TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 9976:2013 VỀ THỊT VÀ THỦY SẢN – ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 9976 : 2013

THỊT VÀ THỦY SẢN – ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM^TM

Meats and fishery products – Enumeration of Escherichia coli using Petrifilm^TM count plate

Lời nói đầu

TCVN 9976:2013 được xây dựng trên cơ sở AOAC 998.08 Confirmed Escherichia coli Counts in  Poultry, Meats, and Seafood. Dry Rehydratable Film Method Petrifilm^TM E. coli/Coliform Count Plate;

TCVN 9976:2013 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn Quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích và lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỊT VÀ THỦY SẢN – ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA COLI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐĨA ĐẾM PETRIFILM^TM

Meats and fishery products – Enumeration of Escherichia coli using Petrifilm^TM count plate

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp sử dụng đĩa đếm Petrifilm^TM để định lượng Escherichia coli trong thủy sản và thịt, bao gồm cả thịt gia cầm.

Phương pháp này đã được đánh giá liên phòng thử nghiệm, các kết quả được nêu trong Phụ lục A và Tài liệu tham khảo [1].

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 6507-2:2005 (ISO 6887-2:2003), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật – Phần 2: Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị các mẫu thịt và sản phẩm thịt;

TCVN 6507-3:2005 (ISO 6887-3:2003), Vi sinh vật trong thực phẩm và thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật – Phần 3: Các nguyên tắc cụ thể để chuẩn bị các mẫu thủy sản và sản phẩm thủy sản;

3. Nguyên tắc

Phương pháp này sử dụng các đĩa cấy chứa môi trường dinh dưỡng khô và chất tạo đông tan được trong nước lạnh. Cho các dung dịch huyền phù mẫu thử chưa pha loãng hoặc đã pha loãng vào các đĩa với lượng 1 ml mỗi đĩa. Dàn đều dung dịch huyền phù trên diện tích khoảng 20 cm². Chất tạo đông có trong thành phần của đĩa sẽ làm môi trường dinh dưỡng trong đĩa đông lại. Đĩa được ủ ấm ở 35 ^oC ± 1 ^oC trong 24 h ± 1 h rối đếm khuẩn lạc.

Phần lớn các chủng E. coli đều sản sinh glucuronidase, chất này phản ứng với chất chỉ thị màu để tạo kết tủa màu xanh bao quanh khuẩn lạc. Do vậy, các chủng E.coli dương tính với glucuronidase cho các khuẩn lạc màu xanh kèm theo bọt khí. Các coliform không phải E.coli là các khuẩn lạc âm tính với glucuronidase cho màu đỏ kèm theo bọt khí.

4. Thuốc thử và môi trường

Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương, trừ khi có quy định khác.

4.1. Nước dùng để pha loãng (dung dịch nước đệm phosphat)

Hòa tan 34 g kali hydro phosphat (KH₂PO₄) vào 500 ml nước đựng trong bình định mức 1 lít, chỉnh pH đến 7,2 bằng khoảng 175 ml dung dịch natri hydroxit 1 M và thêm nước đến vạch. Pha loãng 1,25 ml dung dịch này đến 1 lít bằng nước đã đun sôi và để nguội, rồi hấp áp lực 15 min ở 121 ^oC.

Nước dùng để pha loãng không được chứa xitrat, bisulfit hoặc thiosulfat vì có thể gây ức chế sự phát triển của vi sinh vật.

4.2. Chất chỉ thị 2,3,5-triphenyltetrazolium clorua.

4.3. Chất chỉ thị 5-brom-4-clo-3-indolyl-b-D-glucuronid.

4.4. Chất dinh dưỡng mật đỏ-tím (violet red bile nutrients)1).

4.5. Chất tạo đông tan được trong nước lạnh.

5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và các thiết bị, dụng cụ sau đây:

5.1. Đĩa đếm E.coli/coliform Petrifilm^TM 2)

Đĩa chứa các chất dinh dưỡng mật đỏ-tím (4.4), chất tạo đông tan được trong nước lạnh (4.5), chất chỉ thị 2,3,5-triphenyltetrazolium clorua (4.2) và chất chỉ thị hoạt độ glucuronidase là 5-brom-4-clo-3-indolyl-b-D-glucuronid (4.3), có thể đếm coliform và E.coli trên cùng một đĩa. Vùng sinh trưởng được khoanh tròn trên mỗi đĩa chứa khoảng hai mươi ô vuông, mỗi ô có diện tích 1 cm² trên màng nền.

5.2. Dụng cụ dàn mẫu bằng chất dẻo (gồm một mặt có gờ và một mặt láng), được cung cấp cùng với đĩa đếm (5.1), để dàn đều huyền phù lên khắp vùng sinh trưởng của đĩa.

5.3. Pipet, đã được hiệu chuẩn, dùng để phân tích vi sinh vật hoặc pipet dạng xyranh có thể phân phối 1,0 ml, chia vạch đến 0,1 ml. Có thể dùng pipet tự động.

Pipet phải phân phối được chính xác các thể tích yêu cầu. Không sử dụng pipet để phân phối thể tích nhỏ hơn 10 % dung tích của pipet. Ví dụ, không dùng pipet có dung tích lớn hơn 10 ml để phân phối 1 ml.

5.4. Thiết bị đếm khuẩn lạc, loại chuẩn hoặc loại có độ khuếch đại và độ nhìn thấy tương đương3).

5.5. Cân, có thể cân chính xác đến 0,1 g.

5.6. Thiết bị trộn tốc độ cao, có bình chứa vô trùng.

5.7. Tủ ấm, có thể duy trì được nhiệt độ ở 35 ^oC ± 1 ^oC.

5.8. Nồi hấp áp lực, có thể duy trì nhiệt độ ở 121 ^oC.

6. Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này.

Phòng thử nghiệm phải nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc thay đổi trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

7. Chuẩn bị mẫu thử

7.1. Chuẩn bị phần mẫu thử, theo TCVN 6507-2:2005 (ISO 6887-2:2003) hoặc TCVN 6507-3:2005 (ISO 6887-3:2003).

7.2. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử

Cân vô trùng 50 g phần mẫu thử, chính xác đến 0,1 g, cho vào bình trộn vô trùng của thiết bị trộn (5.6). Thêm 450 ml nước dùng để pha loãng (4.1) và trộn trong 2 min với tốc độ từ 10 000 r/min đến 12 000 r/min.

Nếu tổng khối lượng mẫu không đủ 50 g thì cân phần mẫu thử thích hợp và thêm thể tích nước dùng để pha loãng (4.1) cần thiết để có dung dịch pha loãng 10^-1.

Chuẩn bị các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo bằng cách dùng 90 ml nước dùng để pha loãng (4.1) với 10 ml dung dịch pha loãng trước đó, trừ khi có quy định khác. Lắc các dung dịch 25 lần với biên độ dao động 30 cm trong thời gian 7 s.

8. Cách tiến hành

Đặt đĩa đếm E.coli/coliform Petrifilm^TM (5.1) lên bề mặt phẳng. Nhấc tấm màng mỏng phía trên ra và nhỏ 1 ml huyền phù mẫu thử vào chính giữa màng nền. Đậy cẩn thận tấm màng mỏng phía trên xuống chất cấy. Dàn đều huyền phù trên diện tích 20 cm² bằng cách ấn nhẹ xuống tâm dụng cụ dàn mẫu (5.2) (mặt láng của dụng cụ dàn mẫu hướng xuống dưới). Để yên đĩa trong ít nhất 1 min cho gel đông đặc lại. Đặt các đĩa vào tủ ấm (5.7) theo phương nằm ngang với nắp hướng lên trên, không chồng cao quá 20 đĩa, ủ ấm đĩa ở nhiệt độ 35 ^oC ± 1 ^oC trong 24 ± 1 h. Sau khi ủ xong, có thể bảo quản đông lạnh ở nhiệt độ nhỏ hơn hoặc bằng – 15 ^oC đến 7 ngày, nếu cần.

Đếm khuẩn lạc trên các đĩa này ngay sau giai đoạn ủ, sử dụng thiết bị đếm khuẩn lạc (5.4). Có thể sử dụng bộ khuếch đại được rọi sáng để thuận tiện cho việc đếm. Đếm tất cả các khuẩn lạc có màu xanh kèm theo một hoặc nhiều bọt khí (trong vòng đường kính một khuẩn lạc) trên các đĩa chứa từ 10 khuẩn lạc đến 150 khuẩn lạc. Không đếm các khuẩn lạc phát triển ngoài vòng tròn giới hạn của môi trường chọn lọc, không đếm các bọt khí giả có thể được tạo ra do thao tác chưa đúng trong quá trình cấy mẫu lên đĩa.

9. Tính và biểu thị kết quả

Để tính số lượng vi khuẩn, nhân tổng số lượng khuẩn lạc trên một đĩa (hoặc số lượng trung bình các khuẩn lạc trên một đĩa, nếu đếm các đĩa kép của cùng một độ pha loãng) với số nghịch đảo của độ pha loãng tương ứng. Khi đếm các khuẩn lạc trên các đĩa kép của các độ pha loãng kế tiếp, tính số lượng trung bình các khuẩn lạc cho mỗi độ pha loãng trước khi xác định trung bình số đếm tổng vi khuẩn.

Nếu không có đĩa nào có từ 10 khuẩn lạc màu xanh kèm bọt khí trở lên thì ghi lại số đếm chính xác trên đĩa có độ pha loãng thấp nhất (tương ứng với dung dịch ít pha loãng nhất).

Nếu tất cả các đĩa có số đếm lớn hơn 150 thì xác định số đếm ước tính bằng cách đếm số khuẩn lạc trong một hoặc nhiều ô vuông đại diện, tính số đếm trung bình trên một ô vuông và nhân số đếm này với 20 (diện tích vùng sinh trưởng khoảng 20 cm²). Trong trường hợp này, phải báo cáo đây là số ước tính.

Nếu các đĩa đều có mật độ khuẩn lạc quá lớn để ước tính số đếm thì kết quả được báo cáo là “quá nhiều để đếm”.

10. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm ít nhất các thông tin dưới đây:

– mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

– viện dẫn tiêu chuẩn này hoặc phương pháp đã sử dụng;

– kết quả và đơn vị biểu thị kết quả;

– ngày tháng lấy mẫu và phương thức lấy mẫu (nếu có);

– ngày tháng nhận mẫu phòng thử nghiệm;

– ngày tháng thử nghiệm;

– các điểm đặc biệt quan sát được trong quá trình thử nghiệm;

– mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được coi là tùy chọn, cùng với các chi tiết của sự cố bất kỳ có thể ảnh hưởng đến kết quả.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm

Các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm được nêu trong Bảng A.1 và Bảng A.2.

Bảng A.1 – Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm đối với E.coli bằng phương pháp sử dụng đĩa đếm E.coli/coliform Petrifilm^TM

Bảng A.2 – Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm đối với E.coli bằng phương pháp số đếm có xác suất lớn nhất

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] AFNOR Validation of Alternative Methods. Report (Preliminary and Collaborative studies according to the NF EN ISO 16140 standard) ISO 16140 validation of 3M^TM Petrifilm^TM Coliforms count plates (CC) for gas producing colonies enumeration – Quantitative method. PCC Coliforms gas producers Synthesis (Version 2) September 3, 2008.