TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9524:2012 (EN 14133:2009) VỀ THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG OCHRATOXIN A TRONG RƯỢU VANG VÀ BIA – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CÓ LÀM SẠCH BẰNG CỘT ÁI LỰC MIỄN NHIỄM

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 9524:2012

EN 14133:2009

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG OCHRATOXIN A TRONG RƯỢU VANG VÀ BIA – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CÓ LÀM SẠCH BẰNG CỘT ÁI LỰC MIỄN NHIỄM

Foodstuffs – Determination of ochratoxin A in wine and beer – HPLC method with immunoaffinity column clean-up

Lời nói đầu

TCVN 9524:2012 hoàn toàn tương đương với EN 14133:2009;

TCVN 9524:2012 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố;

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG OCHRATOXIN A TRONG RƯỢU VANG VÀ BIA – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CÓ LÀM SẠCH BẰNG CỘT ÁI LỰC MIỄN NHIỄM

Foodstuffs – Determination of ochratoxin A in wine and beer – HPLC method with immunoaffinity column clean-up

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng ochratoxin A trong rượu vang và bia sử dụng sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) có làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm, xem [2] và [3].

Phương pháp này đã được đánh giá xác nhận trong một nghiên cứu liên phòng thử nghiệm theo Hướng dẫn của AOAC [4] về các thủ tục nghiên cứu cộng tác để đánh giá xác nhận phương pháp phân tích hàm lượng ochratoxin A trong rượu vang và bia qua việc phân tích các mẫu nhiễm tự nhiên và các mẫu rượu vang và bia thêm chuẩn ở các mức khác nhau trong dải từ 0,1 ng/ml đến 3 ng/ml.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851 (ISO 3696), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

3. Nguyên tắc

Mẫu rượu vang và bia được pha loãng bằng dung dịch chứa polyetylen glycol (PEG) và natri hydro cacbonat, sau đó được lọc và làm sạch bằng cột ái lực miễn nhiễm. Ochratoxin A được rửa giải bằng metanol và được định lượng bằng HPLC pha đảo, phát hiện bằng detector huỳnh quang.

CHÚ THÍCH: Sử dụng PEG là cần thiết để tăng độ thu hồi ochratoxin A và giảm số lượng và cường độ của các pic sắc kí khác.

4. Thuốc thử

4.1 Yêu cầu chung

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và chỉ sử dụng nước cất hoặc nước loại 1 của TCVN 4851 (ISO 3696), trừ khi có quy định khác.

Có thể sử dụng các thuốc thử có bán sẵn trên thị trường có các đặc tính tương đương với các loại được liệt kê dưới đây.

4.2 Natri clorua.

4.3 Natri hydro cacbonat.

4.4 Polyetylen glycol (khối lượng phân tử trung bình 8 000).

4.5 Metanol, loại dùng cho HPLC.

4.6 Axetonitril, loại dùng cho HPLC.

4.7 Nước, loại dùng cho HPLC.

4.8 Axit axetic băng, j(CH₃COOH) » 99 %.

4.9 Dung dịch pha loãng

Hòa tan 10 g polyetylen glycol (4.4) và 50 g natri hydro cacbonat (4.3) trong khoảng 950 ml nước và thêm nước đến 1 000 ml.

4.10 Dung dịch rửa

Hòa tan 25 g natri clorua (4.2) và 5 g natri hydro cacbonat (4.3) trong khoảng 950 ml nước và thêm nước đến 1 000 ml.

4.11 Pha động dùng cho HPLC

Trộn 990 ml nước dùng cho HPLC (4.7) với 990 ml axetonitril (4.6) và 20 ml axit axetic băng (4.8), lọc qua bộ lọc cỡ lỗ 0,45 mm và khử khí (ví dụ: bằng khí heli).

4.12 Toluen

4.13 Hỗn hợp dung môi của toluen và axit axetic băng

Trộn 99 phần thể tích toluen (4.12) với 1 phần thể tích axit axetic băng (4.8).

