TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9634:2013 (ISO/TS 27265:2009/IDF/RM 228:2009) VỀ SỮA BỘT – ĐỊNH LƯỢNG BÀO TỬ ĐẶC BIỆT BỀN NHIỆT CỦA VI KHUẨN ƯA NHIỆT

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 9634:2013

ISO/TS 27265:2009

SỮA BỘT – ĐỊNH LƯỢNG BÀO TỬ ĐẶC BIỆT BỀN NHIỆT CỦA VI KHUẨN ƯU NHIỆT

Dried milk – Enumeration of the specially thermoresistant spores of thermophilic bacteria

Lời nói đầu

TCVN 9634:2013 hoàn toàn tương đương với ISO/TS 27265:2009/IDF/RM 228:2009;

TCVN 9634:2013 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

SỮA BỘT – ĐỊNH LƯỢNG BÀO TỬ ĐẶC BIỆT BỀN NHIỆT CỦA VI KHUẨN ƯU NHIỆT

Dried milk – Enumeration of the specially thermoresistant spores of thermophilic bacteria

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp định lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) từ các bào tử đặc biệt bền nhiệt của các vi khuẩn ưu nhiệt trong sản phẩm sữa bột, bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc ở 55⁰C sau khi gia nhiệt mẫu ở 106⁰C.

Khả năng áp dụng của tiêu chuẩn này bị hạn chế đối với sữa bột nguyên chất, sữa bột gầy và sản phẩm buttermilk được dùng để pha trộn và sử dụng trong sản xuất các sản phẩm sữa tiệt trùng (ví dụ: xử lý bằng UHT hoặc hấp thanh trùng).

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 6404 (ISO 7218), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Yêu cầu chung và hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật.

TCVN 6507-5 (ISO 6887-5), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật – Phần 5: Các nguyên tắc cụ thể với mẫu sữa và sản phẩm sữa 1).

TCVN 8128-1 (ISO/TS 11133-1), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Hướng dẫn chuẩn bị và sản xuất môi trường nuôi cấy – Phần 1: Hướng dẫn chung về đảm bảo chất lượng đối với việc chuẩn bị môi trường nuôi cấy trong phòng thử nghiệm.

3. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau đây:

3.1. Bào tử đặc biệt bền nhiệt của các vi khuẩn ưa nhiệt (specially thermoresistant spores of thermophilic bacteria).

Các bào tử vi khuẩn sống sót sau khi xử lý nhiệt ở 106⁰C trong 30 min hình thành các khuẩn lạc trên môi trường không chọn lọc khi ủ hiếu khí ở 55⁰C, trong các điều kiện quy định trong tiêu chuẩn này.

4. Nguyên tắc

Một lượng quy định huyền phù ban đầu của mẫu thử được xử lý nhiệt ở 106⁰C trong 30 min.

Chuẩn bị các đĩa Petri, sử dụng môi trường nuôi cấy không chọn lọc quy định và một lượng xác định của huyền phù ban đầu đã xử lý nhiệt.

Chuẩn bị các đĩa khác trong cùng một điều kiện, với các dung dịch pha loãng thập phân của huyền phù ban đầu đã xử lý nhiệt.

Ủ các đĩa đã cấy 48h trong môi trường hiếu khí ở 55⁰C.

Tính số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) từ các bào tử đặc biệt bền nhiệt của các vi khuẩn ưu nhiệt trên 1g sản phẩm từ số khuẩn lạc thu được trên các đĩa đã chọn ở các mức pha loãng sao cho thu được kết quả có ý nghĩa.

Các bào tử đặc biệt bền nhiệt của các vi khuẩn ưu nhiệt có khả năng sống sót sau khi tiệt trùng (xử lý bằng UHT hoặc hấp thanh trùng) được đếm bằng phương pháp này.

5. Thạch sữa gầy dùng để đếm đĩa BCP chứa 0,2% khối lượng tinh bột.

Hướng dẫn chung, xem TCVN 6404 (ISO 7218).

