ml và 200 ml có sai số lớn nhất là 0,5 %.

5.10 Bộ lọc xyranh dùng một lần, cỡ lỗ 0,45 μm.

Trước khi sử dụng, cần kiểm tra xác nhận aflatoxin không bị thất thoát trong quá trình lọc (thử nghiệm độ thu hồi).

CHÚ THÍCH: Các chất liệu lọc khác nhau có khả năng giữ aflatoxin khác nhau.

5.11 Pipet định mức, dung tích 2 ml và 10 ml.

5.12 Xyranh microlit đã được hiệu chuẩn hoặc pipet microlit, có dung tích từ 25 μl đến 500 μl.

5.13 Thiết bị HPLC, gồm có các bộ phận sau:

5.13.1 Hệ thống bơm mẫu, có thể bơm, ví dụ 1000 μl. Nên dùng bơm vòng.

Trong trường hợp dùng các thể tích khác nhau, thì cần bảo đảm rằng giới hạn phát hiện (LOD) đối với hệ thống là ≤ 0,05 μg/kg (tỷ lệ tín hiệu/nhiễu = 3) và giới hạn định lượng (LOQ) ≤ 0,1 μg/kg đối với aflatoxin B₁. Việc đo LOQ được thực hiện bằng cách bơm nhiều lần (n = 10) dung dịch chuẩn aflatoxin B₁ (nồng độ tương đương với mức nhiễm là 0,1 μg/kg). Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của tín hiệu thu được không được vượt quá 10 %. Dữ liệu này phải được nêu trong báo cáo thử nghiệm.

5.13.2 Bơm pha động, có khả năng duy trì tốc độ dòng thể tích 1,0 ml/min.

5.13.3 Detector huỳnh quang, có bộ lọc bước sóng kích thích λ = 360 nm và bộ lọc bước sóng phát xạ λ > 420 nm, hoặc loại tương đương (ví dụ: detector có ánh sáng đơn sắc có thể chỉnh được).

5.13.4 Máy ghi, máy tích phân hoặc máy vi tính có hệ thống xử lý dữ liệu.

5.13.5 Cột tách HPLC pha đảo phân tích, ví dụ Cột C18 hoặc ODS-2 và cột bảo vệ pha đảo tương ứng phù hợp.

Cột này phải bảo đảm cho đường nền có độ phân giải tách được pic aflatoxin B­₁ ra khỏi các pic khác. Mức tối đa các pic chồng lên nhau phải nhỏ hơn 10 % chiều cao tối đa của pic. Do vậy cần chỉnh (tốc độ) pha động đủ để phân giải đường nền. Cần sử dụng tiền cột thích hợp.

5.13.6 Hệ thống dẫn xuất sau cột, có PBPB (chỉ để sử dụng với pha động A, xem 4.21).

Gồm có bơm HPLC không xung thứ hai, thể tích khoang chết hình chữ T, ống phản ứng polytetrafloetylen (PTFE) dài tối thiểu 45 cm và đường kính trong 0,5 mm.

5.13.7 Hệ thống dẫn xuất có brom được điều chế bằng điện hóa, ví dụ KOBRA cell^® 1) (chỉ để sử dụng với pha động B, xem 4.22).

Nên cài đặt detector ở bước sóng 365 nm (bước sóng kích thích) và 435 nm (bước sóng phát xạ) và băng thông là 18 nm.

5.13.8 Máy khử khí (tùy chọn).

5.14 Máy đo phổ UV, có cuvet thạch anh phù hợp.

6 Cách tiến hành

6.1 Chiết mẫu

Trộn kỹ mẫu trước khi lấy phần mẫu thử phân tích.

Cân 50 g phần mẫu thử là thức ăn cho trẻ nhỏ (công thức dành cho trẻ sơ sinh), chính xác đến 0,1 g, cho vào bình nón dung tích 500 ml (5.5). Thêm 5 g natri clorua (4.8) và 250 ml dung môi chiết (4.19). Đầu tiên dùng tay lắc mạnh bình nón từ 15 s đến 30 s, sau đó dùng máy (5.3) lắc trong 30 min. Dùng giấy lọc gấp nếp (5.4) lọc dịch chiết và dùng pipet (5.11) lấy 10 ml dịch lọc trong cho vào bình định mức đã hiệu chuẩn (5.9) dung tích 100 ml và thêm PBS (4.13) đến vạch. Lọc lại qua bộ lọc vi sợi thủy tinh (5.6) và chuyển 50 ml đến 100 ml dịch lọc trong vào bình hứng (5.7), bình này được nối với cột ái lực miễn nhiễm được bảo ôn (xem 4.25). Chuyển dung dịch lên cột như mô tả trong 6.2.

6.2 Làm sạch cột ái lực miễn nhiễm

Có thể làm sạch cột bằng chân không với áp suất dương hoặc cho các thể tích quy định chảy qua cột dưới trọng lực. Không được vượt qua tốc độ dòng quy định tối đa. Đặc biệt chú ý khi dùng bộ hút chân không.

Chuẩn bị cột ái lực miễn nhiễm (4.25) theo hướng dẫn của nhà sản xuất, chú ý không để cột bị khô, nếu có quy định. Cột phải đạt đến nhiệt độ phòng trước khi bảo ôn.

Cho dịch chiết chạy qua cột ở tốc độ khoảng 3 ml/min (khoảng 1 giọt/giây). Không để tốc độ dòng vượt quá 5 ml/min. Rửa cột bằng khoảng15 ml PBS (4.13), tiến hành vài lần mỗi lần khoảng 5 ml với tốc độ tối đa 5 ml/min và sau đó làm khô bằng hút chân không nhẹ trong 5 s đến 10 s hoặc bằng cách dùng xyranh bơm không khí qua cột ái lực miễn nhiễm trong 10 s.

6.3 Chuẩn bị dung dịch mẫu thử

Rửa giải aflatoxin B₁ bằng cách chuyển 0,50 ml metanol (4.16) lên cột và để cho metanol đi qua cột dưới trọng lực. Thu lấy chất rửa giải vào một bình định mức đã hiệu chuẩn dung tích 5 ml (5.9).

Chờ trong 1 min và cho thêm 0,75 ml metanol (4.16) lên cột. Thu lấy dịch chiết càng nhiều càng tốt bằng cách ép khí qua cột. Thêm nước vào bình đến vạch và lắc kỹ. Nếu dung dịch trong thì có thể được dùng trực tiếp để phân tích HPLC. Nếu dung dịch không trong thì lọc dung dịch qua bộ lọc sử dụng một lần (5.10) trước khi bơm vào cột HPLC.

CHÚ THÍCH: Các phương pháp nạp mẫu lên cột ái lực miễn nhiễm có sự khác nhau về rửa cột và rửa giải giữa các nhà sản xuất cột và do đó phải tuân thủ hướng dẫn của nhà sản xuất kèm theo.

6.4 Quy trình thêm chuẩn

Để xác định độ thu hồi, tiến hành quy trình thêm chuẩn, dùng dung dịch thêm chuẩn metanol (4.29). Mức thêm chuẩn phải trong dải hiệu chuẩn (tốt nhất giá trị tương ứng khoảng giữa của đường chuẩn). Chú ý không được cho quá 2 ml (5.11) dung môi thêm chuẩn và quá trình làm bay hơi sau đó xảy ra ở nơi tối và kéo dài trong khoảng 0,5 h đến 2 h.

7 Phân tích HPLC

7.1 Điều kiện vận hành HPLC

Aflatoxin B₁ được tách bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo đẳng dòng (RP-HPLC) ở nhiệt độ môi trường có cột pha đảo (5.13.5) và pha động phù hợp (xem 4.21 hoặc 4.22). Thể tích bơm là 1000 μl (để đảm bảo bơm vòng (xem 5.13.1) có độ chụm cao nhất, cần theo các hướng dẫn của nhà sản xuất van bơm HPLC hoặc cổng bơm). Đối với cột có đường kính trong 4,6 mm, thì tốc độ dòng pha động nên 1 ml/min. Có thể sử dụng kích thước cột khác, với điều kiện đảm bảo giới hạn định lượng yêu cầu. Điều kiện này phải được kiểm chứng. Vì vậy, tốc độ dòng có thể được điều chỉnh theo kích thước cột.

Aflatoxin B₁ được rửa giải với thời gian lưu khoảng 11 min và được tách ra khỏi các chất gây nhiễu, nếu có. Pha động có thể được chỉnh bằng cách thêm nước, metanol (4.16) hoặc axetonitril (4.15) để phân giải pic tối đa và hiệu quả. Sắc đồ điển hình được nêu trong Phụ lục A.

7.2 Tạo dẫn xuất sau cột

Khi dùng PBPB, lắp hệ thống tạo dẫn xuất sau cột (xem 5.13.6), sau đó vận hành theo các thông số sau đây:

– tốc độ dòng pha động 1,0 ml/min;

– tốc độ dòng thuốc thử tạo dẫn xuất là 0,30 ml/min (tốc độ này có thể điều chỉnh theo tốc độ của pha động).

Khi sử dụng brom được điều chế bằng điện hóa (KOBRA cell^® 2)), lắp đặt cuvet và vận hành theo các hướng dẫn của nhà sản xuất, sử dụng các thông số sau đây:

– tốc độ dòng pha động 1,0 ml/min;

– cường độ dòng điện 100 μA.

7.3 Chuẩn bị các dung dịch hiệu chuẩn đối với HPLC

Dùng pipet lấy dung dịch aflatoxin B₁ (4.28) với thể tích như trong Bảng 1 cho vào bình định mức dung tích 10 ml đã hiệu chuẩn, rồi cho bay hơi hỗn hợp dung dịch toluen và axetonitril đến khô dưới dòng nitơ ở nhiệt độ phòng. Cho vào mỗi bình 3,5 ml metanol (4.16), thêm nước đến 10 ml và lắc kỹ để hòa tan aflatoxin B₁. Các dung dịch này bao trùm dải nồng độ aflatoxin B₁ từ 0,05 μg/kg đến 0,35 μg/kg trong các điều kiện của tiêu chuẩn này.

CHÚ THÍCH: Metanol và nước khi được trộn với nhau thì thể tích của chúng bị giảm đi.

Bảng 1 – Chuẩn bị các dung dịch hiệu chuẩn HPLC

Việc chuẩn bị các dung dịch hiệu chuẩn có thể được thực hiện bằng cách sử dụng pipet hoặc dụng cụ thủy tinh đã hiệu chuẩn sẵn có.

7.4 Đường chuẩn

Chuẩn bị đường chuẩn bằng cách bơm 1 000 μl các dung dịch hiệu chuẩn được nêu trong Bảng 1 vào hệ thống HPLC bắt đầu mỗi ngày phân tích. Vẽ diện tích pic dựa vào khối lượng của aflatoxin B₁ đã bơm và kiểm tra đường chuẩn về độ tuyến tính.

Chuẩn bị đường chuẩn thích hợp trong trường hợp hàm lượng aflatoxin B₁ trong mẫu nằm ngoài dải hiệu chuẩn. Cách khác, dung dịch bơm để phân tích HPLC có thể được pha loãng đến hàm lượng aflatoxin B₁ thích hợp cho đường chuẩn đã thiết lập.

7.5 Xác định aflatoxin B₁ trong dung dịch mẫu thử

Bơm phần dịch lỏng của dung dịch mẫu thử (6.3) vào hệ thống HPLC, sử dụng cùng một điều kiện như đã dùng đối với chuẩn bị đường chuẩn.

7.6 Khẳng định aflatoxin B₁

Để khẳng định aflatoxin B₁, tháo cột HPLC ra khỏi thiết bị brom hóa và nối HPLC trực tiếp với detector huỳnh quang. Tín hiệu aflatoxin B₁ giảm đáng kể (10 lần hoặc nhiều hơn) khi tháo hệ thống tạo dẫn xuất ra khỏi HPLC. Không ngắt dòng điện thiết bị brom hóa đang được kết nối vì brom có thể vẫn còn sót lại trong màng cuvet.

Cách khác: có thể áp dụng kỹ thuật nhận biết bằng đo khối phổ bằng cách tiến hành phân tích sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) hoặc sắc ký lỏng với khối phổ hai lần (LC-MS/MS).

8 Tính kết quả

Xác định nồng độ khối lượng aflatoxin B₁, biểu thị bằng nanogam trên mililit (ng/ml) trong dung dịch bơm từ đường chuẩn. Tính phần khối lượng, w_afla, của aflatoxin B₁ biểu thị bằng nanogam trên gam (ng/g), theo Công thức (2):

                                         (2)

Trong đó:

ρ_afla        là nồng độ của aflatoxin B₁ trong dung dịch thử đã được bơm và thu được từ đường chuẩn, tính bằng nanogam trên mililit (ng/ml);

V₁         là thể tích của dung môi đã lấy để chiết (ở đây là 250 ml), tính bằng mililit (ml);

V₂         là thể tích của dịch chiết mẫu chưa pha loãng được lấy để làm sạch trên cột ái lực miễn nhiễm (trong trường hợp này là 5 ml đến 10 ml), tính bằng mililit (ml);

V₃         là thể tích thu được sau rửa giải khỏi cột ái lực miễn nhiễm (trong trường hợp này là 5 ml), tính bằng mililit (ml);

m_s        là khối lượng mẫu được lấy để phân tích (trong trường hợp này là 50 g) tính bằng gam (g).

9 Độ chụm

9.1 Yêu cầu chung

Các chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được nêu trong Bảng B.1. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và các dải nồng độ phân tích và các chất nền khác với dải nồng độ phân tích và các chất nền đã nêu trong Phụ lục B.

9.2 Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm riêng rẽ thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, thực hiện trong cùng một khoảng thời gian ngắn nhất, không được quá 5 % giá trị giới hạn lặp lại.

Các giá trị đối với thực phẩm dành cho trẻ nhỏ (thức ăn theo công thức dành cho trẻ sơ sinh) là:

 = 0,10 μg/kg                         r = 0,011 μg/kg              (đã bổ sung aflatoxin B₁)

 = 0,18 μg/kg                         r = 0,067 μg/kg              (đã bổ sung aflatoxin B₁)

 = 0,07 μg/kg                         r = 0,028 μg/kg

 = 0,09 μg/kg                         r = 0,020 μg/kg

 = 0,17 μg/kg                         r = 0,059 μg/kg

9.3 Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành thử trên vật liệu thử giống hệt nhau, được báo cáo từ hai phòng thử nghiệm không được quá 5 % giá trị giới hạn tái lập R.

Giá trị đối với thực phẩm dành cho trẻ nhỏ (thức ăn theo công thức dành cho trẻ sơ sinh) là:

 = 0,10 μg/kg                         r = 0,034 μg/kg              (đã bổ sung aflatoxin B₁)

 = 0,18 μg/kg                         r = 0,118 μg/kg              (đã bổ sung aflatoxin B₁)

 = 0,07 μg/kg                         r = 0,048 μg/kg

 = 0,09 μg/kg                         r = 0,022 μg/kg

 = 0,17 μg/kg                         r = 0,109 μg/kg

10 Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu (loại mẫu, nguồn gốc của mẫu, ký hiệu);

b) viện dẫn tiêu chuẩn này;

c) ngày lấy mẫu và quy trình lấy mẫu (nếu biết);

d) ngày nhận mẫu;

e) ngày thử nghiệm;

f)  kết quả thử nghiệm và các đơn vị biểu thị kết quả;

g) các điểm đặc biệt quan sát được trong quá trình thử nghiệm;

h) mọi chi tiết thao tác khác với quy định trong tiêu chuẩn này hoặc tùy chọn cũng như các sự cố bất kỳ có thể ảnh hưởng đến kết quả.

Phụ lục A

(tham khảo)

Sắc đồ điển hình

CHÚ DẪN:

X          thời gian (phút)

Y          huỳnh quang (mV)

1          aflatoxin B₁

Các điều kiện vận hành:

Cột                          LC-18 Supelcosil^® 3), đường kính trong 4,6 mm, dài 25 cm

Tốc độ dòng            1 ml/min

Pha động                 HPLC pha động B, xem 4.22

Nhiệt độ cột             Nhiệt độ phòng

Thể tích bơm            1000 μl

Dẫn xuất                  Brom được điều chế bằng phương pháp điện hóa

Detector                   Huỳnh quang, bước sóng kích thích 365 nm, bước sóng phát xạ 435 nm, dải thông 18 nm.

Hình A.1 – Sắc đồ điển hình của aflatoxin B₁, trong thức ăn theo công thức dành cho trẻ sơ sinh sau khi làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm (mức nhiễm aflatoxin B₁ là 0,1 μg/kg)

Phụ lục B

(tham khảo)

Dữ liệu về độ chụm

Dữ liệu sau đây (xem Bảng B.1) đã thu được trong nghiên cứu liên phòng thử nghiệm do Chương trình Tiêu chuẩn, đo lường và thử nghiệm [6] của Ủy ban châu Âu tổ chức, thực hiện phù hợp với TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) [1], TCVN 6910-4 (ISO 5725-4) [2] và TCVN 6910-6 (ISO 5725-6) [3]. Mẫu thử là thức ăn dành cho trẻ nhỏ (thức ăn theo công thức dành cho trẻ sơ sinh), gồm mẫu nhiễm aflatoxin B₁ tự nhiên và mẫu thêm chuẩn có aflatoxin B₁. Giới hạn định lượng của phương pháp này đã được xác định là 0,05 μg/kg, tùy thuộc vào thiết bị sử dụng.

Bảng B.1 – Dữ liệu về độ chụm trong nghiên cứu liên phòng thử nghiệm đối với thực phẩm dành cho trẻ nhỏ (thức ăn theo công thức dành cho trẻ sơ sinh)

Mẫu	1	2	3a	4a	5a
Năm tiến hành phép thử liên phòng thử nghiệm	1999	1999	1999	1999	1999
Số lượng phòng thử nghiệm	14	14	14	14	14
Số lượng mẫu kép	1	1	1	1	1
Số lượng phòng thử nghiệm được giữa lại sau khi trừ ngoại lệ	11	14	14	11	13
Số lượng ngoại lệ (phòng thử nghiệm)	3	0	0	3	1
Số lượng các kết quả được chấp nhận	11	14	14	11	13
Giá trị trung bình, , μg/kg	0,10	0,18	0,07	0,09	0,17
Độ lệch chuẩn lặp lại, sr, μg/kg	0,004	0,024	0,010	0,007	0,021
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại, RSDr, %	3,5	13	14	8	12
Giới hạn lặp lại, r[r = 2,8 x sr], μg/kg	0,011	0,067	0,028	0,020	0,059
Độ lệch chuẩn tái lập, sR, μg/kg	0,012	0,042	0,017	0,008	0,039
Độ lệch chuẩn tương đối tái lập, RSDR, %	12	23	23	9	23
Giới hạn lặp lại, R[R = 2,8 x sR], μg/kg	0,034	0,118	0,048	0,022	0,109
Độ thu hồi, %	101	92	–	–	–
Giá trị HorRat, theo [7]	0,19	0,39	0,34	0,14	0,39
Giá trị HorRatR, theo [8]	0,55	1,05	1,01	0,41	1,05
a Mẫu nhiễm tự nhiên

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 6910-2 : 2001 (ISO 5725-2 : 1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.

[2] TCVN 6910-4 : 2001 (ISO 5725-4 : 1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 4: Phương pháp cơ bản xác định độ đúng của phương pháp đo tiêu chuẩn.

[3] TCVN 6910-6 : 2002 (ISO 5725-6 : 1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 6: Sử dụng các giá trị độ chính xác trong thực tế.

[4] Castegnaro M.; Barek J.; Fremy J.M; Lafontaine M; Sansone Ε.B.; Telling G.M., Laboratory decontamination and destruction of carcinogens in laboratory wastes: some mycotoxins. IARC Scientific Publication No. 113, International Agency for Research on Cancer, Lyon (France), 1991, p.63.

[5] Nesheim, S.; Trucksess, M.W.; Page, S.W., Molar absorptivities of aflatoxin B-1, B-2, G(1), and G(2) in acetonitrile, methanol, and toluene-acetonitrile (9+1) (modification of AOAC official method 971.22): Collaborative study, Journal of AOAC international, 1999, 82 (2), p. 251-258.

[6] Stroka, J.; Anklam, Ε.; Joerissen, U.; Gilbert, J., Immunoaffinity column clean-up with liquid chromatography using post-column bromination for the determination of aflatoxin B₁ in baby food: Collaborative study. Journal of AOAC International, 2001, 84, p. 1116.

[7] Horwitz, W.; Albert, R., The Horwitz Ratio (HorRat): A useful Index of Method Performance with Respect to Precision. Journal of AOAC International, 2006, 89, p. 1095-1109.

[8] Thompson M., Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb concentrations in relation to fitness for purpose criteria in proficiency testing, Analyst, 2000, 125, p. 385-386.