4.14 Dung dịch gốc ochratoxin A

Hòa tan 1 mg ochratoxin A (dạng tinh thể) hoặc lượng chứa trong 1 ampoule (nếu ochratoxin A ở dạng màng mỏng) trong hỗn hợp dung môi (4.13) để thu được dung dịch chứa khoảng từ 20 mg/ml đến 30 mg/ml ochratoxin A. Để xác định nồng độ chính xác, ghi lại đường hấp thụ giữa các bước sóng từ 300 nm đến 370 nm với các khoảng 5 nm trong cuvet thạch anh 1 cm (5.10) và sử dụng hỗn hợp dung môi (4.13) để so sánh. Xác định bước sóng có độ hấp thụ tối đa và tính nồng độ khối lượng của ochratoxin A, r_OTA, bằng microgram trên mililit, theo Công thức (1):

r_ota =                            (1)

Trong đó:

A_max là độ hấp thụ tối đa xác định được trên đường hấp thụ (trong trường hợp này là ở 333 nm);

M là khối lượng mol của ochratoxin A (M = 403,8 g/mol);

e là hệ số hấp thụ mol của ochratoxin A trong hỗn hợp dung môi (4.13) (trong trường hợp này là 544 m²/mol);

b là chiều dài đường quang của cuvet thạch anh, tính bằng centimet (cm).

Dung dịch này khi được bảo quản ở – 18 ^oC có thể bền được 4 năm.

4.15 Dung dịch chuẩn ochratoxin A

Pha loãng dung dịch gốc (4.14) bằng hỗn hợp dung môi (4.13) để thu được dung dịch chuẩn có nồng độ khối lượng của ochratoxin A là 2 mg/ml. Bảo quản dung dịch này trong tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng 4 ^oC và kiểm tra tính ổn định của dung dịch.

4.16 Dung dịch hiệu chuẩn ochratoxin A

Dùng pipet lấy 0,5 ml dung dịch chuẩn ochratoxin A nồng độ 2 mg/ml (4.15) cho vào bình định mức 10 ml (5.3) và cho bay hơi dung môi dưới dòng nitơ. Hòa tan lại trong 10 ml pha động (4.11). Dung dịch này có nồng độ khối lượng của ochratoxin A là 100 ng/ml.

Chuẩn bị sáu dung dịch hiệu chuẩn HPLC trong các bình định mức 5 ml (5.3) riêng rẽ theo Bảng 1. Pha loãng mỗi dung dịch bằng pha động dùng cho HPLC (4.11) đến 5 ml.

Bảng 1 – Chuẩn bị các dung dịch hiệu chuẩn

Chuẩn bị các dung dịch hiệu chuẩn trong ngày phân tích.

4.17 Cột ái lực miễn nhiễm

Cột ái lực miễn nhiễm phải chứa các kháng thể đối với ochratoxin A. Cột phải có khả năng chứa không nhỏ hơn 100 ng ochratoxin A và có độ thu hồi không nhỏ hơn 85 % khi sử dụng dung dịch rượu vang pha loãng có chứa 100 ng ochratoxin A.

5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

5.1 Cân vi lượng, có thể cân chính xác đến 0,01 mg

5.2 Lọ thủy tinh, dung tích khoảng 4 ml, có nắp vặn được lót bằng polytetrafloetylen (PTFE), hoặc nắp vặn kín thích hợp khác.

Một số lọ nhất định có thể làm thất thoát ochratoxin A trong quá trình làm bay hơi. Để tránh điều này, có thể áp dụng silan hóa. Chuẩn bị các lọ bằng cách đổ đầy dung dịch silan và để yên trong 1 min. Sau đó tráng lọ hai lần bằng dung môi thích hợp (toluen, axeton hoặc hexan) rồi rửa bằng nước (hai lần) và để khô.

5.3 Bình định mức, dung tích 5 ml và 10 ml.

5.4 Ống chân không, dùng cho cột ái lực miễn nhiễm.

5.5 Bình chứa và các phụ kiện thích hợp với cột ái lực miễn nhiễm.

5.6 Bộ lọc sợi thủy tinh, cỡ lỗ 1,6 mm, (ví dụ: loại Whatman GF/A1) hoặc tương đương).

5.7 Bộ làm bay hơi dung môi.

5.8 Xyranh microlit đã hiệu chuẩn hoặc pipet microlit đã hiệu chuẩn.

5.9 Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao, gồm có:

5.9.1 Hệ thống bơm, van bơm dạng xyranh có vòng bơm 100 ml hoặc loại tương đương.

5.9.2 Bơm dùng cho HPLC, đẳng dòng, có thể duy trì được tốc độ dòng thể tích 1,0 ml/min.

5.9.3 Cột phân tích pha đảo, ví dụ như thép không gỉ (dài 150 mm, đường kính trong 4,6 mm) được nhồi bằng vật liệu pha đảo C18, cỡ hạt 5 mm, trước cột có cột bảo vệ pha đảo thích hợp hoặc bộ lọc bảo vệ (cỡ lỗ 0,5 mm). Có thể sử dụng cột có kích thước khác nếu cột đáp ứng được độ phân giải đường nền của pic ochratoxin A ra khỏi các pic khác.

5.9.4 Detector huỳnh quang, được trang bị cuvet dòng chảy và được cài đặt bước sóng kích thích ở 333 nm và bước sóng phát xạ ở 460 nm. Detector này phải phát hiện được ochratoxin A ở nồng độ nhỏ nhất là 0,02 ng.

5.9.5 Hệ thống dữ liệu

5.10 Máy đo phổ UV, có các cuvet thạch anh thích hợp.

6. Cách tiến hành

6.1 Chuẩn bị mẫu

Khử khí rượu vang nổ và bia trước khi pha loãng. Rót 10 ml rượu vang (hoặc bia) vào bình nón dung tích 100 ml có thể đậy kín. Thêm 10 ml dung dịch pha loãng (4.9) và trộn kỹ. Lọc qua bộ lọc sợi thủy tinh (5.6) khi dung dịch vẩn đục hoặc có cặn rắn hình thành sau khi pha loãng.

Nếu gặp phải vấn đề này khi khử khí thì tiến hành siêu âm mẫu trong 1 h, mẫu đã được làm nguội trước 30 min ở + 4 ^oC để tránh tạo bọt nhanh.

6.2 Làm sạch cột ái lực miễn nhiễm

Chuẩn bị cột ái lực miễn nhiễm theo hướng dẫn của nhà cung cấp.

Nối cột ái lực miễn nhiễm (4.17) với ống chân không (5.4) và nối bình chứa (5.5) với cột ái lực miễn nhiễm. Cho 10 ml dung dịch đã pha loãng (tương đương 5 ml rượu vang hoặc bia) vào bể và cho đi qua cột ái lực miễn nhiễm ở tốc độ dòng khoảng 1 giọt trên giây. Không để cột chảy đến khô. Rửa cột bằng 5 ml dung dịch rửa (4.10) và sau đó rửa bằng 5 ml nước với tốc độ dòng từ 1 giọt đến 2 giọt trên giây. Cho không khí đi qua cột để làm khô cột. Tách cột ra khỏi ống chân không và đặt lên trên lọ (5.2).

6.3 Chuẩn bị dung dịch mẫu thử

Rửa giải ochratoxin A vào lọ bằng cách cho 2 ml metanol (4.5) đi qua cột ở tốc độ 1 giọt trên giây. Cho bay hơi dịch rửa giải đến khô dưới dòng khí nitơ ở nhiệt độ khoảng 50 ^oC. Hòa tan lại trong 250 ml pha động dùng cho HPLC (4.11) và bảo quản ở 4 ^oC cho đến khi phân tích bằng HPLC. Dung dịch này là dung dịch thử.

7. Phân tích bằng HPLC

7.1 Phân tích mẫu

Bơm 100 ml dịch chiết (6.3) (tương đương với 2 ml rượu vang hoặc bia) vào máy sắc kí sử dụng pha động (4.11) ở tốc độ dòng 1,0 ml/min.

7.2 Chuẩn bị đường chuẩn

Chuẩn bị đường chuẩn trong ngày phân tích và khi có sự thay đổi về điều kiện sắc kí.

Bơm 100 ml mỗi dung dịch hiệu chuẩn (4.16) vào máy HPLC và dựng đồ thị các giá trị chiều cao pic hoặc diện tích pic của các dung dịch hiệu chuẩn ochratoxin A theo khối lượng ochratoxin A tính bằng nanogam.

Nếu hàm lượng ochratoxin A của mẫu nằm ngoài dải hiệu chuẩn, thì tiến hành pha loãng hoặc sử dụng thể tích bơm nhỏ hơn; trong các trường hợp này, phần tính kết quả phải được điều chỉnh tương ứng.

Do dải các nồng độ rộng, nên đường chuẩn cần phải đi qua điểm “zero” để định lượng chính xác hơn các nồng độ ochratoxin A thấp (< 0,1 ng/ml).

7.3 Nhận biết

Nhận biết chất phân tích bằng cách so sánh thời gian lưu của các pic tương ứng trong mẫu với thời gian lưu của pic chất chuẩn trên sắc phổ.

Đôi khi có thể cần phải nhận biết pic bằng cách bơm đồng thời dung dịch mẫu thử và dung dịch chuẩn.

7.4 Xác định

Tiến hành xác định bằng phương pháp ngoại chuẩn, tích phân diện tích pic hoặc xác định chiều cao pic và so sánh các kết quả với các giá trị tương ứng đối với chất chuẩn có diện tích hoặc chiều cao pic gần nhất, hoặc sử dụng đường chuẩn. Khi sử dụng đường chuẩn, có thể chuẩn bị thêm các dung dịch bổ sung với các nồng độ nằm trong dải tuyến tính.

Bơm các thể tích bằng nhau của dung dịch mẫu thử và dung dịch chuẩn để dựng đường chuẩn.

Nếu độ đáp ứng ochratoxin A của mẫu thử nằm ngoài dải hiệu chuẩn, thì điều chỉnh lượng mẫu bơm vào bằng cách pha loãng dung dịch mẫu thử.

8. Tính kết quả

Đọc từ đường chuẩn khối lượng ochratoxin A trong phần dung dịch mẫu thử được bơm vào cột HPLC, tính bằng nanogam.

Tính nồng độ khối lượng ochratoxin A, r_OTA, bằng nanogram trên mililit, theo Công thức (2):

r_OTA =                             (2)

Trong đó:

m_OTA là khối lượng ochratoxin A trong phần dung dịch mẫu thử được bơm vào cột HPLC xác định được từ đường chuẩn, tính bằng nanogam (ng);

2 là hệ số pha loãng;

V₁ là thể tích mẫu thử cần phân tích, tính bằng mililit (trong trường hợp này là 10 ml);

V₂ là thể tích dung dịch thử được bơm lên cột, tính bằng microlit (trong trường hợp này là 100 ml);

V₃ là thể tích pha động được dùng để hòa tan chất rửa giải đã làm khô, tính bằng microlit (trong trường hợp này là 250 ml).

9. Độ chụm

9.1 Phép thử liên phòng thử nghiệm

Các chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục A. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và chất nền khác với các dải nồng độ và chất nền nêu trong Phụ lục A.

9.2 Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau do một người thực hiện sử dụng cùng thiết bị trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp vượt quá giá trị giới hạn lặp lại r.

Các giá trị đối với rượu vang trắng là:

Các giá trị đối với rượu vang đỏ là:

Các giá trị đối với bia là:

9.3 Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ, thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau được báo cáo từ hai phòng thử nghiệm, không được quá 5 % các trường hợp vượt quá giá trị giới hạn tái lập R.

Các giá trị đối với rượu vang trắng là:

Các giá trị đối với rượu vang đỏ là:

Các giá trị đối với bia là:

10. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm các thông tin sau:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết mẫu thử (kiểu loại mẫu, nguồn gốc mẫu, tên gọi);

b) viện dẫn tiêu chuẩn này;

c) ngày và loại quy trình lấy mẫu (nếu biết);

d) ngày nhận mẫu;

e) ngày thử nghiệm;

f) các kết quả thử và các đơn vị biểu thị kết quả;

g) các chi tiết bất thường quan sát được trong khi tiến hành thử nghiệm;

h) mọi chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc tùy chọn có thể ảnh hưởng đến kết quả.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Dữ liệu về độ chụm

Các dữ liệu nêu trong Bảng A.1 đến Bảng A.3 thu được từ một phép thử liên phòng thử nghiệm [5] phù hợp với các Hướng dẫn của AOAC về thủ tục nghiên cứu cộng tác để đánh giá xác nhận phương pháp phân tích [4].

Bảng A.1 – Dữ liệu về độ chụm đối với rượu vang trắng

Bảng A.2 – Dữ liệu về độ chụm đối với rượu vang đỏ

Bảng A.3 – Dữ liệu về độ chụm đối với bia

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Castegnaro M., Barek J., Fremy J.M., Lafontaine M., Miraglia M., Sansone E.B. and Telling G.M Laboratory decontamination and destruction of carcinogens in laboratory wastes: some mycotoxins. IARC Scientific Publication No. 113, International Agency for Research on Cancer, Lyon (France), 1991, 63 p.

[2] Visconti, A., Pascale, M., and Centonze, G.: Determination of ochratoxin A in wine by means of immunoaffinity column clean-up and high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A, 864, 1999, 89-101.

[3] Visconti, A., Pascale, M., and Centonze, G.: Determination of ochratoxin A in domestic and imported beers in Italy by immunoaffinity clean-up and liquid chromatography. Journal of Chromatography A, 2000, 888, 321-326.

[4] Guidelines for Collaborative Study to Validate Characteristics of a Method of Analysis” J.AOAC Int. 72, 1989, 694-704.

[5] Visconti A, Pascale M, Centonze G.: (2001) Determination of ochratoxin A in wine and beer by  immunoaffinity column clean-up and liquid chromatographic analysis with flurometric detection: Collaborative study. J AOAC Int 84:1818-1827.