TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 8345:2010 VỀ THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN – XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG SULFONAMIT – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 8345 : 2010

THUỶ SẢN VÀ SẢN PHẨM THUỶ SẢN ( XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG SULFONAMIT ( PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Fish and fishery products – Determination of sulfonamide residues – Method using high-performance liquid chromatography

Lời nói đầu

TCVN 8345 : 2010 do Cục Chế biến, Thương mại nông lâm thuỷ sản và nghề muối biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng nhóm chất sulfonamit (gồm sulfadiazin, sulfathiazol, sulfamerazin, sulfamethazin, sufamethoxypiridazin, sulfacloropyridazin, sulfadoxin, sulfamethoxazol, sulfadimethoxin và sulfachinoxalin) trong thuỷ sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Giới hạn phát hiện của phương pháp: nhỏ hơn 5 mg/kg.

2. Nguyên tắc

Các chất nhóm sulfonamit có trong mẫu sản phẩm thủy sản được chiết tách bằng hỗn hợp axetonitril và diclometan. Dịch chiết sau khi cô cạn cho tác dụng với dung dịch fluorescamin để tạo dẫn xuất huỳnh quang. Hàm lượng các dẫn xuất được xác định trên hệ thống HPLC với detector huỳnh quang theo phương pháp ngoại chuẩn.

3. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích, trừ khi có quy định khác, và sử dụng nước cất loại dùng cho HPLC hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.

3.1 Axetonitril (CH₃CN), loại dùng cho HPLC.

3.2 Diclometan (CH₂Cl₂), loại dùng cho HPLC.

3.3 Dinatri hydro phosphat (Na₂HPO₄).

3.4 Dung dịch axetonitril/H₃PO₄, pH = 6,0

Cho 80 ml axetonitril (3.1) và 20 ml H₃PO₄ 0,02 M (3.4.1) vào cốc 250 ml. Dung dịch này được để nguội tới nhiệt độ phòng. Dùng dung dịch natri hydroxit 1 M hoặc dung dịch natri hydroxit 0,1 M để chỉnh pH = 6,0 ± 0,1.

3.5 Dung dịch đệm xitrat 0,5 M, pH = 3,0

Hòa tan 10,5 g axit xitric với 100 ml nước, chỉnh pH = 3,0 ± 0,1 bằng dung dịch natri hydroxit 10 M, dung dịch natri hydroxit 1 M và dung dịch natri hydroxit 0,1 M.

3.6 Dung dịch đệm cho sự tạo dẫn xuất

Trộn theo thể tích gồm 6 phần axetonitril/H₃PO₄ (3.4) với 4 phần dung dịch đệm xitrat 0,5 M (3.5).

3.7 Dung dịch fluorescamin, 10 mg/ml

Hòa tan 50 mg tác nhân tạo dẫn xuất fluorescamin (Fluram) trong 5 ml axeton (loại dùng cho HPLC).

3.8 Các chất thuộc nhóm sulfanilamit

3.8.1 Dung dịch chuẩn nội sulfanilamit, 1 mg/ml

Hòa tan 10 mg chuẩn nội sulfanilamit trong 10 ml metanol (loại dùng cho HPLC).

3.8.2 Dung dịch chuẩn nội sulfanilamit, 50 mg/ml

Hút 1 ml sulfanilamit 1 mg/ml (3.8.1) vào bình định mức 20 ml (4.4) rồi định mức tới vạch bằng metanol.

3.8.3 Dung dịch chuẩn nội sulfanilamit, 5 mg/ml

Pha loãng 1 ml sulfanilamit 50 mg/ml (3.8.2) với nước để có 10 ml.

3.9 Các dung dịch chuẩn

3.9.1 Dung dịch chuẩn gốc các sulfonamit, 100 mg/ml

Cân lần lượt 10,0 mg từng loại các chất chuẩn nhóm sulfonamit. Sau đó, hòa tan rồi định mức đến vạch 100 ml bằng metanol.