Trong quá trình phân tích, chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

5.1. Bromocresol purple (đỏ tía bromocresol)

5.1.1. Thành phần

5.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan bromocresol purple trong etanol. Bảo quản dung dịch này trong chai có nắp đậy kín để tránh làm bay hơi.

5.2. Môi trường hoàn chỉnh

5.2.1. Thành phần

5.2.2. Chuẩn bị

Hòa tan từng thành phần trong nước bằng cách đun sôi trong khi vẫn khuấy cho đến hòa tan hết.

Nếu cần, chỉnh pH để sau khi khử trùng, pH là 7,0 ± 0,2 ở 25⁰C. Khử trùng 15 min bằng hấp áp lực ở 121⁰C ± 1⁰C.

Môi trường có thể được chuẩn bị từ thạch sữa gầy dùng để đếm đĩa, dạng khô thích hợp có bán sẵn trên thị trường, cần bổ sung các thành phần bổ sung.

6. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm vi sinh, các dụng cụ cần thiết để xử lý mẫu thử và các dung dịch pha loãng theo quy định trong TCVN 6404 (ISO 7218) và TCVN 6507-5 (ISO 6887-5) và các loại sau:

Có thể dùng các dụng cụ sử dụng một lần để thay cho các dụng cụ thủy tinh sử dụng được nhiều lần, nếu phù hợp với các yêu cầu quy định.

6.1. Tủ ấm, có khả năng duy trì ở 55⁰C ± 1⁰C.

6.2. Nồi cách thủy, có khả năng duy trì nhiệt độ từ 15⁰C đến 25⁰C và ở 45⁰C ± 1⁰C.

6.3. Máy đo pH bù nhiệt, có thể đọc chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH ở 25⁰C.

6.4. Thiết bị gia nhiệt mẫu, bình áp lực hoặc nồi hấp áp lực nhỏ có thể tăng nhiệt độ của mẫu từ 100⁰C đến 105,5 ⁰C trong thời gian ít hơn 6 min và có thể duy trì nhiệt độ của ống mẫu ở 106⁰C ± 0,5⁰C trong suốt quá trình xử lý nhiệt. Bình áp lực phải có khả năng làm nguội nhanh đến 100⁰C sau khi xử lý nhiệt xong. Thong thường, bình này cần có van xả.

Trừ khi bình đã được lắp ráp sẵn, bình áp lực cần được sửa đổi (ví dụ: có nút cao su trên nắp) sao cho bộ cảm biến nhiệt có thể đi qua nắp vào trong bình.

Ví dụ mô tả chi tiết về kết cấu của bình áp lực thích hợp được nêu trong Phụ lục A.

6.5. Nhiệt kế điện tử, được gắn bộ cảm biến nhiệt kiểu hẹp, có thể đo chính xác đến 106⁰C ± 0,1⁰C và có thể đi qua van vào trong nắp bình áp lực.

6.6. Nguồn nhiệt, thiết bị dùng khí hoặc điện.

6.7. Ống nghiệm, có nắp vặn và có dung tích đủ để có khoảng trống phía trên để trộn 10 ml mẫu thử. Nắp vặn có ống mẫu (xem 8.2.2) cần được thiết kế sao cho bộ cảm biến nhiệt (6.5) được sử dụng có thể lắp khít được.

6.8. Giá đựng ống nghiệm, có thể phù hợp với bình áp lực như trong Hình A.

6.9. Đồng hồ bấm giờ, 2 cái.

6.10. Pipet chia độ, được nhét bông ở phía đầu, đã hiệu chỉnh đến 1 ml ± 0,02 ml, hoặc 10 ml ± 0,2 ml.

6.11. Đĩa Petri, đường kính từ 85 mm đến 100 mm.

6.12. Thiết bị đếm khuẩn lạc, bao gồm một bộ phận chiếu sáng có nền đen, được gắn với một kính lúp có độ khuếch đại ít nhất 1,5 lần và có một dụng cụ đến cơ hoặc điện tử.

7. Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707).

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không được hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình bảo quản và vận chuyển.

8. Cách tiến hành

8.1. Chuẩn bị mẫu thử và dung dịch pha loãng ban đầu

Chuẩn bị dung dịch pha loãng ban đầu (10^-1) theo TCVN 6705-5 (ISO 6887-5).

8.2. Xử lý nhiệt mẫu thử

8.2.1. Dùng một pipet vô trùng (6.10), chuyển 10 ml dung dịch pha loãng ban đầu (10^-1) của từng mẫu thử vào ống nghiệm (6.7). Đậy ống nhưng không vặn quá chặt.

8.2.2. Chuẩn bị ống nghiệm có chứa 10 ml dung dịch pha loãng ban đầu (10^-1) của một trong các mẫu thử theo cùng cách như trong 8.2.1.

8.2.3. Đặt bình áp lực (6.4) đựng một lượng nước thích hợp trên nguồn nhiệt (6.6) và đun sôi nước.

8.2.4. Lắp các ống nghiệm và đầu mẫu vào giá đựng (6.8). Lắp bộ cảm biến nhiệt (6.5) qua nắp vặn của ống mẫu và nhúng hoàn toàn ống này vào mẫu. Đậy ống nghiệm.

8.2.5. Khi nước sôi, đặt giá đựng các ống nghiệm vào bình áp lực và bật đồng hồ bấm giờ (6.9). Đảm bảo rằng bộ cảm biến nhiệt của ống mẫu vẫn ngập trong mẫu và bộ cảm biến nhiệt của buồng áp lực vẫn đúng vị trí. Đậy nắp bình áp lực và mở van hơi.

8.2.6. Khi nhiệt độ mẫu trong ống nghiệm đạt 100⁰C, đóng van hơi.

8.2.7. Khi nhiệt độ mẫu trong ống nghiệm đạt 105,5⁰C, tắt đồng hồ bấm giờ và ghi lại thời gian. Thời gian này không được quá 6 min.

8.2.8. Khi nhiệt độ mẫu trong ống nghiệm đạt 105,5⁰C, bật đồng hồ bấm giờ thứ hai (6.9).

8.2.9. Cho tăng nhiệt độ sao cho nhiệt độ mẫu trong ống nghiệm đạt 106⁰C ± 0, ⁰C. Ổn định ở nhiệt độ này trong suốt quá trình thử bằng cách giảm đầu vào của nguồn nhiệt để đảm bảo duy trì nhiệt độ đúng và ngăn ngừa việc bay hơi nước không cần thiết.

8.2.10. Sau 30 min kể từ khi bắt đầu bật đồng hồ bấm giờ thứ hai trong 2.8.2, tắt nguồn nhiệt. Lấy bình áp lực ra khỏi nguồn nhiệt và xả áp suất ngay bằng cách mở van hơi để hạ nhiệt nhanh. Mở bình áp lực ngay khi nhiệt độ của ống mẫu giảm đến 100⁰C. Chuyển ngay giá đựng mẫu sang nồi cách thủy (6.2) được duy trì ở nhiệt độ từ 15⁰C đến 25⁰C để làm nguội mẫu.

8.3. Cấy và ủ

8.3.1. Sau khi mẫu đã nguội, chuẩn bị sáu đĩa Petri vô trùng (6.11). Dùng Pipet vô trùng (6.10) chuyển 1 ml mẫu thử đã làm nóng (độ pha loãng 10^-1) sang ba trong sáu đĩa Petri, mỗi đĩa khoảng một phần ba lượng mẫu.

CHÚ THÍCH: cách này làm giảm độ đục của thạch và đảm bảo được tất cả các khuẩn lạc có thể nhìn thấy được dễ dàng

Lặp lại quy trình này với ba đĩa còn lại.

8.3.2. Chuẩn bị dung dịch pha loãng 10^-2 của mẫu thử đã làm nóng. Lấy thêm hai đĩa Petri vô trùng (6.11). Dùng Pipet vô trùng khác chuyển sang hai đĩa mỗi đĩa 1 ml dung dịch pha loãng 10^-2.

8.3.3. Lặp lại quy trình này sử dụng các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo, theo TCVN 6507-5 (ISO 6887-5), nếu cần.

8.3.4. Rót khoảng 15 ml môi trường (Điều 5), đã làm tan chảy trước và được duy trì trong nồi cách thủy (6.2) ở 45⁰C, vào mỗi đĩa Petri đã chuẩn bị.

8.3.5. Trộn kỹ dịch cấy với môi trường bằng cách xoay đĩa Petri. Để cho hỗn hợp đông đặc bằng cách để đĩa yên trên mặt phẳng nằm ngang, mát.

8.3.6. Thời gian từ khi chuẩn bị dung dịch pha loãng thứ nhất đến khi trộn chất cấy với môi trường không được quá 15 min.

8.3.7. Chuẩn bị đủ lượng đĩa kiểm soát để kiểm tra độ vô trùng.

8.3.8. Sau khi các đĩa đã chuẩn bị được lật ngược, đặt chúng vào tủ ẩm (6.1) ở 55⁰C trong 48h ± 2h. Để giảm thiểu sự bay hơi, bọc các đĩa trong túi bằng chất dẻo được làm kín.

8.4. Đếm khuẩn lạc

8.4.1. Sau thời gian ủ ấm quy định (8.3.8), đếm khuẩn lạc trên mỗi đĩa Petri dưới ánh sáng dịu sử dụng thiết bị đếm khuẩn lạc (6.12). Đảm bảo các khuẩn lạc nhỏ đã được đếm.

Bổ sung bromocresol purple vào môi trường (Điều 5) để dễ nhìn thấy các khuẩn lạc hơn. Tuy nhiên, các khuẩn lạc có thể có màu đỏ tía hoặc màu vàng tùy thuộc vào axit đã được tạo thành hay chưa. Do đó, cần đến tất cả các khuẩn lạc trên đĩa.

8.4.2.  Người phân tích cần tránh đếm nhầm các hạt nhỏ của các chất không hòa tan hoặc chất kết tủa trên các đĩa là các khuẩn lạc nhỏ.

Dùng kính có độ phóng đại lớn để kiểm tra các khuẩn lạc bị nghi ngờ, nếu cần, sao cho có thể phân biệt được các khuẩn lạc với các chất ngoại lai.

8.4.3. Những khuẩn lạc mọc lan được xem là những khuẩn lạc đơn lẻ. Nếu các khuẩn lạc mọc lan nhưng ít hơn 1/4 bề mặt đĩa thì đếm những khuẩn lạc trên phần còn lại của đĩa và tính số lượng tương ứng cho toàn đĩa.

Nếu các khuẩn lạc mọc lan rộng hơn 1/4 bề mặt đĩa thì loại bỏ đĩa đó.

8.4.4. Khi 1 ml mẫu (độ pha loãng 10^-1) đã được phân bố trên khắp ba đĩa thì ghi lại tổng số các khuẩn lạc đếm được trên các đĩa riêng rẽ là số đếm cho độ pha loãng cụ thể đó.

8.4.5. Giữ lại các đĩa và ghi lại kết quả khi các số đếm CFU đối với đĩa riêng rẽ (hoặc số đếm của cả ba đĩa) nhỏ hơn 300. Cũng cần đảm bảo rằng tất cả các số đếm trong phạm vi quan tâm (kể cả các số đếm nằm ngoài phạm vi có ý nghĩa thống kê) được ghi lại.

8.5. Tính và biểu thị kết quả

Xem TCVN 6404 (ISO 7218) về việc tính và biểu thị kết quả.

9. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm độc lập riêng rẽ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, tiến hành trên vật liệu giống hệt nhau, do cùng một người tiến hành trong cùng một phòng thử nghiệm, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5% các trường hợp vượt quá 0,4 lg n2), trong đó n là số đếm CFU.

CHÚ THÍCH: Định nghĩa về độ lặp lại được nêu trong TCVN 6910-1 (ISO 5725-1)^[2]

Nếu không thỏa mãn các yêu cầu về độ lặp lại thì cần xem xét nguồn gốc có khả năng gây sai lệch.

10. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải chỉ ra:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu để sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi chi tiết không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy chọn, cũng như mọi chi tiết bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả thử;

e) kết quả thử nghiệm thu được, nêu rõ phương pháp biểu thị kết quả.

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

CẢI TIẾN QUY TRÌNH NỒI ÁP LỰC ĐỂ THỰC HIỆN THỬ NGHIỆM BÀO TỬ ƯU NHIỆT

A.1. Bình áp lực, dung tích 6 lít, có thể duy trì nhiệt độ ở 106⁰C ± 0,5⁰C, ví dụ: nồi áp lực cải tiến “Kiểu thiết kế Chef” (xem Hình A.1)3).

CHÚ DẪN:

1 van xả [kiểu Burkert 2832]

2 nhiệt kế điện tử – Nhiệt độ ống mẫu

3 bộ kiểm soát [kiểu Burket 8625-2] nhiệt độ buồng

4 nồi áp lực “Kiểu thiết kế Chef”.

Hình A.1 – Bố trí thực nghiệm về kiểm tra nhiệt độ ống mẫu

A.2. Kiểm soát áp lực, thay đổi nồi áp lực như sau để duy trì nhiệt độ bình áp lực ở 106⁰C ± 0,5⁰C (xem Hình A.1).

Lắp van xả trực tiếp vào nắp của nồi áp lực. Van này để giải phóng hơi khi nhiệt độ của buồng đạt đến nhiệt độ tối đa cho phép đối với mẫu thử.

Điều khiển mở và đóng van xả bằng núm điều khiển kiểm soát nhiệt độ trong nồi áp lực qua bộ cảm ứng nhiệt Pt-100 (xem Hình A.2).

Lắp kín hai bộ phận nối nén (bằng đệm cao su) với nắp của nồi áp lực sao cho bộ cảm biến nhiệt Pt-100 và bộ cảm biến nhiệt của ống mẫu (6.4) có thể đi xuyên qua chúng vào buồng của nồi áp lực (xem Hình A.2).

Dụng cụ sau đây là thích hợp để đạt được áp suất thích hợp và kiểm soát nhiệt độ:

a) van xả trực tiếp tương ứng [kiểu Burkert 2832 4)];

b) bộ kiểm soát [kiểu burkert 8625-2 ⁴⁾].

Cài đặt chương trình kiểm soát cho nhiệt độ của mẫu trong ống mẫu được duy trì ở 106⁰C ± 0,5 ⁰C.

Khi dùng bộ kiểm soát kiểu burkert 8625-2 ⁴⁾, việc điều chỉnh việc cài đặt nhiệt độ, hệ số khuếch đại và thời gian xung là các thông số cơ bản để đảm bảo nhiệt độ 106⁰C ± 0,5⁰C được duy trì trong suốt 30 min xử lý nhiệt thử nghiệm.

CHÚ DẪN:

1 ống giải phóng hơi nước

2 van xả [kiểu burkert 2832]

3 bộ phận nối nén (bằng đệm cao su) – Bộ cảm biến nhiệt của ống mẫu

4 bộ phận nối nén (bằng đệm cao su) – Bộ cảm biến nhiệt của buồng Pt-100.

Hình A.2 – Van xả tương ứng và các bộ phận nối nén cho phép bộ cảm ứng nhiệt và Pt-100 đi vào buồng

A.3. Giá đựng ống thử nghiệm Hình A.3 cho thấy giá đựng được xây dựng để tối đa hóa số lượng ống nghiệm phù hợp với nồi áp lực.

Hình A.3 – Giá đựng ống nghiệm phù hợp với nồi áp lực

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa – Hướng dẫn lấy mẫu.

[2] TCVN 6910-1 (ISO 5725-1), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung.