TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9659:2013 (ISO 11814 : 2002) VỀ SỮA BỘT – ĐÁNH GIÁ CƯỜNG ĐỘ XỬ LÝ NHIỆT – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 9659 : 2013

ISO 11814 : 2002

SỮA BỘT – ĐÁNH GIÁ CƯỜNG ĐỘ XỬ LÝ NHIỆT – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Dried milk – Assessment of heat treatment intensity – Method using high-performance liquid chromatography

Lời nói đầu

TCVN 9659 : 2013 hoàn toàn tương đương với ISO 11814:2002;

TCVN 9569 : 2013 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

Lời giới thiệu

Các mức giới hạn đối với sữa bột gầy xử lý nhiệt thấp (cực thấp) có thể bị ảnh hưởng bởi nguồn gốc sữa nguyên liệu dùng để chế biến cũng như việc xử lý nhiệt trong khi chế biến sữa bột hoặc của mẫu đối chứng (xem 4.4). Do đó, trong tiêu chuẩn này không đưa ra các giới hạn về tỷ lệ tương đối, r (xem 9.1) và tỷ lệ tương đối của mẫu, r_t (xem 9.3). Nhưng cũng nên có quy định về các giới hạn chuẩn r và r­_t đối với sữa bột xử lý nhiệt cực thấp, tùy thuộc vào các yêu cầu áp dụng. Các giới hạn chuẩn cần dựa vào quy định hiện hành.

SỮA BỘT – ĐÁNH GIÁ CƯỜNG ĐỘ XỬ LÝ NHIỆT – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Dried milk – Assessment of heat treatment intensity – Method using high-performance liquid chromatography

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp đánh giá cường độ xử lý nhiệt bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được áp dụng cho quá trình chế biến sữa bột, nhằm phân biệt sữa bột gầy được xử lý nhiệt cực thấp với sữa bột gầy được xử lý nhiệt thấp.

2. Thuật ngữ và định nghĩa

Tiêu chuẩn này áp dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

2.1. Sữa bột gầy xử lý nhiệt cực thấp (extra-low-heat skim milk powder)

Sữa bột gầy có hàm lượng tối thiểu whey protein biến tính xác định được bằng quy trình quy định trong tiêu chuẩn này.

3. Nguyên tắc

Sữa bột được hòa tan trong nước. Casein và các whey protein biến tính được kết tủa đẳng điện ở pH 4,6. Các whey protein không biến tính có mặt trong dịch lọc được xác định bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Giải thích kết quả thu được.

4. Thuốc thử

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước đã loại khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương, trừ khi có quy định khác.

4.1. Axit clohydric, c(HCl) » 1 mol/l

Pha loãng 80 ml axit clohydric đậm đặc [37 % (khối lượng)] bằng nước đến 1 000 ml và trộn.

4.2. Dung môi rửa giải, pH 6,0

Hòa tan 1,74 g dikali hydro phosphat (K₂HPO₄), 12,37 g kali dihydro phosphat (KH₂PO₄) và 21,41 g natri sulfat (Na₂SO₄) trong khoảng 700 ml nước. Chỉnh pH đến 6,0 bằng dung dịch axit phosphoric (85 %) hoặc dung dịch kali hydroxit (10 mol/l), nếu cần.

Pha loãng bằng nước đến 1 000 ml và trộn. Lọc dung môi rửa giải qua màng lọc 0,45 mm trước khi sử dụng.

4.3. Dung môi rửa

Trộn 100 ml axetonitril (CH₃CN) với 900 ml nước. Lọc hỗn hợp qua màng lọc 0,45 mm trước khi sử dụng.

Có thể sử dụng dung môi rửa khác với điều kiện là chúng phải ức chế vi khuẩn phát triển và không ảnh hưởng đến hiệu quả tách của cột.

4.4. Mẫu đối chứng

Dùng sữa bột gầy được xử lý nhiệt cực thấp, chứa hàm lượng tối thiểu whey protein biến tính.

5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và cụ thể các thiết bị, dụng cụ sau:

5.1. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 1 mg, có thể đọc được đến 0,1 mg.

5.2. Cốc có mỏ, dung tích 50 ml.

5.3. Ống đong chia độ, dung tích 50 ml.

5.4. Pipet chia độ, có thể phân phối được 2 ml.

5.5. Bộ khuấy từ.

5.6. Giấy lọc, loại trung bình, đường kính khoảng 15 cm.

5.7. Phễu lọc, đường kính khoảng 7 cm.

5.8. Bình nón, dung tích 50 ml.

5.9. Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao, gồm có các bộ phận sau:

5.9.1. Bộ khuấy từ, có bộ phận giữ nóng dung môi rửa giải ở 85 ^oC ± 1 ^oC.

5.9.2. Bơm, có tốc độ dòng 1,0 ml/min.

5.9.3. Bộ bơm mẫu, tự động hoặc thủ công, dung tích bơm 20 ml.

5.9.4. Cột Bio Zorbax, cột GF-250, dài 25 cm và đường kính trong 0,94 cm hoặc cột loại tương đương kết hợp với tiền cột, dài 3 cm, đường kính trong 0,3 cm, được nhồi bằng protein l-125 (Milipore Waters) hoặc chất nhồi cột tương đương1).

CHÚ THÍCH: Thời gian lưu điển hình thu được bằng quy trình quy định trong tiêu chuẩn này và sử dụng cột GF-250 (xem các ví dụ trong Hình A.1 và A.2) là:

– phần immunoglobulin (lg): 8,2 min

– phần albumin huyết tương bò (BSA): 8,8 min

– phần b-lactoglobulin A và B (b-Lg): 9,7 min

– a-lactalbumin (a-La): 10,6 min.

5.9.5. Lò cột đẳng nhiệt, có thể duy trì được nhiệt độ ở 30 ^oC ± 1 ^oC.

5.9.6. Detector UV, có thể hoạt động ở 280 nm.

5.9.7. Bộ tích phân, có thể đo được diện tích pic.

Chọn các thông số kiểm soát tích phân sao cho:

a) đường nền xác định rõ vị trí bắt đầu và kết thúc của sắc đồ (xem Hình A.2),

b) các diện tích pic của whey protein đo được bằng phương pháp hạ đường vuông góc (xem Hình A.2), và

c) pic cuối cùng từ mẫu trước không được ảnh hưởng đến kết quả tích phân của mẫu tiếp theo.

6. Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707).

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải đúng là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng hoặc không bị thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Bảo quản mẫu sao cho không bị thay đổi thành phần và không bị suy giảm chất lượng.

7. Chuẩn bị mẫu thử

Chuyển mẫu thử vào vật chứa có dung tích lớn gấp đôi thể tích mẫu, có nắp đậy kín khí. Đậy ngay vật chứa. Trộn kỹ sữa bột bằng cách lắc và đảo chiều vật chứa nhiều lần.

8. Cách tiến hành

8.1. Phần mẫu thử

Cân 2 g mẫu thử đã chuẩn bị (Điều 7), chính xác đến 1 mg, cho vào cốc có mỏ (5.2).

8.2. Dung dịch thử

8.2.1. Thêm 40 ml nước đã làm ấm trước đến 40 ^oC. Hòa tan phần mẫu thử bằng cách khuấy trong 30 min bằng bộ khuấy từ (5.5).

8.2.2. Chỉnh pH của dung dịch thử đến 4,6 bằng cách thêm từng giọt axit clohydric (4.1) sử dụng pipet chia độ (5.4). Dùng bộ khuấy từ (5.5) để khuấy liên tục trong khi chỉnh pH. Để yên hỗn hợp 15 min ở nhiệt độ phòng. Kiểm tra pH của hỗn hợp và chỉnh lại pH đến 4,6, nếu cần.

8.2.3. Lọc hỗn hợp qua giấy lọc (5.6) cho vào bình nón (5.8), loại bỏ phần đầu của dịch lọc.

8.3. Dung dịch đối chứng

Cân 2 g mẫu đối chứng (4.4), chính xác đến 1 mg, cho vào cốc có mỏ (5.2) và tiến hành theo 8.2.

8.4. Xác định bằng HPLC

8.4.1. Trong suốt quá trình phân tích bằng HPLC, duy trì bể hứng dịch rửa giải ở nhiệt độ 85 ^oC để giữ cho dịch rửa giải khử khí và để ngăn ngừa vi khuẩn phát triển.

8.4.2. Trước khi sử dụng, ổn định cột bằng cách bơm lặp lại 20 ml dung dịch mẫu chuẩn cho đến khi thu được diện tích pic và thời gian lưu ổn định. Thời gian lưu điển hình thu được bằng quy trình quy định trong tiêu chuẩn này được nêu trong 5.9.4 (xem thêm Hình A.2).

8.4.3. Bơm 20 ml dung dịch đối chứng (8.3) và dung dịch thử (8.2.3) tương ứng vào máy HPLC với tốc độ của dòng dung môi rửa giải (4.2) là 1,0 ml/min.

8.4.4. Cho tích phân tự động (5.9.7) để tính diện tích pic của các whey protein. Vị trí đường nền phải được kiểm tra trong từng sắc đồ. Đối với dung dịch thử và dung dịch đối chứng, phải thu được các dãy đường nền bằng nhau. Phải lặp lại phép phân tích hoặc việc tích phân nếu đường nền thu được không thích hợp. Trong quá trình tích phân lặp lại, chỉ cho phép sử dụng thời gian cài đặt đường nền nếu quan sát thấy không có chệch đường nền trong sắc đồ của dung dịch thử hoặc dung dịch đối chứng.

8.4.5. Trong trường hợp có một dãy các phép phân tích, thì cứ sau năm dung dịch thử thực hiện bơm lặp lại dung dịch đối chứng. Nếu hơi sai lệch kết quả so với dung dịch đối chứng thì hiệu chính diện tích pic của từng dung dịch whey protein riêng rẽ. Nếu có sai lệch nhiều thì kiểm tra lại thiết bị xem về các thao tác đúng và/hoặc ổn định lại cột (xem 8.2.4) và lặp lại phép phân tích.

Sau một ngày kết thúc phân tích mà sử dụng lại cột thì rửa cột bằng dung môi rửa (4.3) với tốc độ dòng chảy 0,2 ml/min ít nhất trong 3 h. Không bảo quản cột trong dung môi rửa giải.

9. Tính và biểu thị kết quả

9.1. Tính tỷ lệ tương đối

Tính tỷ lệ tương đối, r, của tổng các diện tích pic immunoglobulin (lg) và albumin huyết tương bò (BSA), theo công thức:

r = 

Trong đó:

A_it là diện tích pic của phần immunoglobulin (lg) của dung dịch mẫu thử, xác định được trong 8.4.4;

A_bt là diện tích pic của phần albumin huyết tương bò (BSA) của dung dịch mẫu thử;

A_ir là giá trị trung bình của diện tích pic của phần immunoglobulin (lg) của các dung dịch mẫu đối chứng được dùng trước và sau dung dịch mẫu thử;

A_br là giá trị trung bình của diện tích pic của phần albumin huyết tương bò (BSA) của các dung dịch mẫu đối chứng được dùng trước và sau dung dịch mẫu thử;

f₁ là hệ số hiệu chính về mẫu đối chứng khác nhau hoặc mẻ bột NILAC (xem chú thích).

CHÚ THÍCH: Các giá trị gốc đối với r và r_t (9.3) thu được sử dụng mẫu đối chứng NILAC (4.4). Khi sử dụng mẫu đối chứng khác hoặc bột NILAC khác, thì các giá trị này phải được điều chỉnh cho phù hợp bằng hệ số hiệu chính.

9.2. Tính diện tích pic

Tính tỷ lệ tương đối của diện tích pic đối với cả dung dịch mẫu thử A_t, sử dụng công thức (1) và dung dịch đối chứng, A_r, sử dụng công thức (2):

              (1)

             (2)

Trong đó:

C_bt là giá trị trung bình của diện tích pic b-lactoglobulin A và B của dung dịch mẫu thử;

C_br­ là giá trị trung bình của diện tích pic b-lactoglobulin A và B của dung dịch mẫu đối chứng được dùng trước và sau dung dịch mẫu thử.

9.3. Tính tỷ lệ tương đối của mẫu thử

Tính tỷ lệ tương đối của mẫu thử, r_t, theo công thức sau:

Trong đó:

A_t­ là tỷ lệ tương đối diện tích pic của dung dịch mẫu thử thu được trong 9.2 [công thức (1)];

A_r­ là tỷ lệ tương đối diện tích pic của dung dịch mẫu đối chứng thu được trong 9.2 [công thức (2)].

9.4. Xác định loại nhiệt của mẫu thử

Nếu giá trị r thấp hơn giới hạn quy định hiện hành, khi sử dụng tiêu chuẩn này, thì mẫu không thuộc vào loại được xử lý bằng nhiệt cực thấp.

Nếu giá trị r_t bằng hoặc cao hơn giới hạn quy định hiện hành, khi sử dụng tiêu chuẩn này, thì mẫu thuộc vào loại được xử lý bằng nhiệt cực thấp.

Nếu giá trị r_t­  thấp hơn giới hạn quy định hiện hành, khi sử dụng tiêu chuẩn này, thì mẫu thuộc vào loại được xử lý nhiệt thấp (xem thêm phần Lời giới thiệu).

9.5. Biểu thị kết quả

Biểu thị kết quả tính về r hoặc r_t đến một chữ số thập phân và các kết quả về A_t và A_r đến ba chữ số thập phân.

10. Độ chụm

10.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm

Các giá trị về độ lặp lại và độ tái lập thu được từ các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm này đã được thực hiện phù hợp với TCVN 6910-1 (ISO 5725-1) và TCVN 6910-2 (ISO 5725-2). Chi tiết phép thử liên phòng thử nghiệm của phương pháp được nêu trong Tài liệu tham khảo [5]. Các giá trị thu được từ phép thử nghiệm liên phòng này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và các chất nền khác với các dải nồng độ và chất nền đã nêu.

CHÚ THÍCH: IDF 135 đưa ra hướng dẫn cụ thể đối với các phép thử liên phòng về phép phân tích và các sản phẩm sữa. Hướng dẫn này dựa trên TCVN 6910-1 (ISO 5725-1) và TCVN 6910-2 (ISO 5725-2).

10.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử độc lập, riêng rẽ, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong cùng một phòng thử nghiệm, do một người phân tích, sử dụng cùng thiết bị, trong khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp có tỷ lệ tương đối của mẫu (r_t) lớn hơn 5.

10.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử riêng rẽ, thu được sử dụng cùng một phương pháp, trên vật liệu thử giống hệt nhau, thực hiện trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do hai người phân tích, sử dụng các thiết bị khác nhau, không được quá 5 % các trường hợp có tỷ lệ tương đối của mẫu (r_t­) lớn hơn 17.

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết về nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả.

e) kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếu đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại thì ghi kết quả cuối cùng thu được.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Ví dụ về thiết bị và sắc đồ thu được

CHÚ DẪN:

1 dung môi rửa giải, pH 6,0

2 bơm, tốc độ dòng 1,0 ml/min

3 bộ bơm mẫu

4 cột (GF-250)

5 detector UV (280 nm)

6 bộ tích phân pic

Hình A.1 – Thiết bị có cột GF-250

Nhận biết pic

Pic 1: Immunologlobulin G (thời gian lưu 8,24 min)

Pic 2: Albumin huyết tương bò (thời gian lưu 8,77 min)

Pic 3: b-Lactoglobulin A và B (thời gian lưu 9,70 min)

Pic 4: a-Lactalbulin A và B (thời gian lưu 10,60 min)

^a Cài đặt đường nền

Hình A.2 – Sắc đồ của dung dịch mẫu sữa bột gầy xử lý nhiệt cực thấp sử dụng cột GF-250

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa – Hướng dẫn lấy mẫu.

[2] TCVN 6910-1 (ISO 5725-1), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung.

[3] TCVN 6910-2 (ISO 5725-2), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.

[4] IDF 135, Milk and milk products – Precision characteristics of analytical methods – Outline of collaborative study procedure.

[5] DE KONING, P.J and VAN DEN BEDEM, J.W. Bullentin of the International Dairy Federation. No.285, 1993, pp. 46-49

[6] VAN DEN BEDEM, J.W and LEETHEER, J. Heat treatment classification of low heat and extra low heat skim milk powder by HPLC. Netherlands Milk and Dairy Journal, 42, 1998, pp. 345-350

[7] DE VILER, J., VAN RENTERGHEM , R.  and MOEMANS, R. Determining the heat class of  milk powder by means of HPLC. Belgian Journal of Food Chemistry and Biotechnology, 43(1), 1988, pp. 3-8.