3.9.2 Dung dịch chuẩn các sulfonamit trung gian, 1 000 ng/ml

Hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc các sulfonamit 100 mg/ml (3.9.1) vào các bình định mức 100 ml. Sau đó, định mức đến vạch bằng metanol.

3.9.3 Các dung dịch chuẩn sulfonamit để dựng các đường chuẩn, 0,0; 1,0; 2,0; 4,0; 6,0; 8,0 và 10,0 ng/ml (3.9.2).

Hút lần lượt 0; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 và 5,0 ng/ml dung dịch các sulfonamit 1 000 ng/ml (3.9.2) vào bình định mức 500 ml. Sau đó, định mức tới vạch bằng metanol.

3.10 Pha động

3.10.1 Dung dịch H₃PO₄, 0,02 M

Hòa tan 2,3 g axit phosphoric (H₃PO₄) 85 % (loại dùng cho HPLC) với nước rồi định mức thành 1 000 ml.

3.10.2 Hỗn hợp dung dịch metanol và axetonitril, tỷ lệ1:1

Hòa tan 500 ml metanol trong 500 ml axetonitril (3.1).

4. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

4.1 Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.

4.2 Pipet Pasteur, với quả bóp cao su.

4.3 Pipet định mức, 5 và 10 ml.

4.4 Bình định mức, dung tích 10; 20; 25; 100; 500 và 1 000 ml.

4.5 Cốc có mỏ, dung tích 250 ml.

4.6 Ống ly tâm thủy tinh, dung tích 15; 25 và 50 ml.

4.7 Giấy lọc, 0,45 mm.

4.8 Bể điều nhiệt, có thể duy trì nhiệt độ 20 ⁰C đến 100 ⁰C (GRANT Y14 hoặc loại tương đương).

4.9 Máy lắc, tốc độ 50 r/min đến 500 r/min (IKA^Ò KS 260 basic hoặc loại tương đương).

4.10 Máy ly tâm, tốc độ 5 000 r/min (Sigma 4K15 hoặc loại tương đương).

4.11 Máy rung trộn mẫu (HWASHIN technology Co. 250VM hoặc loại tương đương).

4.12 Bình khí nitơ, trong đó nitơ có độ tinh khiết 99,999 %.

4.13 Máy nghiền, tốc độ 6 000 r/min – 30 000 r/min (KCH-1000 hoặc loại tương đương).

4.14 Hệ thống HPLC, được trang bị detector huỳnh quang.

4.15 Cột sắc ký pha đảo C18, dài 250 mm, đường kính trong 3 mm (100-5 C18 AB, loại Nucleosil hoặc tương đương).

5. Cách tiến hành

5.1 Chuẩn bị mẫu thử

5.1.1 Nghiền ít nhất 200 g mẫu bằng máy nghiền (4.13). Cân 5,0 g mẫu đã được nghiền, w, chính xác đến 0,1 mg, cho vào ống ly tâm thủy tinh 25 ml (4.6).

5.1.2 Thêm 10 ml axetonitril (3.1) và 2,5 ml diclometan (3.2) vào ống ly tâm thủy tinh 25 ml có chứa 5,0 g mẫu thử (xem 5.1.1). Sau đó, lắc ống trong 10 min trên máy lắc (4.9). Tiếp theo ly tâm trong 10 min ở tốc độ 6 000 r/min.

5.1.3 Dùng pipet Pasteur (4.2) hút lớp trên vào bình định mức 25 ml (4.4). Thực hiện lại bước chiết theo 5.1.2 rồi gom tất cả phần dịch chiết vào bình định mức 25 ml (4.4), thêm axetonitril (3.1) đến vạch.

5.1.4 Hút chính xác 10 ml dịch chiết (xem 5.1.3) cho vào ống nghiệm thủy tinh 15 ml (4.6) để bay hơi tới cặn khô bằng dòng khí nitơ (4.12) ở nhiệt độ 50 ⁰C trên bể điều nhiệt (4.8).

5.2 Chuẩn bị mẫu trắng

Mẫu trắng là mẫu sản phẩm thủy sản đã được xác định không có các chất nhóm sulfonamit. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng như chuẩn bị đối với mẫu thử theo 5.1.

5.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi 100 ng/g

Thêm chính xác 500 ml dung dịch các chuẩn sulfonamit trung gian 1 000 ng/ml (3.9.2) vào 5 g mẫu trắng. Tiến hành chuẩn bị mẫu xác định độ thu hồi 100 ng/g như chuẩn bị đối với mẫu thử theo 5.1.

5.4 Chuẩn bị dung dịch dựng đường chuẩn

Hút chính xác 10 ml lần lượt các dung dịch chuẩn sulfonamit để dựng các đường chuẩn (3.9.3) vào ống nghiệm thủy tinh 15 ml (4.6). Sau đó, cho dung dịch bay hơi tới cặn khô dưới dòng khí nitơ (4.12) ở nhiệt độ 50 ⁰C trên bể điều nhiệt (4.8). Tiếp tục thực hiện bước tạo dẫn xuất huỳnh quang theo 5.5.

5.5 Tạo dẫn xuất huỳnh quang

Thêm vào các ống nghiệm chứa mẫu đã chuẩn bị tại 5.1.4, 5.2 và 5.3 các dung dịch gồm: 1 ml dung dịch đệm tạo dẫn xuất (3.6), 20 ml dung dịch chuẩn nội sulfanilamit 5 mg/ml (3.8.3) và 0,2 ml dung dịch fluorescamin 10 mg/ml (3.7). Sau đó, để cho phản ứng khoảng 30 min đến 50 min ở nhiệt độ phòng, rồi lọc qua giấy lọc 0,45 mm (4.7). Lấy 10 ml dung dịch này tiêm vào hệ thống HPLC.

5.6 Tiến hành phân tích trên HPLC

5.6.1 Điều kiện phân tích

– cột sắc ký:                             cột sắc ký pha đảo C18 (4.15);

– chương trình pha động:           theo qui định trong Bảng 1;

Bảng 1 – Chương trình pha động

– tốc độ dòng:               0,6 ml/min;

– thể tích tiêm:              10 ml;

– bước sóng kích thích:             l = 405 nm;

– bước sóng phát xạ:     l = 495 nm.

5.6.2 Ổn định cột sắc ký trong 30 min tại chế độ làm việc.

5.6.3 Tiêm các dung dịch chuẩn đã được tạo dẫn xuất huỳnh quang (5.5). Dựng đường chuẩn giữa tỷ số diện tích pic các chuẩn sulfonamit/diện tích pic chuẩn nội sulfanilamit và nồng độ theo quan hệ tuyến tính.

5.6.4 Tiêm các dịch mẫu trắng (5.2), dịch mẫu xác định độ thu hồi (5.3) và dịch mẫu thử (5.1.4) đã tạo dẫn xuất huỳnh quang (5.5) vào hệ thống HPLC, mỗi mẫu 2 lần. Xác định tỉ số diện tích pic sulfonamit/sulfanilamit.

6. Tính kết quả

Hàm lượng sulfonamit trong mẫu thử, M, được tính bằng microgam trên kilogam (mg/kg) theo công thức sau:

trong đó

C               là nồng độ của từng chất thuộc nhóm sulfonamit thu được (5.6.4), tính bằng nanogam trên mililit (ng/ml);

V               là thể tích cuối cùng của dung dịch mẫu thử (5.5), tính bằng mililit (ml);

w               là khối lượng mẫu thử (5,0 g).

7. Độ lặp lại

Độ lệch chuẩn lặp lại, CV_s, tính theo diện tích pic sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %.

8. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

a) mọi thông tin cần thiết về việc nhận biết đầy đủ mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng và viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) mọi thao tác không được quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc những điều được coi là tự chọn và bất kỳ chi tiết nào có ảnh hưởng tới kết quả;

e) kết quả thử nghiệm thu được.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Determination of Sulfonamide Residues, Jean-Marc Diserens and Marie-Claude Savoy-Perroud, Quality and Safety Assurance Department, Nestle’ Research Center