TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 7139:2002 (ISO 13722 : 1996) THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT – ĐỊNH LƯỢNG BROCHOTHRIX THERMOSPHACTA – KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC DO BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BAN HÀNH

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 7139:2002

THỊT VÀ SẢN PHẨM THỊT – ĐỊNH LƯỢNG BROCHOTHRIX THERMOSPHACTA – KỸ THUẬT ĐẾM KHUẨN LẠC
Meat and meat products – Enumeration of Brochothrix thermosphacta – Colony-count technique

Lời nói đầu

TCVN 7139 : 2002 hoàn toàn tương đương với ISO 13722 : 1996;

TCVN 7139 : 2002 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F8 Thịt và sản phẩm thịt biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ ban hành.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng Brochothrix thermosphacta có trong tất cả các loại thịt và sản phẩm thịt kể cả thịt gia cầm, bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc.

2. Tiêu chuẩn viện dẫn

TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218) Vi sinh vật trong thực phẩm và trong thức ăn gia súc – Nguyên tắc chung về kiểm tra vi sinh vật.

TCVN 6507 : 1999 (ISO 6887 : 1983) Vi sinh vật học – Hướng dẫn chung về chuẩn bị các dung dịch pha loãng để kiểm tra vi sinh vật.

TCVN 4833-2 : 2002 (ISO 3100-2 : 1988) Thịt và sản phẩm thịt – Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử -Phần 2 : Chuẩn bị mẫu thử để kiểm tra vi sinh vật

3. Định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này áp dụng định nghĩa sau

3.1. Brochothrix thermosphacta: Vi khuẩn gram dương tạo thành các khuẩn lạc oxidaza âm tính đặc trưng trên môi trường đặc chọn lọc [thạch streptomixin sunfat/tali axetat/actidion (STAA)] trong các điều kiện thử quy định của tiêu chuẩn này.

4. Nguyên tắc

4.1. Cấy một lượng mẫu thử quy định nếu sản phẩm dạng lỏng hoặc một lượng huyền phù ban đầu nếu sản phẩm dạng khác lên bề mặt môi trường nuôi cấy đặc chọn lọc đựng trong các đĩa Petri.

Dưới các điều kiện tương tự, chuẩn bị các đĩa khác sử dụng các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu

4.2. Ủ các đĩa ở nhiệt độ từ 22⁰C đến 25⁰C trong khoảng 48h ± 4h

4.3. Lấy các khuẩn lạc để thử khẳng định

4.4. Từ số khuẩn lạc đã được thử khẳng định, tính lượng Brochothrix thermosphacta có trong một mililit, hoặc trong một gam mẫu từ số khuẩn lạc thu được trên các đĩa ở các mức pha loãng được chọn sao cho kết quả tin cậy nhất (xem 9.3)

5. Dịch pha loãng, môi trường nuôi cấy và thuốc thử

5.1. Khái quát

Về thực hành phòng thử nghiệm hiện hành, xem TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218)

5.2. Dịch pha loãng

Xem TCVN 6507 : 1999 (ISO 6887)

5.3. Môi trường đặc chọn lọc : Thạch streptomixin sunfat/tali axetat/actidion (STAA) (xem tài liệu tham khảo [2]).

5.3.1. Môi trường cơ sở

5.3.1.1. Thành phần

5.3.1.2. Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trên hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước bằng cách đun sôi. Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ở 25⁰C.

Khử trùng môi trường trong nồi hấp áp lực (6.1) 15 phút để ở 121⁰C

5.3.2. Dung dịch streptomixin sunfat

5.3.2.1. Thành phần

5.3.2.2. Chuẩn bị

Hòa tan streptomixin sunfat trong nước. Lọc để khử trùng.

5.3.3. Dung dịch actidion

Cảnh báo – Actidion và tali axetat là các chất độc. Khi làm việc với các hóa chất và các dung dịch của chúng phải thực hiện các qui trình thích hợp để tránh bị nhiễm sang người thực hiện và môi trường.

5.3.3.1. Thành phần

5.3.3.2. Chuẩn bị

Hòa tan actidion trong nước. Lọc để khử trùng.

5.3.4. Dung dịch tali axetat

5.3.4.1. Thành phần

5.3.4.2. Chuẩn bị

Hoà tan tali axetat trong nước. Lọc để khử trùng.

5.3.5. Môi trường hoàn chỉnh

5.3.5.1. Thành phần

5.3.5.2. Chuẩn bị

Làm tan chảy môi trường cơ sở và làm nguội trên nồi cách thủy (6.9) ở nhiệt độ 47⁰C. Dưới các điều kiện vô trùng, làm ấm các phần dung dịch khác (5.3.2, 5.3.3 và 5.3.4) đến 47⁰C trong nồi cách thủy. Cho các lượng thể tích qui định (5.3.5.1) của các dung dịch vào môi trường cơ sở đã nguội, lắc đều giữa các lần thêm.

5.3.6. Chuẩn bị các đĩa thạch để đếm

Rót từ 15 ml đến 20 ml môi trường hoàn chỉnh (5.3.5) vào các đĩa Petri vô trùng (6.4). Để yên cho đặc lại.

Các đĩa này có thể được bảo quản trước khi được làm khô 1 tuần ở nhiệt độ từ 0⁰C đến 5⁰C.

Ngay trước khi sử dụng, làm khô các đĩa thạch, tốt nhất là mở nắp ra và lật ngược đĩa thạch xuống dưới, đặt vào tủ (6.2) để ở nhiệt độ từ 37⁰C đến 50⁰C, cho đến khi các giọt nước đã biến khỏi mặt của môi trường. Sau đó không làm khô thêm nữa. Các đĩa thạch cũng có thể được làm khô trong tủ sấy 30 phút với đĩa được mở một nửa nắp hoặc để qua đêm với nắp đĩa vẫn đậy nguyên.

Các đĩa thạch đã được chuẩn bị có bán sẵn. Bảo quản và sử dụng các đĩa này theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

5.4. Thuốc thử oxidaza

5.4.1. Thành phần

5.4.2. Chuẩn bị

Hòa tan thuốc thử trong nước lạnh. Thuốc thử phải được chuẩn bị ngay trước khi sử dụng.

Có thể sử dụng các đĩa hoặc các que cấy bán sẵn. Khi đó sử dụng theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

6. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm vi sinh thông thường và đặc biệt là các dụng cụ sau:

6.1. Thiết bị khử trùng khô (tủ sấy) hoặc thiết bị khử trùng ướt (nối hấp áp lực).

Xem TCVN 6404 : 1998 (ISO 7218)

6.2. Tủ ấm hoặc tủ sấy, thông gió đối lưu, có thể duy trì được nhiệt độ từ 37⁰C ± 1⁰C đến 50⁰C ± 1⁰C

6.3. Tủ ấm, có khả năng hoạt động ở nhiệt độ từ 22⁰C± 1⁰C đến 25⁰C ± 1⁰C.

6.4. Đĩa Petri, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo, đường kính từ 90 mm đến 100 mm

6.5. Pipet chia độ xả hết (blow-out), có miệng xả rộng, dung tích danh định 10 ml và 1 ml, được chia vạch 0,1 ml

6.6. Bầu cao su, hoặc loại thiết bị khác thích hợp để sử dụng với pipet chia độ.

6.7. Chai hoặc bình cấy có dung tích thích hợp

6.8. Que gạt, bằng thủy tinh, dài 20 cm và có đường kính khoảng 3,5 mm và chiều dài 20 cm, một đầu được uốn cong tạo các gấp dài khoảng 3 cm và đầu mút được làm nhẵn bằng nhiệt.

