TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9937:2013 (ISO 5378 : 1978) VỀ TINH BỘT VÀ SẢN PHẨM TINH BỘT – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITƠ BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL – PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 9937 : 2013

ISO 5378 : 1978

TINH BỘT VÀ SẢN PHẨM TINH BỘT – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITƠ BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL – PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ

Starches and derived products – Determination of nitrogen content by the Kjeldahl method – Spectrophotometric method

Lời nói đầu

TCVN 9937:2013 hoàn toàn tương đương với ISO 5378:1978;

TCVN 9937:2013 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F18 Đường, mật ong và sản phẩm tinh bột biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

TINH BỘT VÀ SẢN PHẨM TINH BỘT – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITƠ BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL – PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ

Starches and derived products – Determination of nitrogen content by the Kjeldahl method – Spectrophotometric method

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp Kjeldahl – quang phổ để xác định hàm lượng nitơ trong tinh bột và sản phẩm tinh bột được dự đoán nhỏ hơn 0,025 % (khối lượng)1).

CHÚ THÍCH: Trong tinh bột và các sản phẩm tinh bột không bổ sung vật liệu chứa nitơ, thì nitơ có mặt chủ yếu ở dạng protein và/hoặc amino axit.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 9936 (ISO 3188), Tinh bột và sản phẩm tinh bột – Xác định hàm lượng nitơ bằng phương pháp Kjeldahl – Phương pháp chuẩn độ

TCVN 10034 (ISO 1871), Thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Nguyên tắc chung đối với việc xác định nitơ bằng phương pháp Kjeldahl

ISO 1227/Add.2), Starch, including derivatives and by-products – Vocabulary (Tinh bột, bao gồm các dẫn xuất và sản phẩm phụ – Từ vựng)

3. Thuật ngữ, định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này, sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau đây:

3.1. Hàm lượng nitơ (nitrogen content)

Giá trị thu được khi sử dụng qui trình qui định. Hàm lượng nitơ bao gồm hàm lượng nitơ của các axit amin tự do, các hợp chất axit amin tạo thành khi thủy phân và các hợp chất amoni. Hàm lượng nitơ không bao gồm nitơ gốc nitrat và nitrit, nitơ được gắn trực tiếp với nguyên tử nitơ khác hoặc nitơ gắn với nguyên tử oxi.

4. Nguyên tắc

Phân hủy chất hữu cơ bằng axit sulfuric với sự có mặt của hỗn hợp chất xúc tác3), kiềm hóa các sản phẩm phản ứng, chưng cất amoni giải phóng và thu vào dung dịch axit sulfuric, sau đó đo quang phổ muối amoni được tạo thành sau khi bổ sung thuốc thử Nessler.

5. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các loại thuốc thử loại tinh khiết phân tích. Nước sử dụng phải là nước cất không chứa amoni hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.

5.1. Axit sulfuric, đậm đặc, r₂₀ = 1,84 g/ml [96 % (khối lượng)].

5.2. Dung dịch natri hydroxit, 30 % (khối lượng), r₂₀ = 1,33 g/ml.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng dung dịch đậm đặc hơn.

5.3. Hỗn hợp chất xúc tác 4), ví dụ bao gồm:

– kali sulfat: 97 g;

– đồng(II) sulfat, khan: 3 g

5.4. Amoni sulfat, amoni oxalat hoặc amoni clorua.

5.5. Axit sulfuric, dung dịch chuẩn khoảng 0,05 M (0,1 N).

5.6. Thuốc thử Nessler, được chuẩn bị trước khi sử dụng ít nhất 2 ngày, như sau:

Hòa tan 100 g thủy ngân (II) iodua và 70 g kali iodua trong 100 ml nước. Hòa tan 224 g kali hydroxit trong 700 ml nước đựng trong bình định mức một vạch 1 000 ml và để nguội đến nhiệt độ phòng. Thêm từ từ dung dịch thủy ngân (II) iodua/kali iodua vào dung dịch kali hydroxit trong khi vẫn khuấy liên tục. Pha loãng bằng nước đến vạch và trộn đều. Để yên ít nhất 2 ngày trước khi sử dụng.

CHÚ THÍCH: Thuốc thử phải được bảo quản trong chai thủy tinh màu nâu. Nếu thuốc thử này được bảo quản trong chai kín khí và để ở nơi tối thì có thể sử dụng sau 1 năm, nếu cẩn thận để cho chất lắng không bị xáo trộn khi được sử dụng lại.

6. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

6.1. Bình Kjeldahl, dung tích thích hợp, thông thường từ 500 ml đến 800 ml, tốt nhất là có khớp nối thủy tinh mài và được trang bị bầu thủy tinh hình quả lê gắn kín phía trên cổ bình.

6.2. Giá phân hủy, có thể để bình Kjeldahl (6.1) ở tư thế nghiêng sao cho nhiệt được cung cấp ở phần dưới mức chất lỏng, ở tất cả các giai đoạn.

6.3. Thiết bị chưng cất hoặc thiết bị chưng cất bằng hơi nước, có phễu nhỏ giọt chia vạch dung tích 200 ml, có đầu phun hiệu quả và có cổ thoát nối bình Kjeldahl (6.1) với bộ sinh hàn.

Có thể sử dụng thiết bị tương đương đáp ứng các phép thử kiểm soát nêu trong TCVN 10034 (ISO 1871).

6.4. Bình nón, dung tích 100 ml.

6.5. Bình định mức một vạch, dung tích 200 ml, cổ phẳng, đáp ứng yêu cầu của loại A trong TCVN 7153 (ISO 1042) ^[1].

6.6. Pipet, dung tích thích hợp, đáp ứng yêu cầu của loại A trong TCVN 7151 (ISO 648) ^[2].

6.7. Máy đo quang phổ, có thể chỉnh được bước sóng 430 nm và được trang bị các cuvet thích hợp với chiều dài đường quang đề cập trong báo cáo thử nghiệm.

6.8. Máy nghiền cơ học hoặc cối giã

6.9. Rây, có cỡ lỗ danh nghĩa 0,6 mm, phù hợp với các yêu cầu trong TCVN 2230 (ISO 565) ^[3].

6.10. Cân phân tích.

7. Cách tiến hành

7.1. Chuẩn bị mẫu thử

Trộn kỹ và nhanh mẫu trong hộp đựng mẫu 5) bằng cách lắc hộp đựng mẫu hoặc khuấy bằng thìa. Nếu hộp đựng mẫu quá nhỏ thì chuyển toàn bộ mẫu sang hộp đựng mẫu khác có kích thước lớn hơn đã được sấy khô trước để dễ trộn.

Có thể cần phải nghiền mẫu, sao cho mẫu lọt hết qua rây (6.9).

7.2. Phần mẫu thử

Cân từ 2 g đến 5 g (khối lượng m_o) mẫu thử (7.1), chính xác đến 0,001 g, tùy thuộc vào hàm lương nitơ được dự đoán, chuyển vào bình Kjeldahl (6.1) đã được sấy khô trước, tiến hành cẩn thận để mẫu không bám dính vào phía trong cổ bình.

Trong trường hợp sản phẩm dạng sánh hoặc dạng nhão thì phần mẫu thử có thể được cân trong vật chứa thủy tinh nhỏ hoặc để trên tấm nhôm, giấy hoặc chất dẻo không sinh nitơ hoặc đã biết hàm lượng nitơ rồi đặt vào bình. Nếu vật chứa có sinh nitơ thì cần tính đến trong phép thử trắng (7.8).

7.3. Phân hủy chất hữu cơ

Cho 3 g hỗn hợp chất xúc tác (5.3) và dùng ống đong thích hợp để thêm một thể tích thích hợp của axit sulfuric đậm đặc (5.1), tính bằng mililit, được tính bằng công thức 20 + 4 m_o, sao cho axit chảy dọc theo cổ bình.

Trộn đều lượng chứa trong bình bằng cách xoay nhẹ bình cho đến khi hỗn hợp không còn vón cục và phần mẫu thử thấm ướt hoàn toàn. Để tránh bị quá nhiệt, thêm chất trợ sôi (ví dụ bi thủy tinh). Chèn bầu thủy tinh hình quả lê (xem 6.1) vào trong cổ bình rồi đặt bình ở tư thế nghiêng trên giá phân hủy (6.2).

Đun cẩn thận cho đến khi chất lỏng trong bình sôi nhẹ. Tiếp tục đun 1 h sau khi dịch lỏng đã trong. Trong trường hợp thiết bị phân hủy được đốt nóng bằng ga thì đảm bảo rằng ngọn lửa không cao quá mức chất lỏng để tránh làm hao hụt nitơ.

7.4. Chưng cất

Để lượng chứa trong bình đến nguội rồi tráng bầu thủy tinh hình quả lê và bên trong cổ bình bằng vài mililit nước, để cho nước tráng chảy vào bình. Cẩn thận thêm từ 50 ml đến 150 ml nước (tùy vào thiết bị được sử dụng) trong khi vẫn xoay để trộn lượng chứa trong bình. Nối bình với thiết bị chưng cất hoặc thiết bị chưng cất bằng hơi nước (6.3), trước đó đã được làm sạch amoniac bằng hơi nước.

Chỉnh đầu dưới của bộ sinh hàn sao cho vừa chạm đáy của bình định mức một vạch (6.5) có chứa 25 ml dung dịch axit sulfuric (5.5). Đưa chất lỏng đã phân hủy về dạng kiềm bằng cách thêm từ từ 120 ml dung dịch natri hydroxit (5.2) qua phễu chia vạch (6.3) đặt trong cổ bình, đảm bảo rằng cuống phễu không được khô. Trộn đều, mở nước của bình sinh hàn rồi bắt đầu đun; amoniac bắt đầu được lôi cuốn.

Trong quá trình chưng cất, đảm bảo ổn định lượng hơi nước sinh ra. Kết thúc chưng cất khi thu được 150 ml dịch lỏng trong thời gian từ 20 min đến 30 min.

Tắt nguồn nhiệt và hạ thấp bình nón. Để cho bình sinh hàn chảy nhỏ giọt vào bình nón trong vài phút rồi tráng đầu tip của bình sinh hàn bằng nước, thu lấy nước tráng vào bình nón. Thêm nước đến vạch và trộn.

7.5. Chuẩn bị đường chuẩn

Chuẩn bị một dãy các dung dịch chuẩn thích hợp, gồm ít nhất năm nồng độ khác nhau đã biết của muối amoni (5.4). Dùng pipet (6.6) chuyển 50 ml mỗi dung dịch vào dãy các bình nón riêng rẽ 100 ml (6.4) và chuyển 50 ml nước vào bình nón 100 ml (6.4) khác. Bình cuối cùng tương ứng với nồng độ zero của muối amoni dùng để đựng đường chuẩn.

Dùng pipet, thêm 1,0 ml thuốc thử Nessler (5.6) vào mỗi bình và trộn riêng.

Để yên trong 10 min và đo độ hấp thụ của từng dung dịch, dùng máy đo quang phổ (6.7) chỉnh ở bước sóng 430 nm.

Dựng đường chuẩn của độ hấp thụ theo số lượng microgam nitơ.

CHÚ THÍCH 1: Đường chuẩn là đường thẳng trong 50 ml dung dịch chứa khoảng từ 0 mg đến 240 mg nitơ (trong 1 000 ml chứa khoảng từ 0 mg đến 5 000 mg nitơ).

CHÚ THÍCH 2: Mỗi điểm trên đường chuẩn là giá trị trung bình của hai phép xác định.

7.6. Đo quang phổ

Dùng pipet thích hợp (6.6) chuyển thể tích (V) của dịch cất thu được trong 7.4 và chứa không quá 175 mg nitơ (thông thường từ 25 ml đến 50 ml, tùy thuộc vào hàm lượng nitơ được dự đoán có trong sản phẩm) vào bình nón 100 ml (6.4). Thêm nước đến 50 ml, nếu cần. Dùng pipet thêm 1,0 ml thuốc thử Nessler (5.6) và trộn đều. Để yên 10 min và đo độ hấp thụ của dung dịch, dùng máy đo quang phổ (6.7) chỉnh ở bước sóng 430 nm.

7.7. Số lần xác định

Tiến hành hai phép xác định trên cùng một mẫu thử (7.1).

7.8. Phép thử trắng

Chỉ tiến hành phép thử trắng trên thuốc thử theo qui trình qui định trong 7.4 và 7.6, dùng 50 ml dịch cất. Nếu phần mẫu thử đã được cân trong vật chứa sinh nitơ (xem 7.2), thì tiến hành phép thử trắng, dùng một vật chứa giống hệt và tiến hành theo qui trình qui định trong 7.3.

7.9. Phép thử kiểm tra

Tiến hành các phép thử kiểm tra được qui định trong TCVN 10034 (ISO 1871).

8. Biểu thị kết quả

Hàm lượng nitơ trong mẫu được biểu thị theo phần trăm khối lượng, tính được bằng công thức sau:

= 

Trong đó:

m₀ là khối lượng phần mẫu thử (7.2), tính bằng gam (g);

m₁ là khối lượng nitơ trong phần chất lỏng (V ml) của dịch chưng cất phần mẫu thử đã phân hủy (7.2), xác định được từ đường chuẩn, tính bằng microgam (g);

m₂ là khối lượng nitơ trong 50 ml phần chất lỏng của dịch chưng cất trong phép thử trắng (7.8), xác định được từ đường chuẩn, tính bằng microgram (g);

V là thể tích phần dịch chưng cất trong 7.6, tính bằng mililit (ml).

Biểu thị kết quả là giá trị trung bình của hai phép xác định.

9. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải chỉ rõ phương pháp đã sử dụng và kết quả thử nghiệm thu được. Ngoài ra, báo cáo thử nghiệm cũng đề cập đến mọi chi tiết thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm.

Báo cáo thử nghiệm cũng bao gồm mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 7153 (ISO 1042), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh – Bình định mức.

[2] TCVN 7151 (ISO 648), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh – Pipet một mức.

[3] TCVN 2230 (ISO 565), Sàng thử nghiệm – Lưới kim loại đan, tấm kim loại đột lỗ và lưới đột lỗ bằng điện – Kích thước lỗ danh nghĩa.