TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 8667:2011 VỀ THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG DIQUAT VÀ PARAQUAT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 8667 : 2011

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG DIQUAT VÀ PARAQUAT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Foodstuffs – Determination of diquat and paraquat residues by high performance liquid chromatography (HPLC)

Lời nói đầu

TCVN 8667:2011 do Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia biên soạn, Bộ Y tế đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG DIQUAT VÀ PARAQUAT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Foodstuffs – Determination of diquat and paraquat residues by high performance liquid chromatography (HPLC)

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định dư lượng diquat và paraquat trong rau và ngũ cốc bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

2. Nguyên tắc

Xử lý mẫu bằng dung dịch axit clohydric, dịch chiết được chỉnh về pH trong khoảng từ 9 đến 10 và được làm sạch trên cột chiết pha rắn silicagel. Dịch rửa giải đem cô quay đến cạn rồi hòa tan cặn bằng dung dịch pha động và phân tích bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao với detector UV tại bước sóng l = 256 nm để xác định paraquat và l = 308 nm để xác định diquat.

3. Thuốc thử và vật liệu thử

Tất cả các thuốc thử được sử dụng phải là loại tinh khiết phân tích. Nước được sử dụng phải là nước cất hai lần hoặc nước cất có chất lượng tương đương. Dung môi sử dụng phải là loại dùng cho phân tích HPLC, trừ khi có quy định khác.

3.1. Chất chuẩn paraquat diclorua, độ tinh khiết lớn hơn 99,0%.

3.2. Chất chuẩn diquat dibromua, độ tinh khiết lớn hơn 99,0%.

3.3. Metanol

3.4. Dietylamin, độ tinh khiết bằng hoặc lớn hơn 98%.

3.5. Natri pentansulfonat, độ tinh khiết bằng hoặc lớn hơn 98%.

3.6. Natri perclorat.

3.7. Kali dihydrophosphat (KH₂PO₄)

3.8. Axit percloric.

3.9. Dung dịch natri hydroxir (NaOH), 1,0 mol/l

Cân 4,0 g natri hydroxit vào cốc có mỏ 100 ml rồi chuyển vào bình định mức 100 ml và thêm nước đến vạch.

3.10. Dung dịch natri hydroxit (NaOH), 6,0 mol/l

Cân 24,0 g natri hydroxit vào cốc có mỏ 250 ml rồi chuyển vào bình định mức 100 ml và thêm nước đến vạch.

3.11. Dung dịch axit clohydric (HCl), 1,0 mol/l

Lấy khoảng 50 ml nước vào bình định mức 100 ml, thêm 8,3 ml dung dịch HCl đậm đặc (nồng độ khoảng 37%) và thêm nước đến vạch.

3.12. Dung dịch axit clohydric (HCl), 2,0 mol/l

Lấy khoảng 50 ml nước vào bình định mức 100 ml, thêm 16,7 ml dung dịch HCl đậm đặc và thêm nước đến vạch.

3.13. Dung dịch axit clohydric (HCl), 5,0 mol/l

Lấy khoảng 50 ml nước vào bình định mức 100 ml, thêm 41,7 ml dung dịch HCl đậm đặc và thêm nước đến vạch.

3.14. Hỗn hợp dung môi metanol/HCl

Lấy 8 ml dung môi metanol (3.3) cho vào bình định mức một vạch 100 ml và thêm dung dịch axit clohydric 5,0 mol/l (3.13) đến vạch. Dung dịch được chuẩn bị trong ngày sử dụng.

3.15. Pha động

Lấy 10,3 ml dietylamin (3.4), 3,0 g natri pentansulfonat (3.5), 12,2 g natri perclorat (3.6), 1,36 g kali dihydrophosphat (3.7) cho vào bình định mức 1 lít và thêm nước đến vạch, chỉnh đến pH 2,0 bằng axit percloric (3.8).

3.16. Dung dịch chuẩn paraquat và diquat

3.16.1. Dung dịch chuẩn gốc paraquat, 100 mm/ml

Hòa tan 13,82 mg paraquat diclorua (3.1) trong nước đựng trong bình định mức 100 ml. Pha loãng bằng nước đến vạch và trộn đều.

Dung dịch đã pha có thể ổn định trong 6 tháng khi được bảo quản ở nhiệt độ từ 2⁰C đến 4⁰C.

3.16.2. Dung dịch chuẩn gốc diquat, 100 mg/ml

Hòa tan 18,70 mg diquat dibromua (3.2) trong nước đựng trong bình định mức 100 ml. Pha loãng bằng nước đến vạch và trộn đều.

Dung dịch đã pha có thể ổn định trong 6 tháng khi được bảo quản ở nhiệt độ từ 2⁰C đến 4⁰C.

3.16.3. Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian, 10 mg/ml

Lấy chính xác 1 ml từng dung dịch chuẩn gốc paraquat 100 mg/ml (3.16.1) và diquat 100 mg/ml (3.16.2) cho vào bình định mức 10 ml và thêm nước đến vạch.

Chuẩn bị dung dịch ngay trước khi sử dụng.

3.16.4. Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc

Dùng pipet tự động lấy chính xác 0,05 ml; 0,1 ml; 0,2 ml; 0,5 ml; 1,0 ml dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian (3.16.3) cho lần lượt vào các bình định mức 10 ml và thêm dung dịch pha động (3.15) đến vạch.

Chuẩn bị dung dịch ngay trước khi sử dụng.

Các dung dịch chuẩn paraquat và diquat sau khi pha xong phải chuyển ngay sang lọ hoặc ống nghiệm bằng chất dẻo.

3.17. Khí nitơ, độ tinh khiết bằng hoặc lớn hơn 99,99%.

4. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và các thiết bị, dụng cụ cụ thể sau:

4.1. Máy nghiền mẫu

4.2. Máy đo pH.

4.3. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,001 g.

4.4. Ống li tâm, dung tích 50 ml.

4.5. Máy li tâm, có thể li tâm ở tốc độ 6 000 r/min.

4.6. Cột chiết pha rắn silicagel, có dung tích 3 ml, khối lượng hạt nhồi 500 mg, cỡ hạt 55 mm.

4.7. Bộ chiếu pha rắn

4.8. Máy lắc vortex.

4.9. Bể ổn nhiệt, có thể duy trì nhiệt độ 100 ⁰C.

4.10. Giấy lọc

4.11. Ống nghiệm, bằng chất dẻo, có nắp đậy, dung tích 6 ml.

4.12. Hệ thống HPLC, bao gồm:

4.12.1. Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao, gồm có bộ phận bơm dung môi pha động có thể chịu được áp suất tối đa 4 000 psi, bộ loại khí, buồng chứa cột tách có thể đặt nhiệt độ, detector UV có thể đo được tại 2 bước sóng l = 256 nm và l = 308 nm, bộ phận ghi tín hiệu.

4.12.2. Cột tách HPLC pha đảo, ví dụ PolymerX 5u RP-1 100A, kích thước 150 mm x 4,6 mm, chứa các hạt nhồi poly(styren divinylbenzen), cỡ hạt 5 mm hoặc loại tương đương.

5. Lấy mẫu

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 5139:2008 (CAC/GL 33-1999) Phương pháp khuyến cáo lấy mẫu để xác định dư lượng thuốc bảo vệ thực vật phù hợp với các giới hạn dư lượng tối đa (MRL).

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không được hư hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình bảo quản và vận chuyển.

6. Chuẩn bị mẫu thử

Mẫu thử được đồng hóa bằng máy nghiền (4.1) và trộn kỹ. Bảo quản mẫu đã chuẩn bị sao cho không làm thay đổi thành phần và chất lượng của mẫu.

7. Cách tiến hành

7.1. Chiết mẫu

Cân từ 2,0 g đến 2,5 g phần mẫu thử đã chuẩn bị (Điều 6), chính xác đến 0,001 g, cho vào ống li tâm 50 ml (4.4). Thêm 5 ml dung dịch HCl 2,0 mol/l (3.12), lắc bằng máy vortex (4.8) trong 60 s và giữ ống li tâm trong bể ổn nhiệt (4.9) ở nhiệt độ 100 ⁰C trong 1 h. Sau đó, thêm 6 ml nước vào ống li tâm, lắc bằng máy vortex trong 10s rồi đem li tâm trong 5 min với tốc độ 6 000 r/min. Gạn lấy phần lỏng cho vào ống li tâm thứ hai. Thêm 5 ml dung dịch HCl 2,0 mol/l (3.12) vào phần bã, lắc bằng máy vortex trong 60 s và giữ ống li tâm trong bể ổn nhiệt ở nhiệt độ 100 ⁰C trong 30 min. Thêm 6 ml nước, lắc bằng máy vortex trong 10 s, li tâm trong 5 min với tốc độ 6 000 r/min. Gạn lấy phần lỏng và gộp dịch chiết lần thứ hai vào ống li tâm thứ hai, Chỉnh pH của dịch chiết đến khoảng từ 9 đến 10 bằng dung dịch NaOH 6,0 mol/l (3.10) và dung dịch NaOH 1,0 mol/l (3.9) hoặc dung dịch HCl 1,0 mol/l (3.11). Đem li tâm trong 5 min với tốc độ 6 000 r/min. Dịch được lọc qua giấy lọc (4.10) vào ống li tâm 50 ml (4.4).

Nạp dịch chiết qua cột chiết pha rắn SPE silicagel (4.6) với tốc độ không quá 2 ml/min. Sau đó, rửa cột bằng 5 ml nước, 5 ml metanol (3.3). Cột được rửa giải bằng 5 ml hỗn hợp dung môi metanol/HCl (3.14), dịch rửa giải thu vào ống nghiệm bằng chất dẻo có nắp đậy (4.11).

Làm khô dịch rửa giải bằng dòng khí nitơ (3.17) ở nhiệt độ từ 40 ⁰C đến 50 ⁰C cho đến cạn. Hòa phần còn lại trong 1 ml dung dịch pha động (3.15) và bơm vào hệ thống HPLC.

7.2. Điều kiện vận hành HPLC

Các thông số vận hành dưới đây được coi là thích hợp:

– cột sắc ký: xem 4.12.2;

– tiền cột: C18 (20 mm x 3,9 mm x 5 mm);

– detector: detector UV, được đặt ở bước sóng l = 256 nm để xác định paraquat và l = 308 nm để xác định diquat;

– tốc độ dòng: 1 ml/min;

– thể tích bơm mẫu: 50 ml;

– nhiệt độ buồng cột: nhiệt độ phòng.

7.3. Dựng đường chuẩn

Sau khi thiết bị cài đặt đã ổn định, tiến hành bơm lần lượt các dung dịch chuẩn làm việc, theo thứ tự từ nồng độ thấp đến nồng độ cao, mỗi dung dịch chuẩn bơm một lần.

Xác định diện tích hoặc chiều cao pic của các dung dịch chuẩn và dựng đường chuẩn.

7.4. Xác định

Bơm dung dịch mẫu thử với cùng điều kiện như bơm dung dịch chuẩn.

Dựa vào đường chuẩn để xác định hàm lượng diquat và paraquat trong dung dịch mẫu thử.

Nếu diện tích pic hoặc chiều cao pic của dung dịch mẫu thử lớn hơn diện tích pic hoặc chiều cao pic của dung dịch chuẩn cao nhất thì phải tiến hành pha loãng mẫu và lặp lại quy trình phân tích.

8. Tính kết quả

Hàm lượng diquat và/hoặc paraquat trong mẫu, X, được biểu thị bằng miligam trên kilogam (mg/kg), được tính theo công thức sau:

Trong đó:

C_M là nồng độ diquat/paraquat trong dung dịch mẫu thử, tính bằng microgam trên mililit (mg/ml);

V là thể tích mẫu pha loãng cuối, tính bằng mililit (ml);

m là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g);

K là hệ số pha loãng.

9. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử độc lập, riêng rẽ thu được khi sử dụng cùng phương pháp, trên vật liệu thử giống hệt nhau, trong cùng một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn, trong không quá 5% các trường hợp lớn hơn 20% giá trị trung bình của hai kết quả.

10. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ:

– mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

– phương pháp lấy mẫu thử đã sử dụng, nếu biết;

– phương pháp thử đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

– tất cả các chi tiết thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc tùy ý lựa chọn cùng với các chi tiết bất thường nào khác có thể ảnh hưởng đến kết quả;

– kết quả thử nghiệm thu được;

– nếu kiểm tra độ lặp lại, nêu kết quả cuối cùng thu được.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] AOAC 992.17 Diquat and Paraquat Residues in Potatoes. Liquid Chromatographic Method

[2] TCVN 5139:2008 (CAC/GL 33-1999) Phương pháp khuyến cáo lấy mẫu để xác định dư lượng thuốc bảo vệ thực vật phù hợp với các giới hạn dư lượng tối đa (MRL).