Các que gạt mẫu bằng nhựa vô trùng sử dụng một lần cũng có thể được sử dụng

6.9. Nồi cách thủy, có khả năng duy trì ở 47⁰C ± 2⁰C.

6.10. Thiết bị đếm khuẩn lạc, có nền đen được chiếu sáng và có máy đếm điện tử số hoặc cơ học.

6.11. pH- met, có độ chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH ở 25⁰C

6.12. Que cấy vòng bằng platin, hoặc đũa thủy tinh hoặc chất dẻo đường kính khoảng 3 mm.

7. Lấy mẫu

Điều quan trọng là phòng thử nghiệm phải nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc giảm chất lượng trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này. Nên lấy mẫu theo qui định trong TCVN 4833-1 : 2002 (ISO 3100- 1).

8. Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử đại diện theo TCVN 4833-2 : 2002 (ISO 3100 – 2). Kiểm tra mẫu đã được xử lý trước càng sớm càng tốt. Nếu cần, có thể bảo quản mẫu ở nhiệt độ từ 0⁰C đến + 2⁰C, nhưng không quá 24h.

9. Cách tiến hành

9.1. Phần mẫu thử, huyền phù ban dầu và các dung dịch pha loãng

Xem TCVN 4833-2 : 2002 (ISO 3100 – 2) và TCVN 6507 : 1999 (ISO 6887 : 1983).

9.2. Cấy và ủ

9.2.1. Dùng pipet vô trùng (6.5) chuyển sang hai đĩa thạch (5.3.6), mỗi đĩa 0,1 ml mẫu thử nếu sản phẩm dạng lỏng hoặc huyền phù ban đầu nếu sản phẩm ở dạng khác. Lặp lại qui trình này với các độ pha loãng thập phân tiếp theo.

9.2.2. Dùng que gạt mẫu (6.8) để dàn đều chất lỏng trên bề mặt đĩa thạch càng nhanh càng tốt mà không chạm que gạt mẫu vào cạnh của đĩa. Đối với mỗi đĩa sử dụng một que gạt mẫu mới. Để các đĩa được đậy nắp trong khoảng 15 min ở nhiệt độ môi trường bình thường để chất lỏng hút bám vào thạch.

9.2.3. Lật ngược các đĩa đã chuẩn bị (9.2.2) và ủ trong tủ ấm (6.3) trong vòng 48h ± 4h ở nhiệt độ từ 22⁰C đến 25⁰C.

9.3. Đếm khuẩn lạc

Sau khi kết thúc thời gian ủ qui định (9.2.3), đếm các khuẩn lạc đặc trưng trên các đĩa và giữ lại các đĩa chứa từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc, bằng dụng cụ đếm khuẩn lạc (6.10). Các khuẩn lạc đặc trưng bóng, tròn hoặc các khuẩn lạc mọc vòng tròn có đường kính 0,75 mm hoặc lớn hơn, có màu trắng nhạt và chúng âm tính oxidaza (9.4).

9.4. Thử khẳng định

Pseudomonas có thể mọc trên thạch STAA (5.3). Chúng khác với B. Thermosphacta bởi phép thử oxidaza như sau:

Làm ẩm mảnh giấy lọc bằng thuốc thử oxidaza (5.4). Dùng que cấy vòng platin hoặc đũa thủy tinh hoặc đũa bằng chất dẻo (6.12) (que cấy vòng bằng niken/crom cho kết quả dương sai) lấy mẫu các chất cấy vi khuẩn thu được từ đĩa thạch TSAA và đặt lên giấy lọc đã được làm ẩm. Các khuẩn lạc oxidaza dương tính xuất hiện màu đỏ trong vòng 15s. Brochothrix thermosphacta là các khuẩn lạc oxidaza âm tính.

10. Biểu thị kết quả

10.1. Số đếm brochothrix thermosphacta

10.1.1. Nếu ít nhất là 80% các khuẩn lạc được chọn đã được thử khẳng định (9.4) thì số lượng Brochothrix thermosphacta là số đếm được trong 9.3

10.1.2. Trong các trường hợp khác, tính số lượng Brochothrix thermosphacta từ phần trăm Brochothrix thermosphacta thu được trong 9.3 đã được thử khẳng định (9.4)

Lấy kết quả đến tròn số.

10.2. Phương pháp tính

10.2.1. Trường hợp chung : Các đĩa chứa từ 15 khuẩn lạc đến 300 khuẩn lạc đặc trưng

Giữ lại các đĩa chứa không quá 300 khuẩn lạc đặc trưng ở hai độ pha loãng liên tiếp. Cần sử dụng một trong các đĩa này chứa ít hơn 15 khuẩn lạc đặc trưng

Tính số lượng Brochothrix thermosphacta trong một gam hoặc một mililit sản phẩm, N, tùy từng trường hợp, theo công thức sau:

Trong đó

Σa: là tổng các khuẩn lạc đặc trưng đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại ở hai độ pha loãng liên tiếp, có ít nhất một đĩa chứa 15 khuẩn lạc;

V là thể tích mẫu cấy được sử dụng trên mỗi đĩa

n₁ là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng đầu tiên;

n₂ là số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai;

d là hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất.

Làm tròn các kết quả tính được đến hai chữ số có nghĩa. Như vậy, nếu chữ số sau cùng nhỏ hơn thì số đứng trước số đó không bị thay đổi, còn nếu chữ số sau cùng là 5 hoặc lớn hơn 5 thì tăng số đứng trước lên một đơn vị. Làm tròn tiếp theo cho đến khi thu được hai chữ số có nghĩa.

Lấy kết quả là số lượng Brochothrix thermosphacta trong một mililit (sản phẩm dạng lỏng) hoặc trong một gam (sản phẩm dạng khác), được biểu thị bằng số từ 1,0 đến 9,9 nhân với lũy thừa tương ứng của 10.

THÍ DỤ

Số đếm Brochothrix thermosphacta ở nhiệt độ từ 22⁰C đến 25⁰C cho các kết quả sau:

– Ở độ pha loãng thứ nhất giữ lại: 83 khuẩn lạc và 97 khuẩn lạc đặc trưng;

– Ở độ pha loãng thứ hai giữ lại: 13 khuẩn lạc và 8 khuẩn lạc đặc trưng;

Làm tròn kết quả như qui định trên ta có 9 100 hoặc 9,1 x 10³ Brochothrix thermosphacta trong một mililit hoặc một gam sản phẩm.

10.2.2. Ước tính các số lượng nhỏ khuẩn lạc

Nếu có hai đĩa của mẫu thử gốc (sản phẩm dạng lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (sản phẩm ở dạng khác) chứa từ 0 đến 15 khuẩn lạc, thì báo cáo kết quả như sau:

Biểu thị kết quả như sau:

– Ít hơn 15 Brochothrix thermosphacta trong một mililit (sản phẩm dạng lỏng), hoặc

– Ít hơn 15 x 1/d Brochothrix thermosphacta trong một gam (sản phẩm dạng khác).

Trong đó d là hệ số pha loãng của huyền phù ban đầu.

Nếu trên hai đĩa mẫu thử gốc (sản phẩm dạng lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (sản phẩm dạng khác) không có bất kỳ một khuẩn lạc đặc trưng nào thì biểu thị kết quả như sau:

– Ít hơn 1 Brochothrix thermosphacta trong một mililit (sản phẩm dạng lỏng)

– Ít hơn 1/d Brochothrix thermosphacta trong một gam (sản phẩm dạng khác).

Trong đó d là hệ số pha loãng của huyền phù ban đầu.

11. Độ chụm

Khoảng tin cậy của phương pháp này dao động từ -7% đến 8% đối với 300 khuẩn lạc và từ -29% đến 41% đối với 15 khuẩn lạc.

12. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải chỉ rõ phương pháp đã sử dụng và kết quả thử nghiệm thu được.

Cũng phải đề cập đến tất cả các chi tiết thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, cùng với các chi tiết bất thường khác có thể ảnh hưởng tới kết quả.

Báo cáo thử nghiệm cũng phải gồm mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử.

PHỤ LỤC A

(tham khảo)

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 4833-1 : 2002 (ISO 3100-1 : 1991) Thịt và sản phẩm – Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu thử – Phần 1 : Lấy mẫu.

[2] GARDNER, G.A., J. Appl. Bact., 29 (3), 1996, pp. 455-460