TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9781:2013 (ISO 834-3:1994) VỀ MẬT ONG – XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG CÁC CHẤT CHUYỂN HÓA CỦA NITROFURAN (AOZ, AMOZ, AHD, SEM) BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ LC-MS-MS

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 9781 : 2013

ISO 834-3:1994

MẬT ONG – XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG CÁC CHẤT CHUYỂN HÓA CỦA NITROFURAN (AOZ, AMOZ, AHD, SEM) BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ LC-MS-MS

Honey – Determination of residues of nitrofuran metabolites (AOZ, AMOZ, AHD, SEM) by liquid chromatography mass – Spectrometry LC-MS-MS

Lời nói đầu

TCVN 9781 : 2013 do Trung tâm kiểm tra vệ sinh Thú y TƯ1 – Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

MẬT ONG – XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG CÁC CHẤT CHUYỂN HÓA CỦA NITROFURAN (AOZ, AMOZ, AHD, SEM) BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ LC-MS-MS

Honey – Determination of residues of nitrofuran metabolites (AOZ, AMOZ, AHD, SEM) by liquid chromatography mass – Spectrometry LC-MS-MS

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định dư lượng các chất chuyển hóa của nitrofuran gồm furazolidone (AOZ), furaltadone (AMOZ), nitrofurantoin (AHD) và nitrofurazone (SEM) trong mật ong bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS-MS.

Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,3 mg / kg.

2. Nguyên tắc

Dư lượng các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran trong mật ong được thủy phân bằng axit clohydric loãng để thu được mạch nhánh của các chất chuyển hóa nhóm nitrofuran gồm AOZ, AMOZ, AHD, SEM. Các mạch nhánh này được dẫn xuất hóa bằng 2-nitrobenzaldehyt để tạo thành NPAOZ, NPAMOZ, NPAHD, NPSEM. Xác định và định lượng các chất dẫn xuất này bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS-MS.

3. Thuốc thử

Trong tiêu chuẩn này, chỉ sử dụng thuốc thử có cấp độ tinh khiết, phân tích và nước cất hai lần đã loại ion.

3.1. Chuẩn 3-amino-2-oxazolidinon (AOZ), 99,0 %;

3.2. Chuẩn 5-metylmorfolino-3-amino-2-oxazolidinon (AMOZ), 99,0 %;

3.3. Chuẩn 1-amino-hydantoin hydroclorit (AHD), 99,0 %;

3.4. Chuẩn Semicarbazit (SEM) hydroclorit;

3.5. Chuẩn nội 1-amino-hydantoin-d₂ hydroclorid (AHD-d₂);

3.6. Chuẩn nội Semicarbazit – ¹³C¹⁴N₂ (SEM-¹³C¹⁴N₂);

3.7. Chuẩn nội 3-amino-2-oxazolidinon-d₄ hydroclorit (AOZ-d₄);

3.8. Chuẩn nội 5-metylmorfolino-3-amino-2-oxazolidinon-d₅ (AMOZ-d₅);

3.9. 2-nitrobenzaldehyt (C₇H₅NO₃), loại dùng cho phân tích;

3.10. Dimethyl sulfoxit, loại dùng cho phân tích;

3.11. Acetonitril, loại dùng cho LC/MS;

3.12. Methanol, loại dùng cho LC/MS;

3.13. Nước, loại dùng cho LC/MS;

3.14. Ethyl acetate, loại dùng cho phân tích;

3.15. Axit HCl 37 %, loại dùng cho phân tích;

3.16. NaOH, loại dùng cho phân tích;

3.17. K₂HPO₄, loại dùng cho phân tích;

3.18. N-hexan, loại dùng cho phân tích;

3.19. Ammonium formate, loại dùng cho phân tích.

3.20. Dung dịch HCl 1 N trong nước:

Hòa tan 83,4 ml axít HCI 37 % (3.15) với nước cất hai lần đã loại ion, định mức trong bình định mức 1000 ml. Bảo quản ờ nhiệt độ phòng trong 6 tháng.

3.21. Dung dịch 2-nitrobenzaldehyt 0,05 M trong dimethylsulfoxit:

Hòa tan 0,19 g 2-nitrobenzaldehyt (3.9) vào 25 ml dimethylsulfoxit (3.10). Dung dịch này chuẩn bị hàng ngày.

3.22. Dung dịch K₂HPO₄ 0,1 M trong nước:

Cân 1,78 g K₂HPO₄ (3.17) vào cốc có mỏ, hòa tan trong 80 ml nước cất hai lần đã loại ion. Chỉnh pH tới 7,4 và chuyển vào bình định mức 100 ml, sau đó thêm nước cất hai lần đã loại ion cho tới vạch. Bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 01 tháng.

3.23. Dung dịch NaOH 1 N trong nước:

Cân 4 g NaOH khan (3.16) vào cốc có mỏ, hòa tan bằng nước cất hai lần đã loại ion và chuyển vào bình định mức 100 ml, định mức bằng nước cất hai lần đã loại ion đến vạch. Bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 02 tháng.

3.24. Dung dịch chuẩn gốc AOZ, AMOZ, AHD, SEM, AOZ-d₄, AMOZ-d₅, SEM-¹³C¹⁴N₂, AHD-d₂ 1000 mg / ml trong methanol:

Cân 50 mg mỗi loại chuẩn vào các bình định mức dung tích 50 ml riêng biệt (4.11). Hòa tan và định mức đến vạch bằng methanol (3.12) để được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1000 mg / ml. Dung dịch chuẩn gốc được bảo quản ở -20 °C trong 6 tháng.

Hòa tan mỗi loại nội chuẩn đóng trong ampul bằng một thể tích methanol thích hợp để được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1000 mg / ml. Dung dịch chuẩn gốc được bảo quản ở -20 °C trong 6 tháng.

LƯU Ý:

– Lượng chuẩn mỗi loại phải được điều chỉnh hợp lý để đạt nồng độ chuẩn gốc 1000 mg / ml sau khi tính toán và hiệu chỉnh theo giấy chứng nhận độ tinh khiết của nhà sản xuất.

– Thể tích methanol thích hợp phải được điều chỉnh hợp lý để đạt nồng độ chuẩn nội gốc 1000 mg / ml tùy theo quy cách đóng gói của nhà sản xuất.

3.25. Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian AOZ, AMOZ, AHD, SEM, 1000 mg / I trong methanol:

Lấy 100 ml từ mỗi dung dịch chuẩn gốc (3.24) cho vào bình định mức 100 ml, định mức đến vạch với methanol (3.12). Dung dịch chuẩn này được bảo quản ở -20 °C trong 3 tháng.

3.26. Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc AOZ, AMOZ, AHD, SEM, 100 mg / l trong methanol:

Từ dung dịch chuẩn trung gian (3.25) lấy 1000 mL cho vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch với methanol (3.12). Dung dịch chuẩn này được bảo quản ở 4 °C trong 1 tuần.

3.27. Dung dịch chuẩn nội hỗn hợp trung gian AOZ-d₄, AMOZ-d₅, SEM-¹³C¹⁴N₂, AHD- d₂ 1000 mg /l trong methanol:

Từ dung dịch nội chuẩn gốc (3.24), lấy 100 mL cho vào bình định mức 100 ml, định mức đến vạch với methanol. Dung dịch chuẩn này được bảo quản ở -20 °C trong 3 tháng.

3.28. Dung dịch chuẩn nội hỗn hợp làm việc AOZ-d₄, AMOZ-d₅, SEM-¹³C¹⁴N₂, AHD- d₂, nồng độ 100 mg /l trong methanol:

Lấy 1000 ml dung dịch nội chuẩn hỗn hợp trung gian (3.27) cho vào bình định mức 10 ml, định mức đến vạch bằng methanol. Dung dịch chuẩn này được bảo quản ở 4 ^oC trong 1 tuần.

3.29. Dung dịch pha động:

Pha động A: Methanol (3.12);

Pha động B: Dung dịch ammonium formate 1 mM

Cân 0,0315 g ammonium formate (3.19) vào cốc có mỏ, hòa tan và chuyển vào bình định mức 1000 ml bằng nước (3.13). Dung dịch này chuẩn bị hàng ngày.

3.30. Dung dịch hòa tan mẫu:

Hòa tan dung dịch pha động B và methanol theo tỉ lệ 1:1.

4. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1. Hệ thống máy sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS

– Bơm 2 kênh dung môi biến đổi dòng;

– Detector MS / MS;

– Máy tính và phần mềm phân tích;

– Cột sắc ký RP C18, đường kính trong là 2,1 cm, kích thước hạt nhồi là 1,7 mm, độ dài của cột là 50 mm;

4.2. Ống ly tâm polypropylene, dung tích 50 ml có nắp;

4.3. Máy ly tâm lạnh, tốc độ 4000 r / min;

4.4. Máy lắc ngang, 400 r / min;

4.5. Máy lắc vortex, tốc độ 400 r / min;

4.6. Bộ cô quay chân không, có điều chỉnh nhiệt độ;

4.7. Bình quả lê, dung tích 50 ml;

4.8. Máy đo pH, độ chính xác đến 0,01;

4.9. Tủ ấm, có điều chỉnh nhiệt độ;

4.10. Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,1 mg;

4.11. Bình định mức, dung tích 10 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml và 1000 ml;

4.12. Pipet tự động, dung tích 50 ml, 100 ml, 250 ml; 1000 ml; 5000 ml;

4.13. Ống thủy tinh, dung tích 10 ml;

4.14. Lọ đựng mẫu, dung tích 1,5 ml;

4.15. Đầu lọc nylon, đường kính lỗ 45 mm.

5. Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này nhưng mẫu phân tích tại phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc bị biến đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

6. Chuẩn bị mẫu

6.1. Chuẩn bị mẫu thử

Cân 5,0 g mẫu đã đồng nhất vào ống ly tâm (4.2). Cho vào 50 ml hỗn hợp chuẩn nội nitrofuran 100 mg / l (3.28).

6.2. Chuẩn bị mẫu trắng

Mẫu trắng là mẫu mật ong đã được xác định không nhiễm chất chuyển hóa của nitrofuran. Mẫu trắng được chuẩn bị như mẫu thử.

6.3. Chuẩn bị mẫu kiểm soát

Mẫu kiểm soát được chuẩn bị từ mẫu trắng như mẫu thử nhưng sau khi cân có bổ sung 50 mL hỗn hợp chuẩn nitrofuran 100 mg /l (3.26) vào mẫu. Lắc 30 giây (4.5), sau đó để yên 15 min trước khi tiến hành các bước tiếp theo.

6.4. Chuẩn bị mẫu xây dựng đường chuẩn

Mẫu thêm chuẩn được chuẩn bị từ mẫu trắng. Cân 5,0 g mẫu đã đồng nhất vào ống ly tâm 50 ml (4.2); cho dung dịch chuẩn hỗn hợp nitrofuran 100 mg / l (3.26) và hỗn hợp chuẩn nội nitrofuran 100 mg / l (3.28) vào các ống nghiệm có chứa mẫu trắng theo bảng 1. Tiến hành lắc 15 giây (4.5), sau đó để yên 15 min trước khi thực hiện các bước tiếp theo.

Bảng 1 – Xây dựng đường chuẩn

7. Tiến hành thử nghiệm

7.1. Chiết mẫu và làm sạch mẫu

Thêm 10 ml nước (3.13), 1 ml HCl 1 N (3.20) vào từng lọ mẫu. Lắc trong 15 giây (4.5), sau đó lắc 15 min trên máy lắc mẫu (4.4) ở tốc độ 300 r / min. Tiếp theo, thêm cho 400 mL 2-nitrobenzaldehyt 0,05 M (3.21) vào tất cả các mẫu. Lắc 15 giây (4.5), sau đó ủ bằng tủ ấm (4.9) ở 60 °C trong 3 h hoặc ở 37 °C trong 16 h.

Sau khi ủ, lấy ra để cho mẫu trở về nhiệt độ phòng. Sau khi mẫu đã trở về nhiệt độ phòng, cho vào mỗi mẫu 10 ml n-Hexan (3.18). Lắc 15 giây ở (4.5). Ly tâm mẫu ở 3000 vòng trong 5 min (4.3). Loại bỏ lớp trên và lập lại bước này lần 2.

Tiếp theo cho vào mỗi mẫu 1 ml NaOH 1 N (3.23), 2 ml K₂HPO₄ 0,1 M (pH = 7,4) (3.22) và lắc đều. Tiếp theo, thêm 20 ml ethyl acetate (3.14). Lắc trong 5 giây ở (4.5), sau đó lắc đảo lộn 20 lần. Ly tâm mẫu ở 3000 vòng trong 5 min (4.3). Hút lớp trên vào bình quả lê 50 ml (4.7). Sau đó cho 10 ml ethyl acetate (3.14) vào và lập lại bước này. Thu lớp ethyl acetate gộp vào bình quả lê (4.7), sau đó làm khô bằng cô quay chân không ở nhiệt độ 45 °C (4.6).

Hòa tan phần cặn bằng 0,5 ml dung dịch hòa tan mẫu methanol: Amonium formate (3.30). Lắc trong 30 giây ở (4.5). Dịch thu được lọc qua đầu lọc 0,45 mm (4.15) vào lọ đựng mẫu (4.14) để phân tích sắc ký.

7.2. Tiến hành thử nghiệm trên LC-MS-MS

7.2.1. Điều kiện HPLC

– Cột sắc ký RP C18, đường kính trong là 2,1 cm, kích thước hạt nhồi là 1,7 mm, độ dài của cột là 50 mm;

– Nhiệt độ cột theo nhiệt độ phòng;

– Thể tích bơm mẫu: 10 ml;

– Thời gian phân tích: 4 min;

– Tốc độ dòng: 0,4 ml / min;

Pha động: chương trình gradient thể hiện theo bảng 2.

Bảng 2 – Chương trình pha động

7.2.2. Điều kiện trên MS

Điều kiện trên MS như sau:

Kiểu ion hóa: ESI (+);

Nhiệt độ nguồn ion hóa: 150 ^oC;

Nhiệt độ hóa hơi dung môi: 400 ^oC;

Tốc độ dòng khí làm bay hơi dung môi: 600 l / h;

Tốc độ dòng khí qua khối nón: 30 l / h;

Các điều kiện phân ly MS/MS như sau:

Bảng 3 – Điều kiện phân ly MS/MS

GHI CHÚ: ion có kí hiệu (*) là ion dùng để định lượng;

7.3. Trình tự bơm mẫu

7.3.1. Bơm dung môi kiểm tra máy, dung dịch hòa tan mẫu (3.201);

7.3.2. Bơm các dung dịch lập đường chuẩn;

7.3.3. Bơm mẫu trắng;

7.3.4. Bơm mẫu kiểm soát;

7.3.5. Bơm mẫu thử.

8. Tính toán và biểu thị kết quả

8.1. Tính hệ số tín hiệu

Tính cho từng chất cần phân tích theo phương trình: 

Trong đó:

RF: hệ số tín hiệu;

Sp: tổng diện tích pic của các ion thứ cấp của chất cần phân tích;

Sp_IS: diện tích pic của ion thứ cấp của chất chuẩn nội tương ứng.

8.2. Xây dựng đường chuẩn

Xây dựng phương trình bậc nhất giữa hệ số tín hiệu với nồng độ chất chuẩn cho vào mẫu thực được chuẩn bị mẫu theo mục 6.4. Phương trình có dạng: RF = ax + b.

Trong đó:

– RF: Hệ số tín hiệu, tính theo mục 8.1;

– x: nồng độ chất chuẩn thêm vào mẫu, chuẩn bị theo mục 6.4;

– b: điểm cắt của đường chuẩn với trục tung;

– a: hệ số góc của đường chuẩn.

Phương trình đạt yêu cầu khi hệ số hồi quy R² ≥ 0,99.

8.3. Hàm lượng chất phân tích trong mẫu

Dư lượng chất cần phân tích trong mẫu được tính theo phương pháp đường chuẩn xây dựng theo mục 8.2. Nồng độ trong mẫu phân tích được tính theo công thức sau:

Trong đó:

C: là nồng độ chất phân tích có trong mẫu, tính bằng mg / kg;

C_x: là nồng độ chất phân tích đo được suy ra từ đường chuẩn, mg /l;

V: là thể tích định mức cuối cùng, tính bằng ml;

F: là hệ số pha loãng mẫu khi đo (nếu không pha loãng, F = 1);

a: là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g);

8.4. Biểu thị kết quả

Kết quả được biểu thị bằng đơn vị mg / kg (ppb), hai số sau dấu phẩy.

9. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

– Thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;

– Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

– Phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

– Các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả thử nghiệm;

– Độ lập lại của phương pháp;

– Kết quả thử nghiệm thu được.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Quy trình chuyển giao phương pháp phân tích chất chuyển hóa của nitrofuran trong mật ong của Cơ quan dịch vụ phân tích quốc tế (QSI) – Cộng hòa liên bang Đức;

[2] Nitrofuran metabolites in Honey. Standard Operating Procedure, # M-H220. JR laboratories Inc.

[3] Decision 2002/657/ CE.