TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 7081-1:2002 ( ISO 12080 – 1 : 2000) VỀ SỮA BỘT GẦY – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN A – PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP SO MÀU DO BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BAN HÀNH

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 7081-1:2002

SỮA BỘT GẦY – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN A. PHẦN 1: PHƯƠNG PHÁP SO MÀU
Dried skimmed milk – Determination of vitamin A content. Part 1: Colorimetric method

Lời nói đầu

TCVN 7081-1:2002 hoàn toàn tương đương với ISO 12080 – 1 : 2000;

TCVN 7081 – 1 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành.

Cảnh báo – Khi áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các chất liệu, thiết bị và các thao tác nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không đề cập đến các vấn đề an toàn khi sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp so màu để xác định vitamin A trong sữa bột gầy chứa ít nhất 10 IU (đơn vị quốc tế) vitamin A trên gam

2. Thuật ngữ và định nghĩa

2.1. Hàm lượng vitamin A của sữa bột gầy (Vitamin A content of dried skimmed milk): Phần khối lượng của các chất xác định được bằng quy trình quy định trong tiêu chuẩn này.

Chú thích – Hàm lượng vitamin A được biểu thị bằng microgam của retinol trên gam hoặc bằng đơn vị quốc tế của hoạt độ của vitamin A trên gam.

3. Nguyên tắc

Mẫu thử được xà phòng hóa và được chiết. Chất không thể xà phòng hóa được thì cho phản ứng với axit trifloaxetic. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 620 nm.

4. Thuốc thử

Chỉ sử dụng thuốc thử đạt chất lượng tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác và chỉ sử dụng nước cất hoặc nước đã khử khoáng hoặc nước có độ tinh khiết tương đương

4.1. Etanol (CH­₃CH₂OH), 95% (tính theo thể tích), không chứa aldehyt.

4.2. Dung dịch natri ascocbat, 200 g/l

Khi không có sẵn, thì chuẩn bị bằng cách hòa tan 3,5 g axit ascorbic (C₆H_8­O₆) trong 20 ml dung dịch natri hydroxit (NaOH) 1 mol/l và trộn. Chuẩn bị dung dịch mới trong ngày sử dụng.

4.3. Dung dịch kali hydroxit (KOH), 50% (theo khối lượng).

Hòa tan 50 g kali hydroxit trong 50 ml nước. Trộn và làm nguội dung dịch. Chuẩn bị dung dịch mới trước khi sử dụng

4.4. Dung dịch nước cồn kali hydroxit, 30 g/l.

Hòa tan 3 g kali hydroxit (KOH) trong nước và thêm 10 ml etanol (4.1) vào bình định mức 100 ml. Pha loãng bằng nước đến vạch 100 ml và trộn. Chuẩn bị dung dịch mới trước khi sử dụng.

4.5. Dầu nhẹ, có dải sôi từ 40⁰C đến 60⁰C hoặc từ 60⁰C đến 80⁰C.

4.6. Clorofoc (CHCl₃).

4.7. Axit trifluoroaxetic (CF₃COOH).

Cảnh báo – Clorofoc và axit trifluoroaxetic là các chất gây ung thư. Cần phải phòng ngừa.

4.8. Thuốc thử màu

Trộn 1 phần thể tích axit trifloaxetic tinh khiết (4.7) và 2 phần clorofoc (4.6).

4.9. Dung dịch vitamin A tiêu chuẩn

Sử dụng dung dịch vitamin A chuẩn theo tiêu chuẩn US Pharmacopeia1) được pha chế từ crystalin all-trans-retinyl axetat trong dầu hạt bông, tương đương với 30 mg retinol (vitamin A dạng rượu, C₂₀H₃₀O) trên gam dầu, hoặc theo công bố khi bán.

Có thể sử dụng dung dịch tiêu chuẩn thứ nếu chuẩn hóa dung dịch đối chứng tiêu chuẩn đầu hoặc bằng cách đo UV.

Cắt một đầu của vỏ ống chứa dung dịch vitamin A tiêu chuẩn, và chuyển lượng dầu trong đó (đã được cân bao bì) vào trong bình định mức màu hổ phách dung tích 100 ml. Cân lượng chứa trong bình chính xác đến 0,1 mg. Pha loãng bằng clorofoc (4.6) đến vạch 100 ml. Sử dụng dung dịch vitamin A tiêu chuẩn càng sớm càng tốt. Chỉ dùng dung dịch này trong vòng 8 giờ.

4.10. Hydroxytoluen đã butylat hóa (BHT)

5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị phòng thí nghiệm thông thường và đặc biệt như sau:

5.1. Máy so màu quang điện hoặc máy quang phổ, có cơ cấu quang học hoặc bộ lọc hoạt động ở bước sóng 620 nm (dẫn xuất vitamin A).

Sử dụng các cuvet hấp thụ thích hợp. Tốt nhất là một dụng cụ cho tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ.

5.2. Cốc có mỏ hoặc bình nón, dung tích 250 ml.

5.3. Bình xà phòng hóa, dung tích khoảng 200 ml, có gắn với một bộ sinh hàn ngược.

5.4. Bình định mức, dung tích 100 ml và 200 ml.

5.5. Pipet một vạch, dung tích 2 ml, 10 ml, 25 ml và 50 ml.

5.6. Pipet tự động, thích hợp với các dung môi hữu cơ, hoặc một pipet để phân phối được 10 ml.

5.7. Bồn hơi, bếp cách thủy hoặc bếp cách khí dùng điện.

5.8. Nồi cách thủy, có thể duy trì nhiệt độ đến 40⁰C.

5.9. Phễu chiết, dung tích 500 ml, thích hợp là loại có nút đậy bằng polytetrafloetylen (PTFE).

5.10. Bể siêu âm.

5.11. Giấy lọc, đường kính 9 cm.

6. Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 : 1998 (ISO 707) [1]. Điều quan trọng là phòng thử nghiệm nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc không bị biến đổi chất lượng trong quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

7. Chuẩn bị mẫu thử

Trộn kỹ mẫu thử bằng cách xoay và lật ngược vật chứa mẫu nhiều lần. Nếu cần, chuyển hết mẫu thử sang vật chứa kín khí có dung tích vừa đủ.

8. Cách tiến hành

8.1. Khái quát

Chú thích – Nếu cần phải kiểm tra sự thỏa mãn về giới hạn độ lặp lại (10.2), thì tiến hành hai phép xác định đơn theo 8.2 đến 8.5.

Đối với tất cả các thao tác, thực hiện trong ánh sáng dịu hoặc sử dụng đồ thủy tinh có độ quang hóa thấp.

8.2. Dung dịch thử

Cân khoảng 20 g mẫu thử chính xác đến 0,001 g cho vào trong cốc có mỏ hoặc bình nón (5.3) và hòa tan chúng trong 50 ml nước nóng ở nhiệt độ thấp nhất là 80⁰C. Dùng dao trộn hoặc sử dụng bể siêu âm (5.10) để phá vỡ các cục bị vón thành tảng. Để nguội đến nhiệt độ phòng. Chuyển toàn bộ lượng này sang bình định mức 100 ml (5.4). Pha loãng bằng nước đến vạch 100 ml.

8.3. Xà phòng hóa và chiết

8.3.1. Dùng pipet (5.5) chuyển 25 ml dung dịch thử đã chuẩn bị (8.2) sang bình xà phòng hóa (5.3). Thêm 20 ml dung dịch kali hydroxit (4.3) và 10 ml dung dịch natri ascocbat (4.2). Thêm 50 ml etanol (4.1) và lắc đều.

8.3.2. Chưng cất hồi lưu 30 phút trên nồi hơi (5.7), thỉnh thoảng khuấy. Làm nguội nhanh dưới dòng nước chảy.

8.3.3. Chuyển dung dịch lỏng sang phễu chiết (5.9), tráng bình 2 lần mỗi lần 30 ml nước, tiếp theo hai lần mỗi lần 10 ml etanol (4.1) và hai lần mỗi lần 40 ml dầu nhẹ (4.5). Lắc mạnh trong 30 giây và để yên đến khi có hai lớp rõ ràng.

Chuyển pha lỏng (pha dưới) sang phễu chiết thứ hai và lắc với hỗn hợp 10 ml etanol (4.1) và 40 ml dầu nhẹ (4.5). Để cho phân lớp.

8.3.4. Chuyển pha lỏng sang phễu chiết thứ ba và dung dịch pha dầu nhẹ sang phễu chiết thứ nhất. Rửa phễu chiết thứ hai hai lần, mỗi lần dùng 10 ml dầu nhẹ (4.5). Cho dịch rửa vào phễu chiếc thứ nhất.

8.3.5. Lắc pha lỏng với 40 ml dầu nhẹ (4.5) và 10 ml etanol (4.1). Cho pha dầu nhẹ vào phễu chiết thứ nhất. Rửa dịch chiết bằng dầu nhẹ ba lần, mỗi lần dùng 40 ml dung dịch nước cồn kali hydroxit (4.4) mới chuẩn bị, lắc mạnh. Sau đó dùng cho mỗi lần 40 ml nước để rửa tiếp cho đến khi dịch rửa cuối cùng trung tính phenolphtalein. Tháo hết nước, cho qua hai tấm giấy lọc (5.11) được cắt thành dải vào phễu chiết và lắc.

8.3.6. Chuyển dịch chiết dầu nhẹ đã được làm khô như mô tả ở trên sang bình định mức 200 ml (5.4). Tráng phễu chiết và giấy lọc bằng dầu nhẹ (4.5), cho nước rửa vào bình định mức, rồi thêm từ 10 mg đến 20 mg BHT (4.10). Pha loãng bằng dầu nhẹ đến vạch 200 ml và lắc đều.

8.4. Chuẩn bị dung dịch thử so màu

Dùng pipet lấy các phần dịch chiết đã pha loãng (8.3.6) vào bình đáy tròn. Cho bay hơi đến khô trong chân không bằng cách xoay bình trong nồi cách thủy (5.8) ở nhiệt độ không quá 40⁰C. Làm nguội bình dưới dòng nước chảy và hồi lại áp suất không khí, tốt nhất là bằng khí nitơ. Hòa tan ngay phần còn lại trong 10,0 ml clorofoc (4.6).

Chú thích – Nồng độ điển hình của dung dịch thử là 10 IU vitamin A trên mililit clorofoc. Có thể chỉnh lượng của các phần dịch chiết theo kích cỡ và độ nhạy của cuvet so màu.

8.5. Xác định

Lấy hai cuvet so màu thích hợp là 1 và 2. Dùng pipet lấy 2 ml dung dịch thử so màu (8.4) cho vào cuvet 1. Dùng pipet lấy 2 ml của dung dịch vitamin A tiêu chuẩn đã pha loãng (8.6) cho vào cuvet 2. Thêm nhanh vào mỗi cuvet 10 ml thuốc thử màu (4.8), tốt nhất là dùng pipet tự động (5.6) và lắc đều. Kiểm tra độ hấp thụ của các dung dịch ở bước sóng 620 nm bằng máy so màu quang điện hoặc máy đo quang phổ (5.1) được đo so với mẫu trắng gồm 2 ml clorofoc (4.6) và 10 ml thuốc thử màu (4.8) cho đến khi độ hấp thụ đạt giá trị cực đại. Dựng đồ thị của độ hấp thụ và nồng độ vitamin A thu được (xem 8.6).

Có thể điều chỉnh thể tích và tỷ lệ sử dụng theo dung tích của cuvet so màu.

8.6. Chuẩn bị đường chuẩn

Chuẩn bị năm độ pha loãng của dung dịch vitamin A tiêu chuẩn (4.9) với clorofoc (4.6) sao cho các phần 2 ml đã xử lý cho các độ hấp thụ từ 0,07 đến 0,7 ở bước sóng 620 nm trong phép xác định màu. Dựng đồ thị của độ hấp thụ và hàm lượng vitamin A, tính bằng microgam. Nếu đồ thị là một đường thẳng, thì hệ số đối với hàm lượng vitamin A trong mẫu có thể tính được.

9. Tính và biểu thị kết quả

Tính hàm lượng vitamin A, w, bằng microgam retinol trên gam (hoặc hoạt độ vitamin A, biểu thị bằng đơn vị quốc tế trên gam), theo công thức sau:

Trong đó

c là nồng độ retinol, tính được từ đường chuẩn (8.6), tính bằng microgam retinol trên mililit (hoặc bằng IU của hoạt độ vitamin A trên mililit) trong dung dịch mẫu để so màu (8.4);

V₁ là tổng thể tích dịch chiết bằng dầu nhẹ (V₁ = 200 ml), tính bằng mililit;

V₂ là thể tích dung dịch được lấy từ V₁ (8.4), tính bằng mililit;

V₃ là thể tích clorofoc dùng để hòa tan phần còn lại (V₃ = 10 ml), tính bằng mililit;

V₄ là tổng thể tích dung dịch thử (8.2) (V₄ = 100 ml), tính bằng mililit;

V₅ là phẩn thể tích phần dung dịch thử (8.3.1) (V₅ = 25 ml), tính bằng mililit;

m là khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng gam.

10. Độ chụm

10.1. Liên phòng thử nghiệm

Các chi tiết của liên phòng thử nghiệm tiến hành theo TCVN 6910:2001 (ISO 5725) về độ chụm của phương pháp đã được xuất bản [4]. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và matrix khác với các giá trị đã nêu.

10.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn độc lập, thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành trên vật liệu thử giống hệt nhau trong một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, lớn hơn 14% trung bình cộng của hai kết quả trong không quá 5% các trường hợp.

10.3. Độ tái lặp

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn độc lập, thu được khi sử dụng cùng phương pháp tiến hành thử trên vật liệu giống nhau trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do các nhà phân tích khác nhau sử dụng các thiết bị khác nhau, lớn hơn 42% trung bình cộng của hai kết quả trong không quá 5% các trường hợp.

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải được chỉ ra được

– mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

– Phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

– phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

– tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng tới kết quả;

– kết quả thu được hoặc nếu kiểm tra độ lặp lại, nêu kết quả cuối cùng thu được.

PHỤ LỤC A

(tham khảo)

BIỂU THỊ HOẠT ĐỘ BẰNG ĐƠN VỊ QUỐC TẾ (IU)

A.1. Hoạt độ vitamin A

Hoạt độ của vitamin A được biểu thị bằng đơn vị quốc tế. Người ta đã xác định được rằng 1 IU của vitamin A tương đương với hoạt độ 0,344 μg all-trans-retinyl axetat [5].

Hoạt độ của các hợp chất vitamin A khác được tính theo phép định lượng hóa học sao cho 1 IU tương đương với hoạt độ của 0,300 μg all-trans-retinol. 0,35 μg all-trans-retinyl propionat hoặc 0,500 μg all-trans-retinyl palmitat tương ứng.

Điều đó có nghĩa là hoạt độ của 1 g all-trans-vitamin A dạng rượu tinh khiết và este, biểu thị bằng đơn vị quốc tế, bằng:

– 3 333 000 IU Vitamin A dạng rượu (retinol);

– 2 907 000 IU Vitamin A axetat;

– 2 785 000 IU Vitamin A propionat;

– 1 818 000 IU Vitamin A palmitat.

A.2. Phân tích chất chuẩn vitamin A (vitamin A dạng este, tinh khiết hoặc hòa tan trong dầu) [5]

Cân từ 25 mg đến 100 mg vitamin A dạng este, chính xác đến 0,1%, cho vào bình. Hòa tan khối lượng cân được trong 5 ml pentan và pha loãng bằng 2 – proponal để thu được nồng độ từ 10 IU/ml đến 15 IU/ml, phụ thuộc vào số lượng cân.

Kiểm tra xem độ hấp thụ tối đa, A_m, của dung dịch đã nằm trong khoảng từ 325 nm, đến 327 nm hay chưa, dùng 2-propanol để làm chất lỏng để làm dung dịch mẫu trắng. Đo độ hấp thụ, A_n, ở bước sóng 300 nm, 326 nm, 470 nm.

Tính tỷ lệ A_n/A_n đối với từng bước sóng nói trên. Nếu tỷ lệ này không vượt quá các giá trị 0,593 ở bước sóng 300 nm, 0,537 ở bước sóng 350 nm, hoặc 0,142 ở bước sóng 370 nm tương ứng, thì tính hàm lượng vitamin A, w, theo đơn vị quốc tế trên gam, bằng công thức:

w = 

Trong đó:

A_m là giá trị số học của độ hấp thụ cực đại thu được ở bước sóng 326 nm;

V là tổng thể tích vitamin A dạng este đã pha loãng có nồng độ từ 10 IU/ml đến 15 IU/ml;

d là hệ số chuyển đổi từ độ hấp thụ cụ thể của Vitamin A dạng este thành đơn vị quốc tế trên gam (d = 1 900);

m là khối lượng của vitamin A dạng este cân được, tính bằng gam.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 6400 : 1998 (ISO 707) Sữa và sản phẩm sữa – Lấy mẫu.

[2] TCVN 6910 – 1: 2001 (ISO 5725-1:1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo. Phần 1 – Nguyên tắc và định nghĩa chung.

[3] TCVN 6910 – 2: 2001 (ISO 5725-2:1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo. Phần 2 – Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.

[4] DE VRIES, E.J.et al., Bulletin of IDF, No.285, pp. 53-64.

[5] European Pharmacopoeia, Monograph vitamin A.