TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 6836:2001 (ISO 8069 : 1986) VỀ SỮA BỘT – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT LACTIC VÀ LACTAT – PHƯƠNG PHÁP ENZYM DO BỘ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VÀ MÔI TRƯỜNG BAN HÀNH

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 6836 : 2001

SỮA BỘT – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AXIT LACTIC VÀ LACTAT – PHƯƠNG PHÁP ENZYM
Dried milk – Determination of lactic acid and lactates content – Enzymatic method

Lời nói đầu

TCVN 6836 : 2001 hoàn toàn tương đương với ISO 8069 : 1986;

TCVN 6836 : 2001 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học, Công nghệ và Môi trường ban hành.

1. Phạm vi và lĩnh vực áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp enzym để xác định hàm lượng axit lactic và lactat của tất cả các loại sữa bột.

2. Tiêu chuẩn viện dẫn

TCVN 6400 : 1998 (ISO 707) Sữa và sản phẩm sữa – Lấy mẫu

3. Định nghĩa

Hàm lượng axit lactic và lactat của sữa bột: Hàm lượng của các chất xác định được bằng phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này và được biểu thị bằng miligam axit lactic trên 100 gam chất khô không chứa chất béo.  

4. Nguyên tắc1)

Hòa tan sữa bột trong nước ấm. Cho chất béo và protein kết tủa, sau đó lọc. Xử lý dịch lọc bằng các enzym sau đây và đồng thời bổ sung các chất sinh hóa, nhưng theo thứ tự sau:

– L-lactat dehydrogenaza (L-LDH) và D-lactat dehydrogenaza (D-LDH) khi có mặt nicotinamit adenin dinucleotit (NAD) sẽ oxi hóa lactat thành pyruvat và chuyển hóa NAD thành dạng khử của nó (NADH);

– Glutamat pyruvat transaminaza (GPT) khi có mặt L-glutamat biến đổi pyruvat thành L-alanin và chuyển L-glutamat thành α- ketoglutarat.

Xác định lượng NADH được tạo thành, lượng này tỷ lệ thuận với hàm lượng axit lactic và lactat, bằng cách đo phổ ở bước sóng 340 nm.

5. Thuốc thử

Chỉ sử dụng tất cả các thuốc thử loại tinh khiết phân tích. Nước dùng để chuẩn bị các dung dịch enzym phải được chưng cất ít nhất hai lần bằng dụng cụ thủy tinh và nước sử dụng cho các mục đích khác phải là nước được chưng cất bằng dụng cụ thủy tinh hoặc ít nhất có độ tinh khiết tương đương.

5.1. Dung dịch kali hexaxyanoferat (II).

Hòa tan trong nước 35,9 g kali hexaxyanoferat (II) ngậm 3 nước (K₄[Fe(CN)₆].3H₂O), pha loãng bằng nước đến 1000 ml và trộn.

5.2. Dung dịch kẽm sunfat.

Hòa tan trong nước 71,8 g kẽm sunfat ngậm 7 nước (ZnSO₄.7H₂O), pha loãng bằng nước đến 1000 ml và trộn.

5.3. Dung dịch natri hidroxit, 0,1 mol/l.

Hòa tan trong nước 4,00 g natri hidroxit (NaOH), pha loãng bằng nước đến 1000 ml và trộn.

5.4. Dung dịch đệm, pH 10.

Hòa tan 7,92 g glyxylglyxin (C₄H₈H₂O₃) và 1,47 g axit L-glutamic (C₅H₉NO₄) trong khoảng 80 ml nước. Chỉnh pH đến 10,0 ± 0,1 ở 20⁰C bằng dung dịch natri hidroxit 10 mol/l, pha loãng bằng nước đến 1000 ml và trộn.

Dung dịch này có thể giữ được 3 tháng, nếu bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 0⁰C đến + 5⁰C.             

5.5. Dung dịch NAD

Hòa tan trong 10 ml nước 350 g nicotinamit adenin dinucleotit (C₂₂H₂₇N₇O₁₄P₂).

Dung dịch này có thể giữ được 4 tuần, nếu bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 0⁰C đến +5⁰C.

Khi sử dụng dung dịch này, nên để bình ngập trong nước đá nghiền vụn.

5.6. L-LDH chiết từ cơ lợn con, dung dịch 10 mg/ml trong glyxerol 50% (V/V), pH khoảng 7.

Hoạt tính riêng của dung dịch L-lactat dehydrogenaza (L-LDH, EC 1.1.1.27)1) nên ít nhất là 5 500 đơn vị/ml2) (ở 25⁰C).

Dung dịch này có thể giữ được 12 tháng nếu bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 0⁰C đến + 5⁰C.

Khi sử dụng dung dịch này, nên để bình ngập trong nước đá nghiền vụn.

5.7. D-LDH chiết từ Lactobacillus leichmannii, 5 mg/ml huyền phù trong dung dịch amoni sunfat 3,2 mol/l, pH khoảng 6.

Hoạt tính riêng của huyền phù D-lactat dehydrogenaza (D-LDH, EC 1.1.1.28) nên ít nhất 1 500 đơn vị/ml (ở 25⁰C).

Huyền phù này có thể giữ được 12 tháng nếu bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 0⁰C đến +5⁰C.

Khi sử dụng huyền phù này, nên để bình ngập trong nước đá nghiền vụn.

5.8. GPT chiết từ tim lợn, huyền phù 20 mg/ml trong dung dịch amoni sunfat 3,2 mol/l, pH khoảng 7.

Hoạt tính riêng của huyền phù glutamat pyruvat transaminaza (GPT, EC 2.6.1.2) nên ít nhất là 1 600 đơn vị/ml (ở 25⁰C).

Ly tâm 2 ml huyền phù chứa 10 mg GPT trên lít trong khoảng 10 phút với gia tốc 4 000 g, hút bỏ 1,0 ml phần dịch trong suốt phía trên.

Huyền phù này có thể giữ được 12 tháng nếu bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ 0⁰C đến + 5⁰C.

Khi sử dụng huyền phù này, nên để bình ngập trong nước đá nghiền vụn.

5.9. Dung dịch Liti L-lactat

Hòa tan trong nước 50 mg liti L-lactat (C₃H₅O₃Li), pha loãng đến 500 ml và trộn kỹ.

5.10. Dung dịch liti D-lactat

Hòa tan trong nước 50 mg liti D-lactat (C₃H₅O₃Li), pha loãng đến 500 ml và trộn kỹ.

6. Thiết bị, dụng cụ

Các thiết bị, dụng cụ phòng thí nghiệm thông thường và đặc biệt như sau:

6.1. Cân phân tích.

6.2. Cốc thủy tinh có mỏ, dung tích 50 ml.

6.3. Ống đong chia độ, dung tích 50 ml.

6.4. Bình định mức một vạch, dung tích 100 ml.

6.5. Pipet, để phân phối 0,02 ml; 0,05 ml; 0,2 ml; 1 ml và 2 ml.

6.6. Pipet chia độ, dung tích 5 ml, 10 ml, được chia vạch 0,1 ml.

6.7. Phễu lọc thủy tinh, đường kính khoảng 7 cm.

6.8. Giấy lọc, loại trung bình, đường kính khoảng 15 cm, không chứa axit lactic và lactat.

6.9. Đũa thủy tinh.

6.10. Dao trộn bằng chất dẻo. thích hợp để trộn hỗn hợp mẫu – enzym trong cuvet đo phổ.

6.11. Máy đo phổ, thích hợp để đo ở các bước sóng 340 nm, được gắn với các cuvet đo có chiều dài quang 1 cm.

7. Lấy mẫu

7.1. Xem TCVN 6400 : 1998 (ISO 707).

7.2. Bảo quản mẫu để tránh giảm chất lượng và thay đổi thành phần của mẫu.

8. Cách tiến hành

Chú ý – Tránh nhiễm bẩn mẫu, đặc biệt là do tách lỏng.

8.1. Thử kiểm tra hoạt tính của thuốc thử

Mỗi khi một mẻ thuốc thử mới (từ 5.5 đến hết 5.8) được đưa vào sử dụng, hoặc khi các thuốc thử đó đã được bảo quản trong tủ lạnh chưa sử dụng quá 2 tuần, hoặc khi tiếp tục phân tích sau một chu kỳ gián đoạn hoặc khi các điều kiện khác đều đáp ứng, thì nên tiến hành phân tích về độ thu hồi lactat.

8.1.1. Dùng pipet lấy dung dịch liti L-lactat (5.9) cho vào hai bình định mức một vạch dung tích 100 ml (6.4), mỗi bình 10 ml và lấy dung dịch liti D-lactat (5.10) cho vào hai bình định mức một vạch dung tích 100 ml (6.4) khác, mỗi bình 10 ml và xác định hàm lượng axit L-lactic và lactat và axit D-lactic và lactat của các dung dịch trong các cặp bình, tiến hành như quy định trong 8.5.2 và đến hết 8.6.

8.1.2. Tính hàm lượng liti lactat, tính bằng miligam trên lit theo công thức:

a) Đối với dung dịch L-lactat:

341 x A

b) Đối với dung dịch D-lactat:

346 x A

Trong đó A là độ hấp thụ ở bước sóng 340 nm, được tính theo 8.6.4.

8.1.3. Khi đã tính đến độ sạch khi chuẩn bị liti L-lactat và liti D-lactat, thì độ thu hồi liti L-lactat hoặc liti D-lactat từ bất kỳ bình nào cũng phải nằm trong khoảng 100% ± 5%. Nếu các độ hồi quy không nằm trong phạm vi này thì nên kiểm tra thuốc thử, kỹ thuật thao tác, độ chính xác của pipet và điều kiện của máy đo phổ và thực hiện các công việc cần thiết để thu được kết quả thích hợp. Lặp lại các phép thử cho đến khi thu được các kết quả thích hợp.

8.2. Chuẩn bị mẫu thử

Cho mẫu vào hộp đựng có dung tích lớn khoảng gấp đôi mẫu, có nắp đậy kín khí. Đậy ngay nắp lại và trộn kỹ mẫu bằng cách lặp lại việc lắc và đảo chiều hộp đựng.

Trong quá trình chuẩn bị, tránh để mẫu tiếp xúc với không khí càng nhiều càng tốt, để giảm tối đa hấp phụ nước.

8.3. Phần mẫu thử

Cân 1 g mẫu thử chính xác đến 1mg, cho vào cốc thủy tinh có mỏ (6.2).

8.4. Thử mẫu trắng

Tiến hành thử mẫu trắng theo quy định trong 8.5 và 8.6, sử dụng tất cả các thuốc thử nhưng bỏ qua phần mẫu thử.

8.5. Chuẩn bị dung dịch và khử protein

8.5.1. Hòa tan phần mẫu thử (8.3) trong khoảng 20 ml nước ấm (40⁰C đến 50⁰C), dùng đũa thủy tinh (6.9) để khuấy liên tục. Chuyển hết lượng chứa trong cốc sang bình định mức một vạch 100 ml (6.4) bằng cách tráng bằng nước. Làm nguội bình đến khoảng 20⁰C.

8.5.2. Cho vào dung dịch (8.5.1) theo thứ tự sau: 5,0 ml dung dịch kali hexaxyanoferat (II) (5.1), 5,0 ml dung dịch kẽm sunfat (5.2) và 10,0 ml dung dịch natri hidroxit (5.3), khuấy kỹ sau mỗi lần thêm. Pha loãng bằng nước đến 100 ml, trộn kỹ và để yên hỗn hợp 30 min.

8.5.3. Lọc kỹ qua giấy lọc (6.8), loại phần dịch lọc đầu tiên.

8.6. Tiến hành xác định

8.6.1. Dùng pipet chuyển vào cuvet đo của máy đo phổ (xem 6.11):

1,0 ml dịch lọc (8.5.3);

1,0 ml dung dịch đệm (5.4);

0,20 ml dung dịch NAD (5.5);

0,02 ml huyền phù GPT (5.8).

Dùng dao trộn bằng chất dẻo (6.10) để trộn hỗn hợp trong cuvet đo.

8.6.2. Sau khi trộn lượng chứa trong cuvet đo 5 min, đo độ hấp thụ của dung dịch thử dựa vào nước ở bước sóng 340 nm.

Cho thêm vào cuvet đo 0,02 ml huyền phù L-LDH (5.6) và 0,05 ml huyền phù D-LDH (5.7). Dùng dao để trộn lại và để ở nhiệt độ phòng.

Chú thích – Hàm lượng axit L-lactic hoặc D-lactic và lactat có thể xác định riêng rẽ bằng cách thên L-LDH hoặc D-LDH.

8.6.3. Sau khi thêm huyền phù LDH 45 min và 60 min, đo độ hấp thụ của dung dịch thử dựa vào nước.

Chú thích – Khi chỉ cần đo axit L-lactic và lactat, thì độ hấp thụ có thể được xác định tương ứng sau 30 min và 45 min.

8.6.4. Tính độ hấp thụ A cần để tính trong 9.1, bằng công thức:

[(A_s60 – A_s0) – 4(A_s60 – A_s45)] – [(A_b60 – A_b0) – 4(A_b60 – A_b45)]

Trong đó

A_s60 là độ hấp thụ của dung dịch thử đo được trong 8.6.3 sau 60 min;

A_s0 là độ hấp thụ của dung dịch thử đo được trong 8.6.2;

A_s45 là độ hấp thụ của dung dịch thử đo được trong 8.6.3 sau 45 min;

A_b60 là độ hấp thụ của dung dịch thử mẫu trắng đo được trong 8.6.3 sau 60 min;

A_b0 là độ hấp thụ của dung dịch thử mẫu trắng đo được trong 8.6.2;

A_b45 là độ hấp thụ của dung dịch thử mẫu trắng đo được trong 8.6.3 sau 45 min;

Chú thích

1) Đôi khi xảy ra phản ứng phụ từ từ. Ảnh hưởng của phản ứng phụ này lên độ hấp thụ có thể loại trừ bằng phép ngoại suy độ hấp thụ ở thời điểm zero.

2) Khi độ hấp thụ được đo sau 30 min và 45 min tương ứng, thì công thức sẽ là:

[(A_s45 – A_s0) – 3(A_s45 – A_s30)] – [(A_b45 – A_b0) – 3(A_b45 – A_b30)]

Trong đó:

A_s30 là độ hấp thụ của dung dịch thử đo được trong 8.6.3 sau 30 min;

A_b30 là độ hấp thụ của dung dịch thử mẫu trắng đo được trong 8.6.3 sau 30 min;

8.6.5. Nếu độ hấp thụ tính được trong 8.6.4 tăng quá 0,500, thì lặp lại các quy trình quy định trong 8.6.1 đến hết 8.6.4, sử dụng độ pha loãng thích hợp của dịch lọc thu được từ phần mẫu thử (8.5.3) và cả dung dịch thử mẫu trắng (8.4).

9. Biểu thị kết quả

9.1. Phương pháp tính và công thức

Hàm lượng axit lactic và lactat được biểu thị theo miligam axit lactic trên 100 g chất khô không chứa chất béo, theo công thức sau:

Trong đó:

A là độ hấp thụ ở bước sóng 340 nm, tính được trong 8.6.4;

Mr là khối lượng phân tử của axit lactic (90,1);

k là hệ số hấp thụ phân tử của NADH ở 340 nm, tức là 6,3 x 10⁶ cm²/mol;

l là chiều dài đường quang của cuvet đo phổ (1 cm);

m là khối lượng phần mẫu thử (8.3), tính bằng gam;

V₁ là tổng thể tích chất lỏng trong cuvet đo (xem 8.6.2), tính bằng mililit;

Chú thích:

V₁ = 2,29 ml, khi phải xác định cả axit D-lactic lẫn L-lactic và lactat;

V₁ = 2,24 ml, khi chỉ phải xác định axit L-lactic và lactat;

V₁ = 2,27 ml, khi chỉ phải xác định axit D-lactic và lactat;

V₂ là thể tích dịch lọc (xem 8.5.3) trong cuvet đo của máy đo phổ (xem 8.6.4), tính bằng mililit;

V₃ là thể tích dịch lọc (xem 8.5.3) được dùng để pha loãng (xem 8.6.5), nếu cần, tính bằng mililit;

V₄ là thể tích của dung dịch trong 8.5.2 (= 100 ml), tính bằng mililit;

V₅ là thể tích của dung dịch dùng để đã pha loãng mẫu thử (xem 8.6.5), nếu cần, tính bằng mililit;

W_nfs là hàm lượng chất khô không chứa chất béo của mẫu, được biểu thị theo phần trăm khối lượng.

Ghi lại hàm lượng axit lactic và lactat chính xác đến 1 mg/100 g chất khô không chứa chất béo.

9.2. Độ chính xác

Chú thích – Các giá trị về độ lặp lại và độ tái lập thu được từ các kết quả của thử liên phòng thí nghiệm tiến hành theo TCVN 4550-90 (ISO 5725).

9.2.1. Độ lặp lại

Chênh lệch giữa hai kết quả thử nghiệm thu được khi tiến hành đồng thời hoặc kế tiếp do cùng một người phân tích sử dụng cùng thiết bị không được vượt quá 10 mg/100 g chất khô không chứa chất béo nếu giá trị trung bình của hàm lượng axit lactic và lactat lên đến 60 mg/100 g chất khô không chứa chất béo và không được vượt quá 15% trung bình cộng của các kết quả nếu hàm lượng axit lactic và lactat vượt quá 60 mg/100 g chất khô không chứa chất béo.

9.2.2. Độ tái lập

Chênh lệch giữa hai kết quả thử nghiệm độc lập thu được do hai người phân tích trong các phòng thí nghiệm khác nhau, sử dụng vật liệu thử giống hệt nhau không được vượt quá 15 mg/100 g chất khô không chứa chất béo nếu giá trị trung bình của hàm lượng axit lactic và lactat lên đến 10 mg/100 g chất khô không chứa chất béo và không được vượt quá 20% trung bình cộng của các kết quả nếu hàm lượng axit lactic và lactat vượt quá 100 mg/100 g chất khô không chứa chất béo.

10. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải chỉ ra phương pháp đã sử dụng và kết quả thu được. Cũng phải đề cập đến tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả.

Báo cáo thử nghiệm cũng phải bao gồm mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử.