TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 8400-17:2011 VỀ BỆNH ĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 17: BỆNH DO VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS GÂY RA Ở GÀ

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 8400-17:2011

BỆNH ĐỘNG VẬT – QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN – PHẦN 17: BỆNH DO VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS GÂY RA Ở GÀ

Animal disease – Diagnostic procedure – Part 17: Staphylococcus aureus infection in chicken

CẢNH BÁO – Việc áp dụng tiêu chuẩn này có thể liên quan đến các vật liệu, thiết bị và các thao tác gây nguy hiểm. Tiêu chuẩn này không thể đưa ra được hết tất cả các vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng. Người sử dụng tiêu chuẩn này phải tự thiết lập các thao tác an toàn thích hợp và xác định khả năng áp dụng các giới hạn quy định trước khi sử dụng tiêu chuẩn.

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh do vi khuẩn Staphylococcus aureus (S. aureus) gây ra trên gà và gà tây.

2. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau: Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus)

Vi khuẩn gram dương, hình tròn, đứng thành đám như chùm nho, sinh khuẩn lạc dạng S, tròn, đường kính khoảng từ 1 mm đến 3 mm sau khi nuôi cấy ở 37 oC trong vòng 18 h đến 24 h.

CHÚ THÍCH: Phần lớn các chủng S. aureus gây dung huyết β trên thạch máu.

3. Thuốc thử và vật liệu thử

Trong tiêu chuẩn này chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương.

Xem Phụ lục A và Phụ lục B về mô tả các dung dịch thuốc thử.

– Thạch Chapman

– Thạch Baid-Parker

– Thạch máu

– Canh thang BHI

– Môi trường đường mannitol

– Huyết tương thỏ

Chuẩn bị huyết tương thỏ: Máu thỏ khoẻ mạnh được lấy vô trùng, có chất chống đông máu (natri xitrat 5 % hay EDTA vô trùng) sau đó ly tâm trong khoảng từ 3000 r/min đến 5000 r/min trong từ 10 min đến 15 min, lấy phần huyết tương ở phía trên.

– Thạch urê

– Canh thang pepton

– Etanol (C2H6O)

4. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

– Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ 37 oC

– Tủ sấy

– Buồng cấy

– Kính hiển vi quang học

– Tủ lạnh

– Que cấy

– Đèn cồn

– Đĩa Petri để đổ môi trường

– Panh

– Kéo

– Lamen (coverlip)

– Phiến kính (slide)

– Pipet thủy tinh các cỡ

– Lọ thủy tinh các cỡ: 100 ml, 200 ml, 500 ml và 1000 ml

5. Cách tiến hành

5.1 Chẩn đoán lâm sàng

5.1.1 Triệu chứng lâm sàng

– Con vật bị sốt, xù lông, xã cánh, què 1 chân hoặc 2 chân.

– Các khớp xương ở chân bị sưng.

– Chết đột ngột trong trường hợp nhiễm trùng máu cấp tính.

– Ở gà con: Vùng rốn bị ướt.

5.1.2 Bệnh tích

– Bệnh tích chủ yếu của bệnh là viêm cơ xương, viêm khớp, viêm bao khớp, viêm bao hoạt dịch, viêm đệm chân. Các xương thường bị là khuỷu chân và xương đùi, ít gặp hơn là hai đầu xương đùi, đầu xương ống chân, đầu xương cánh, xương sườn hay xương cột sống.

– Viêm tủy xương, tủy xương có màu vàng của casein hay mủ, xương mỏng.

– Trong trường hợp nhiễm trùng máu: Các cơ quan nội tạng bao gồm gan, lách, thận và phổi bị hoại tử và sung huyết.

– Các vùng da quanh khớp bị viêm hoại tử.

– Ở gà con: Túi lòng đỏ bị sưng có màu khác thường.

5.1.3 Lấy mẫu bệnh phẩm

Mẫu khớp: Lấy toàn bộ khớp xương.

Dịch khớp: Cắt bộc lộ khớp xương bằng dụng cụ vô trùng. Dùng bơm, kim tiêm, pipet hoặc tăm bông vô trùng lấy dịch ở trong khớp xương.

Mủ ở đệm chân: Sát trùng bên ngoài và dùng tăm bông vô trùng để lấy mủ ở đệm chân. Túi lòng đỏ: Lấy túi lòng đỏ cho vào lọ vô trùng.

Các mẫu phủ tạng (gan, lách, thận, phổi) mỗi loại lấy từ 10 g đến 200 g và đựng trong lọ miệng rộng hoặc túi nilon riêng mỗi loại.

Bệnh phẩm phải được bảo quản trong điều kiện lạnh từ 2oC đến 8oC và gửi về phòng xét nghiệm chậm nhất 24 h sau khi lấy mẫu và kèm theo giấy yêu cầu xét nghiệm có ghi rõ triệu chứng, bệnh tích.

CHÚ THÍCH: Tăm bông sau khi lấy mẫu cần được cho vào dung dịch bảo quan (canh thang pepton). Các dụng cụ lấy mẫu như dao, kéo, panh kẹp phải được sát trùng bằng cồn 70 % trước và sau khi lấy mẫu.

5.2 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

5.2.1 Nuôi cấy, phân lập

Mẫu bệnh phẩm được cấy lên môi trường thạch máu, canh thang BHI, môi trường chọn lọc như thạch Chapman hay môi trường thạch Baid-Parker.

Hình thái khuẩn lạc trên các môi trường phân lập sau 18 h đến 24 h nuôi cấy như sau:

– Trên thạch máu: S. aureus có khuẩn lạc hình tròn, trơn, kích thước khoảng từ 1 mm đến 3 mm, màu vàng đục hay trắng đục, phần lớn gây dung huyết.

– Trên thạch Chapman: Khuẩn lạc S. aureus hình tròn, trơn, màu vàng hoặc trắng.

– Trên thạch Baid-Parker: Khuẩn lạc S. aureus màu đen, có quầng sáng ở xung quanh.

Chọn khuẩn lạc có hình thái đặc trưng cấy vào môi trường thạch thường hoặc thạch máu hay canh thang BHI ủ ở 37oC trong vòng từ 18 h đến 24 h để tiến hành kiểm tra hình thái vi khuẩn, các đặc tính sinh hoá.

5.2.2 Giám định vi khuẩn

5.2.2.1 Kiểm tra hình thái vi khuẩn

Làm tiêu bản: Nhỏ một giọt nước sinh lý lên phiến kính sạch. Lấy khuẩn lạc trên đĩa thạch hoà đều vào giọt nước sinh lý. Nếu làm tiêu bản từ canh trùng thì lấy 1 vòng que cấy canh trùng đã nuôi cấy vi khuẩn dàn mỏng trên phiến kính.Tiêu bản được để khô, cố định trên ngọn lửa đèn cồn và nhuộm Gram (Phụ lục A).

Vi khuẩn S. aureus bắt màu tím (Gram dương), hình tròn, tập trung thành từng đám như chùm nho.

5.2.2.2 Giám định các đặc tính sinh hóa

Giám định các tính chất sinh hóa theo Bảng 1 sau đây:

Bảng 1 – Một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn S. aureus

Phương pháp tiến hành: theo quy định trong Phụ lục B.

6. Kết luận

Gà bị bệnh do vi khuẩn S. aureus khi có các đặc điểm sau:

– Gà có biểu hiện triệu chứng và bệnh tích của bệnh;

– Kết quả nuôi cấy, phân lập, giám định xác định là vi khuẩn S. aureus.

PHỤ LỤC A

(Quy định)

PHƯƠNG PHÁP NHUỘM GRAM

A.1 Thuốc thử

A.1.1 Dung dịch tím tinh thể

Tím tinh thể (C25H30N3Cl) 2,0 g

Etanol 95 %  20,0 ml

Amoni oxalat [(NH4)2C2O4.2H2O] 0,8 g

Nước  80,0 ml

Hoà tan tím tinh thể trong etanol và hòa tan amoni oxalat trong nước. Sau đó, trộn 2 dung dịch này với nhau và lắc cho tan hết.

A.1.2 Dung dịch fuscin basic

Fuchsin basic (C20H20ClN3) 1 g

Etanol 95 %  10 ml

Phenol (C6H6O) 5 g

Nước  100 ml

Khi dùng, pha loãng dung dịch gốc theo tỉ lệ 1/10 (phần thể tích) với nước.

A.1.3 Dung dịch lugol

Kali iodua (KI) 2 g

Iôt (I2) tinh thể 1 g

Nước  200 ml

Nghiền kali iodua và iôt tinh thể, cho nước vào từ từ và lắc cho tan.

A.1.4 Cồn axeton

Etanol 95 %  3 phần

Axeton (C2H6O) 1 phần

A.2 Cách tiến hành

Nhỏ dung dịch tím lên tiêu bản, để từ 1 min đến 2 min sau đó rửa nước nhanh và để khô. Nhỏ dung dịch lugol, để 1 min sau đó rửa nước nhanh và để khô.

Nhỏ cồn-axeton, rửa nước thật nhanh và để khô.

Nhỏ dung dịch fuchsin loãng, để 1 min sau đó rửa nước rồi thấm khô hoặc sấy khô.

A.3 Xem tiêu bản

Nhỏ 1 giọt dầu vào tiêu bản và xem tiêu bản bằng kính hiển vi quang học bằng với vật kính độ phóng đại 100 lần.

PHỤ LỤC B

(Quy định)

GIÁM ĐỊNH ĐẶC TÍNH SINH HÓA VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS

B.1 Phản ứng catalase

Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch đặt lên một điểm trên phiến kính sạch. Nhỏ một giọt dung dịch H2O23 %. Phản ứng dương tính khi thấy có hiện tượng sủi bọt sau vài giây. Phản ứng âm tính khi không có hiện tượng sủi bọt.

B.2 Phản ứng đông vón huyết tương

Phản ứng đông vón huyết tương trong ống nghiệm: Lấy 0,5 ml huyết tương thỏ cho vào ống nghiệm, cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống và để vào tủ ấm 37 oC. Phản dương tính xuất hiện sau 2 h đến 18 h, huyết tương đông vón hoàn toàn hoặc ở dạng bán cố thể.

Phản ứng đông vón huyết tương trên phiến kính: Lấy một giọt huyết tương thỏ cho lên phiến kính, hoà khuẩn lạc nghi ngờ vào giọt huyết tương. Phản ứng dương tính khi thấy xuất hiện các hạt ngưng kết nổi đều.

CHÚ THÍCH: Phản ứng đông huyết tương trong ống nghiệm có độ chính xác cao hơn vì một số tụ cầu gây bệnh cho kết quả âm tính trên phiến kính, nhưng khi làm phản ứng trong ống nghiệm cho kết quả dương tính.

B.3 Lên men đường mannitol

B.3.1 Chuẩn bị môi trường

Pha canh thang pepton theo chỉ dẫn của nhà sản xuất Chuẩn bị chỉ thị màu

– Chỉ thị màu andrade:

Fuchsin axit (C20H17N3Na2O9S3) 0, 5 g

Nước  100 ml

NaOH 1 N 16 ml

Cách pha: Nghiền fuchsin, hoà vào nước cho tan hết. Cho từ từ dung dịch NaOH 1 N, vừa cho vừa lắc đến khi chuyển màu từ đỏ tươi sang đỏ nâu, đến vàng úa, vàng thẫm thì dừng (thường từ 12 ml đến 17 ml). Để lắng 1 h đến 2 h, lọc qua giấy lọc. Hấp 120oC trong 15 min.

Cho 1 ml chỉ thị màu Andrade vào 100 ml môi trường canh thang peptone, chia ra các ống (mỗi ống 4 ml). Hấp 120oC trong 30 min.

Chuẩn bị đường: Các loại đường pha thành dung dịch 10 % hấp 110 oC trong 15 min đến 20 min hoặc hấp cách quãng 3 lần ở 100oC trong 30 min hoặc lọc qua màng lọc có kích thước lỗ lọc 0,45 µm.

Cho đường vào các ống môi trường: Mỗi ống (4 ml) cho 0,3 ml dung dịch đường 10 %.

B.3.2 Phương pháp kiểm tra và đọc kết quả

Cấy vi khuẩn đã nuôi cấy thuần khiết vào các ống canh thang peptone có đường, để tủ ấm 37oC sau 24 h đọc kết quả.

– Phản ứng âm tính: Môi trường không thay đổi màu.

– Phản ứng dương tính: Môi trường chuyển màu đỏ.