TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 7080:2002 (ISO 14378 : 2000) VỀ SỮA VÀ SỮA BỘT – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG IOĐUA – PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO DO BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BAN HÀNH

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 7080:2002

SỮA VÀ SỮA BỘT – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG IOĐUA
PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Milk and dried milk – Determination of iodide content
Method using high-performance liquid chromatography

LỜI NÓI ĐẦU

TCVN 7080: 2002 hoàn toàn tương đương với ISO 14378 : 2000;

TCVN 7080: 2002 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành.

Cảnh báo – Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các chất liệu, thiết bị và các thao tác nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đề cập đến các vấn đề an toàn khi sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn qui định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để xác định hàm lượng iođua khi có mặt ở các mức tương ứng 0,03 mg/g đến 1 mg/g và 0,3 mm/g đến 10,0 mg/g trong  sữa nguyên chất thanh trùng và sữa bột gầy.

Chú thích 1 – Phương pháp này được nghiên cứu cộng tác trên các mẫu sữa nguyên chất dạng lỏng và sữa bột gầy. Phương pháp này có thể áp dụng được cho sữa gầy hoặc sữa bột tách một phần chất béo giống như sữa bột nguyên chất.

Chú thích 2 – Phương pháp này dùng để định lượng iođua tự do (dạng ion). Tuy nhiên, tổng hàm lượng iođua của sữa tươi và sữa bột chất lượng tốt, không có sự phát triển của vi sinh vật, có thể chứa từ 5% đến 10% khối lượng iođua liên kết hữu cơ. Hàm lượng iođua liên kết hữu cơ có thể nhiều hơn trong sữa đã bị giảm chất lượng do vi khuẩn phát triển.

2. Tiêu chuẩn viện dẫn

TCVN 4851-89 (ISO 3696) Nước dùng để phân tích trong phòng thử nghiệm. Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

3. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này áp dụng định nghĩa sau:

3.1. Hàm lượng iođua của sữa nguyên chất thanh trùng hoặc sữa bột gầy (iodide content of pasteurized whole milk or dried milk): Phần khối lượng của các chất xác định bằng qui trình qui định trong tiêu chuẩn này.

Chú thích – Hàm lượng iođua thường được biểu thị bằng microgram trên gam.

4. Nguyên tắc

Pha loãng phần mẫu thử bằng nước. Lọc qua màng lọc xén mép 25000 D để loại bỏ chất không tan và chất có khối lượng phân tử cao. Các ion iođua được tách bằng cặp ion pha đảo HPLC có detector điện hóa và một điện cực bằng bạc làm việc ở 0 mV đến 50mV. Hàm lượng iođua được tính bằng cách dùng đường chuẩn.

5. Thuốc thử

Chỉ sử dụng thuốc thử đạt chất lượng tinh khiết phân tích, hoặc loại HPLC đặc biệt, nếu phù hợp.

5.1. Nước, phù hợp với nước loại 2 của TCVN 4851 – 89 (ISO 3696)

5.2. Dung dịch tiêu chuẩn iođua

Cảnh báo – các dung dịch iođua không bền khi tiếp xúc với ánh sáng vì thế cần được bảo vệ tránh ánh sáng.

5.2.1 Dung dịch gốc iođua, tương đương với 100mg iođua trên lít.

Hòa tan 130,8mg kali iođua (KI) trong nước đựng trong bình định mức 1 000 ml (6.2). Pha loãng bằng nước đến vạch và lắc đều.

Dung dịch gốc iođua có thể giữ trong vòng 1 tháng nếu được bảo quản trong bóng tối ở nhiệt độ phòng.

5.2.2. Dung dịch tiêu chuẩn làm việc iođua, có nồng độ tương đương 20mg, 50mg, 150 mg và 250 mg của iođua trong 1 lít.

Dùng pipet lấy 20ml, 50ml, 150 ml, và 250 ml dung dịch gốc iođua (5.2.1) cho vào trong bốn bình định mức 100ml riêng biệt (6.2). Pha loãng dung dịch trong các bình bằng nước vạch và lắc.

Các dung dịch tiêu chuẩn làm việc iođua có thể giữ được trong vòng một tuần nếu bảo quản nơi tối và ở nhiệt độ phòng.

5.3. Axetonitril (CH₃CN), loại dùng cho HPLC.

5.4. Hexadexyltrimetylamoni clorua [CH₃(CH₂)₁₅N(CH₃)₃Cl], dung dịch 25% (theo khối lượng) trong nước, loại dùng cho sắc ký cặp ion.

5.5. Chất rửa giải dùng cho HPLC: Hỗn hợp dinatri hydro phosphat và hexadexyltrimetylamoni clorua trong hỗn hợp của axetonitril và nước (tỷ lệ 68 : 32 thể tích), pH = 6,8.

Hòa tan 1,42 g dinatri hydro phosphat (Na₂HPO₄) trong khoảng 600ml nước trong bình định mức 1000 ml (6.2). Thêm 1,3 ml dung dịch hexadexyltrimetylamoni clorua (5.4) và lắc đều. Rồi thêm 320 ml axetonitril (5.3) và lắc lại. Chỉnh pH đến 6,8 bằng axit ortophosphoric (H₃PO₄) đậm đặc. Pha loãng bằng nước đến vạch và lắc đều.

Làm trong dung dịch bằng cách lọc qua màng lọc 1,2 mm rồi lọc tiếp qua màng lọc 0,5mm. Khuấy dung dịch để trộn đều đồng thời loại khí bằng thiết bị hút chân không siêu âm trong 2 phút trước khi bắt đầu sử dụng. Chất rửa giải có thể thay đổi bằng cách thêm một ít nước hoặc axetonitril để việc chỉnh thời gian lưu của iođua là không đáng kể. Chất rửa giải có thể giữ được trong 1 năm, nếu được bảo quản trong vật chứa có nắp đậy kín.

5.6. n-Pentanol

6. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị phòng thử nghiệm thông thường và đặc biệt như sau:

6.1. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,01g, có thể đọc đến số thập phân thứ ba.

6.2. Bình định mức, dung tích 100ml và 1000 ml.

6.3. Micropipet, có thể phân phối các thể tích tương ứng là 20ml, 50 ml, 150 ml và 250 ml.

6.4. Pipet chia độ, dung tích 2ml, chia độ đến 0,1 ml.

6.5. Ống đong chia độ, dung tích 500ml.

6.6. pH-met, có điện cực thủy tinh kết hợp.

6.7. Bộ lọc màng, cỡ 1,2 mm và 0,5 mm, bằng Nylon-6-6¹⁾ hoặc vật liệu tương đương, có thiết bị lọc chất rửa giải PHLC.

6.8. Máy ly tâm, có thể giữ các ống ly tâm 50ml và có thể tạo gia tốc quay 1000g.

6.9. Ống ly tâm, hình nón dung tích 50ml, đường kính trong 27 mm, bằng chất dẻo dùng một lần, có nắp vặn.

6.10. Dụng cụ đỡ màng lọc hình nón, để đỡ phễu lọc màng (6.11) trong các ống ly tâm (6.9) Amicon CS1A1), hoặc tương đương).

6.11 Phễu lọc màng, cỡ từ 25000 D đến 30000 D (Amicon Centreflo¹⁾ CF-25, hoặc tương đương).

Chuẩn bị các phễu lọc mới trước khi sử dụng như sau. Ngâm phễu trong hỗn hợp của etanol và nước (tỷ lệ 2:8 thể tích) trong vòng 1h. Lấy phễu ra và để ráo nước. Đặt phễu vào trong dụng cụ đỡ màng lọc hình nón (6.10) và đặt dụng cụ đỡ vào trong ống ly tâm 50ml. Ly tâm phễu ở gia tốc quay 900g đến 1000g trong 5 phút đến 10 phút.

Đảo ngược phễu lọc màng mới để làm khô hết phần dung môi còn sót lại. Đặt phễu đã chuẩn bị vào các dụng cụ đỡ trong ống ly tâm sạch đã được dán nhãn (6.9) dùng cho mẫu phân tích. Sau mỗi lần sử dụng, ngâm phễu vào nước nóng, và bảo quản trong hỗn hợp của etanol và nước (tỷ lệ 1:5 thể tích). Loại bỏ dung môi trước khi sử dụng phễu cho lần tiếp theo như đã miêu tả ở trên đối với phễu mới.

Chú thích – Để thay thế có thể dùng bộ lọc Milipore Ultrare –PF¹⁾ (UFP1, ngưỡng 10.000 D). Bộ lộc dùng một lần không cần phải xử lý trước, và quá trình lọc có thể được thực hiện bằng áp suất nhẹ hoặc chân không không cần máy ly tâm.

6.12. Thiết bị HPLC, bao gồm:

6.12.1. Máy bơm, có thể phân phối ở tốc độ dòng thể tích 2ml/min.

6.12.2. Dụng cụ bơm mẫu, bằng tay hoặc tự động, dung tích bơm từ 50ml đến 200ml.

6.12.3. Cột phân tích, PARTISPHERE C-182), 5mm, đường kính trong 4,7 mm, dài 110mm, hoặc tương đương.

6.12.4. Cột chắn (tùy chọn), ống SPHERI-5 C-183), đường kính trong 3,2 mm, dài 15 mm, hoặc tương đương.

6.12.5. Detector điện hóa, được dùng trong d.c mode hoặc loại chuẩn ampe xung có điện cực làm việc bằng bạc ở điện thế từ 0mV đến + 50mV.

6.12.6. Bộ ghi băng biểu đồ hoặc bộ tích phân, có thể đo diện tích pic; tốt hơn là dùng bộ máy tích phân điện tử có chức năng đo “pic âm” (ví dụ Spectra Physics4) là thích hợp).

7. Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400: 1998 (ISO 707) [1].

Điều quan trọng là phòng thử nghiệm nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hỏng hoặc không bị biến đổi chất lượng trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Bảo quản mẫu để tránh bị hỏng hoặc biến đổi thành phần.

8. Chuẩn bị mẫu thử

8.1. Khái quát

Tránh bất kỳ sự nhiễm khuẩn nào trong suốt quá trình chuẩn bị mẫu.

8.2. Sữa

Đưa mẫu thử về nhiệt độ 20⁰C±2⁰C và trộn đều. Nếu không thu được sự phân tán đồng đều của chất béo thì đung nóng mẫu từ từ đến 40⁰C, và trộn nhẹ bằng cách đảo ngược dụng cụ chứa mẫu. Sau đó làm nguội đến nhiệt độ 20⁰±2⁰C.

8.3. Sữa bột

Chuyển mẫu sang dụng cụ chứa có nắp đậy kín khí, dung tích lớn gấp hai lần thể tích của mẫu. Đậy ngay dụng cụ chứa và trộn đều mẫu bằng cách lắc và đảo ngược dụng cụ chứa nhiều lần.

9. Cách tiến hành

9.1. Phần mẫu thử

9.1.1. Sữa

Cân 45g±5g phần mẫu thử, chính xác đến 0,1 g và cho vào trong bình định mức 100ml (6.2). Pha loãng bằng nước đến vạch và trộn đều.

9.1.2. Sữa bột

Cân 4,2 g±0,2 g mẫu thử, chính xác đến 0,01 g cho vào bình định mức 100ml (6.2). Thêm 70ml đến 80ml nước và lắc mạnh trong 5 phút đến 10phút để hòa tan mẫu. Cho 1 giọt n-pentanol (5.6) để khử bọt và trộn. Pha loãng bằng nước đến vạch và trộn đều.

9.2. Làm sạch

Từ phần mẫu thử đã được pha loãng (9.1.1 hoặc 9.1.2) rót đầy vào hai phễu màng lọc cách đỉnh khoảng 5 mm và cho li tâm ở gia tốc hướng tâm 900g đến 1000g trong 15 phút đến 20 phút. Phần dịch lọc trong thu được (nghĩa là đối với một mẫu hai dung dịch thử) có thể bơm trực tiếp lên hệ thống HPLC.

Chú thích – Về qui trình làm sạch thay thế, xem chú thích ở 6.11.

9.3. Xác định bằng HPLC.

9.3.1. Tối ưu hóa các điều kiện HPLC

Rửa cột HPLC mới bằng cách bơm qua cột một hỗn hợp axetonitril (5.3) và nước (5.1) (tỷ lệ 1: 1 thể tích), và bơm tiếp 30ml chất rửa giải HPLC (5.5). Rồi bơm lại chất rửa giải với tốc độ 2ml/min trong vòng ít nhất 1h.

Bật detector điện hóa (6.12.5) (điện thế 0mV đến + 50mV; đầu ra với thang đo từ 10nA đến 20nA). Tiếp tục bơm chất rửa giải HPLC (5.5) cho đến khi thu được đường nền ổn định.

Bơm tiếp 50ml dung dịch tiêu chuẩn làm việc iođua với nồng độ iođua 250ml/l (5.2.2) cho đến khi thời gian lưu và chiều cao pic là ổn định; tức là chênh lệch tuyệt đối giữa các chiều cao pic của hai lần bơm kế tiếp nhau không vượt quá 3%. Thời gian lưu các iođua nằm trong khoảng từ 4 phút đến 8 phút; nếu không, thì chỉnh lại thành phần của chất rửa giải (xem 5.5). Chỉnh điện thế của điện cực trong khoảng 0mV đến + 50mV để tối ưu hóa dạng của pic và chiều cao pic (xem hình 1).

Xác định thể tích bơm của dung dịch tiêu chuẩn làm việc iođua 250mg/l (5.2.2) cho chiều cao pic khoảng 80% kích thước thực. Sử dụng thể tích bơm này cho tất cả các dung dịch thử và các dung dịch tiêu chuẩn.

Dịch rửa giải HPLC (5.5) có thể được bơm lại giữa các lần phân tích mẫu hoặc khi chỉ có các dung dịch tiêu chuẩn được bơm. Tuy nhiên, không bơm dịch rửa giải khi đang bơm các dung dịch thử. Khi sử dụng thông thường, dịch rửa giải được bơm ở tốc độ 0,2 ml/min để duy trì tính sẵn sàng của hệ thống. Trong suốt quá trình sử dụng giữa các khoảng thời gian bị kéo dài, hệ thống HPLC được rửa bằng hỗn hợp axetonitril (5.3) và nước (5.1) (tỷ lệ 1:1 thể tích) và cân bằng lại bằng dịch rửa giải HPLC (5.5) trước khi dùng tiếp.

9.3.2. Đo

Bơm bốn dung dịch tiêu chuẩn làm việc iođua (5.2.2). Sau khi rửa giải iođua chờ 5 phút rồi bơm tiếp. Đo các chiều cao pic iođua hoặc các diện tích pic của các dung dịch tiêu chuẩn làm việc iođua.

Bơm các phần mẫu thử (hai lần như thu được trong 9.2). Sau khi rửa giải iođua chờ 5 phút rồi bơm tiếp. Đo các chiều cao pic iođua hoặc các diện tích pic.

Sau 6 lần đến 8 lần bơm các dung dịch thử, bơm lại dung dịch tiêu chuẩn làm việc iođua 150mg/l (5.2.2). Chiều cao pic hoặc diện tích pic iođua chênh lệch không được quá 5% so với giá trị thu được trước đó.

Tùy thuộc vào các điều kiện làm sạch, chất lượng của các dung môi HPLC và điện cực mà có thể quan sát thấy pic iođua trong sắc phổ nằm dưới đường nền theo hướng dốc xuống. Máy tích phân phải được chỉnh sao cho phần âm của pic (dưới đường nền) không nằm trong phép đo chiều cao pic hoặc diện tích pic.

9.4. Chuẩn bị đường chuẩn

Thực hiện phép phân tích bình phương tối thiểu tuyến tính trên mối tương quan giữa nồng độ và tín hiệu thu được (chiều cao pic hoặc diện tích pic) đối với bốn dung dịch tiêu chuẩn làm việc iođua. Không tính điểm zero (0,0) trong phép tính. Hệ số tương quan phải là 0,99.

10. Tính và biểu thị kết quả

10.1. Tính toán

Hàm lượng iođua được tính theo công thức:

w_I =  x 0,1

Trong đó

w_I là giá trị số học hàm lượng iođua của mẫu thử, tính bằng microgram trên gam;

w_t là giá trị số học hàm lượng iođua của dung dịch thử được tính từ đường hồi qui hoặc đọc từ đường chuẩn, tính bằng microgram trên lít;

m là giá trị số học khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng gam.

10.2. Biểu thị kết quả

10.2.1. Sữa

Biểu thị kết quả thử nghiệm đến ba chữ số thập phân đối với hàm lượng iođua nhỏ hơn 0,1 mg/g, và đến hai chữ số thập phân với hàm lượng iođua từ 0,1 mg/g đến 1mg/g.

10.2.2. Sữa bột

Biểu thị kết quả thử nghiệm đến hai chữ số thập phân đối với hàm lượng iođua nhỏ hơn 1mg/g, và đến một chữ số thập phân đối với hàm lượng iođua từ 1 mg/g đến 10mg/g.

11. Độ chụm

11.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm

Các giá trị lặp lại và tái lập thu được từ các kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm theo ISO 57255).  Các kết quả này được nêu trong tài liệu tham khảo [5].

11.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn, riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau trong một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, lớn hơn 25% trung bình cộng của hai kết quả trong không vượt quá 5% các trường hợp.

10.1. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn, riêng rẽ, thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành thử trên vật liệu giống nhau trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do các nhà phân tích khác nhau sử dụng các thiết bị khác nhau, lớn hơn 30% trung bình cộng của  hai kết quả trong không vượt quá 5% các trường hợp.

12. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải chỉ ra được:

– mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

– phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

– phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

– tất cả các chi tiết thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả.

– kết quả thu được, hoặc nếu kiểm tra độ lặp lại, nêu kết quả cuối cùng thu được.

Từ khóa

1. Bơm

2. Iođua

Chú thích – Sắc phổ LC đặc thù trong dung dịch tiêu chuẩn làm việc iođua và trong mẫu sữa bột phân tích trên cột PARTISHERE C-18 5mm, đường kính trong 4,7 mm, chiều dài 110mm.

Hình 1- Sắc ký đồ đặc thù của các dung dịch iođua

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] TCVN 6400: 1998 (ISO 707) Sữa và sản phẩm sữa – Hướng dẫn lấy mẫu.

[2] ISO 5725: 1986, Precision of test methods – Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests.

[3] TCVN 6910-1: 2001 (ISO 5725-1:1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo. Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa

[4] TCVN 6910-2: 2001 (ISO 5725-2:1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo. Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.

[5] SERTL D VÀ MALONE WW.J.AOAC. Int., 76, 1993, phương pháp. 711-719.

[6] AOAC International, Offcial methods of analysis, 16^th edition, 1995, phương pháp số. 922.22.