TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 8674:2011 (ISO 14565:2000) VỀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN A – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM

TCVN 8674:2011

THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN A – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Animal feeding stuffs – Determination of vitamin A content – Method using high – performance liquid chromatography

Lời nói đầu

TCVN 8674:2011 hoàn toàn tương đương với ISO 14565:2000;

TCVN 8674:2011 do Cục Chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN A – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Animal feeding stuffs – Determination of vitamin A content – Method using high – performance liquid chromatography

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng vitamin A (retinol) tổng số trong thức ăn chăn nuôi và thức ăn cho thú cảnh bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Hàm lượng vitamin A là hàm lượng của all-trans-retinyl ancol và các đồng phân cis xác định được bằng phương pháp mô tả trong tiêu chuẩn này và được biểu thị theo đơn vị quốc tế trên kilogam (IU/kg).

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

TCVN 6952 (ISO 6498), Thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử.

3. Thuật ngữ và định nghĩa

Trong tiêu chuẩn này sử dụng thuật ngữ và định nghĩa sau:

3.1. Hàm lượng vitamin A (vitamin A content)

Hàm lượng của all-trans-retinyl ancol và các đồng phân cis xác định được theo tiêu chuẩn này.

CHÚ THÍCH: Hàm lượng vitamin A được biểu thị bằng đơn vị quốc tế trên kilogam (IU/kg); 1 IU vitamin A bằng 0,300 mg của all-trans-retinol.

4. Nguyên tắc

Mẫu được xà phòng hóa với dung dịch kali hydroxit trong etanol và vitamin A được tách chiết trong dầu nhẹ. Loại bỏ dầu nhẹ bằng cách cho bay hơi và phần cặn được hòa tan trong 2-propanol. Nồng độ vitamin A trong dịch chiết 2-propanol được xác định bằng sắc ký lỏng pha đảo dưới các điều kiện cho pic đơn lẻ đối với tất cả các đồng phân retinol.

5. Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích.

5.1. Nước, phù hợp với loại 3 của TCVN 4851 (ISO 3696).

5.2. Dung dịch kali hydroxit (KOH)

Hòa tan 500 g kali hydroxit trong nước (5.1) và pha loãng bằng nước đến 1 lít.

5.3. Etanol, w(C₂H₅OH) = 95% (theo thể tích), hoặc dùng cồn đã metyl hóa công nghiệp tương đương.

5.4. 2-propanol (C₃H₇OH).

5.5. Dầu nhẹ, có điểm sôi trong khoảng từ 40 ⁰C đến 60 ⁰C.

Lượng cặn còn lại sau khi bay hơi phải nhỏ hơn 20 mg/l.

5.6. Chất chuẩn vitamin A

5.6.1. All-trans-retinyl axetat, vitamin A axetat (C₂₂H₃₂O₂) 328,5 g/mol, có độ tinh khiết ít nhất 90%.

5.6.2. All-trans-retinol, ancol vitamin A (C₂₀H₃₀O), 286,5 g/mol, có độ tinh khiết ít nhất 90%.

5.7. Metanol, dùng cho HPLC.

5.8. Pha động dùng cho sắc ký lỏng

Trộn metanol (5.7) với nước (5.1) theo tỷ lệ 770:30 (theo thể tích).

Lọc qua bộ lọc màng (6.6), nếu cần.

5.9. Natri sulfat (Na₂SO₄), dạng khan.

5.10. Dung dịch natri ascorbat, r = 100 g/l.

5.11. Khí trơ, ví dụ: nitơ.

6. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể như sau:

6.1. Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao, gồm các bộ phận sau:

6.1.1. Bơm, được cài đặt ở tốc độ dòng ổn định 1 ml/min.

6.1.2. Bộ phận bơm của HPLC.

6.1.3. Cột, dài 250 mm, đường kính trong 4,6mm, được nhồi bằng pha tĩnh gồm các nhóm octadecyl (C₁₈) liên kết với silica.

Cột có ít nhất 4 000 đĩa lý thuyết và giá trị k’ = 0,6, cả hai cho thấy thỏa mãn đối với all-trans-retinol. Cỡ hạt không được nhỏ hơn 5 mm. và không lớn hơn 10mm. Có thể sử dụng các hệ thống khác với điều kiện là tách hết được vitamin A ra khỏi các chất chiết cùng khác.

6.1.4. Detector, cho phép đo bức xạ cực tím ở 325 nm và được trang bị máy tích phân/hệ thống xử lý dữ liệu.

6.2. Máy đo phổ UV (hoặc UV-nhìn thấy), có khả năng đo độ hấp thụ ở bước sóng xác định trong 9.6, được trang bị các cuvet thạch anh có chiều dài đường quang 10 mm.

6.3. Nồi cách thủy đun sôi

6.4. Bộ cô quay chân không, có nồi cách thủy ở 40 ⁰C.

6.5. Bộ chiết (Xem Hình 1) bao gồm các bộ phận sau đây:

– ống chiết hình trụ dung tích 1 lít có cổ bằng thủy tinh mài và có nút đậy;

– khớp nối thủy tinh mài, gắn với ống chiết và được trang bị một ống điều chỉnh đi qua tâm; và

– ống nối bên cạnh.

Ống điều chỉnh cần phải có một đầu dưới hình chữ U và một vòi phun phía trên sao cho lớp chất lỏng phía trên trong ống chiết có thể được chuyển sang phễu chiết dung tích 1 lít.

Có thể sử dụng các dụng cụ chiết khác như các bình nón và các phễu chiết thay cho thiết bị nêu trong Hình 1 với điều kiện là đạt được các độ thu hồi vitamin A.

6.6. Bộ lọc màng, cỡ lỗ 0,45 mm, để lọc pha động (5.8) và các dung dịch mẫu thử.

CHÚ DẪN

1. Ống chiết hình trụ, dung tích 1 lít có cổ thủy tinh mài

2. Lớp dầu nhẹ

3. Lớp dung dịch nước + nguyên liệu đã xà phòng hóa

4. Vòi phun

5. Chai, dung tích 1 lít có khớp nối thủy tinh mài

6. Ống nối bên cạnh

7. Ống có thể điều chỉnh được

Hình 1 – Ví dụ về thiết bị

7. Lấy mẫu

Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải là mẫu đại diện. Mẫu không bị hư hỏng thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.

Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 4325 (ISO 6497) Thức ăn chăn nuôi – Lấy mẫu.

Bảo quản mẫu sao cho không làm thay đổi thành phần và giảm chất lượng của mẫu.

8. Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 6498) Thức ăn chăn nuôi – Chuẩn bị mẫu thử.

Ngay trước khi bắt đầu phân tích, nghiền phần mẫu phòng thử nghiệm sao cho lọt qua rây cỡ lỗ 1 mm. Trộn kỹ.

Đồng hóa các thức ăn thú cảnh đóng hộp. Nghiền nhỏ thức ăn cho thú cảnh bán ẩm để lọt qua đĩa đục lỗ với cỡ lỗ 4 mm.

9. Cách tiến hành

9.1. Yêu cầu chung

Vì vitamin A nhạy với bức xạ tia cực tím và không khí, nên cần thực hiện tất cả các thao tác nhanh tránh ánh sáng huỳnh quang tự nhiên và mạnh. Sử dụng dụng cụ thủy tinh màu nâu khi có thể. Hoàn thành phép thử trong một ngày làm việc. Thực hiện việc xà phòng hóa và chiết all-trans-retinyl axetat chuẩn và các mẫu thức ăn chăn nuôi cùng một lúc.

9.2. Xà phòng hóa

Cân khoảng 50 g mẫu thử nghiệm đã chuẩn bị (xem Điều 8), chính xác đến 0,1 g, cho vào bình nón 1 lít.

Thêm 200 ml etanol (5.3). Xoay bình để làm phân tán mẫu.

Thêm 2 ml natri ascorbat (5.10) và 50 ml dung dịch kali hydroxit (5.2) và xoay bình để trộn.

Lắp bình ngưng hồi lưu vào bình cầu và nhúng bình cầu vào nồi cách thủy đun sôi (6.3).

Để lượng chứa trong bình cầu hồi lưu trong 60 min, thỉnh thoảng xoay bình.

Tháo bình cầu ra và để nguội đến nhiệt độ phòng càng nhanh càng tốt dưới dòng nước lạnh.

9.3. Chiết xuất vitamin A (retinol)

Chuyển lượng chứa trong bình cầu sang ống chiết hình trụ (xem 6.5).

Rửa sạch bình cầu hai lần, mỗi lần dùng 25 ml etanol hoặc cồn metyl công nghiệp (5.3) và chuyển nước tráng sang ống chiết hình trụ.

Lặp lại việc rửa bình cầu hai lần, mỗi lần dùng 125 ml dầu nhẹ (5.5) và một phần 250 ml nước (5.1), mỗi lần tráng chuyển nước rửa sang ống chiết hình trụ.

Đậy nắp ống chiết hình trụ và lắc đều trong 1 min, thỉnh thoảng chú ý giải phóng áp suất.

Làm nguội ống chiết hình trụ dưới dòng nước lạnh trong khi đợi tách hai pha lỏng, trước khi tháo bỏ nắp.

Khi đã tách lớp, tháo bỏ nắp, rửa mặt trong nắp bằng một vài mililit dầu nhẹ (5.5) và chèn ống có thể điều chỉnh (xem 6.5), chỉnh vị trí đầu dưới sao cho chỉ hơi trên mức phân lớp.

Bằng cách áp dụng một áp lực nhẹ của khí trơ (5.11) vào ống bên cạnh, chuyển lớp dầu nhẹ phía trên sang phễu chiết 1 lít (xem 6.5).

Thêm 125 ml dầu nhẹ (5.5) vào ống chiết hình trụ, đậy nắp và lắc đều 1 min.

Để tách lớp lại và chuyển lớp trên sang phễu chiết bằng cách sử dụng ống có thể điều chỉnh (xem 6.5) như trên.

Thêm tiếp 125ml dầu nhẹ (5.5) vào ống chiết hình trụ, đậy nắp và lắc đều 1 min.

Lại để cho tách lớp và chuyển lớp trên sang phễu chiết bằng cách sử dụng ống điều chỉnh như trên.

Rửa sạch các dịch chiết dầu nhẹ với bốn phần, mỗi phần 100 ml nước, lúc đầu chỉ nhẹ nhàng đảo ngược sau đó lắc nhẹ để giữ cho việc hình thành nhũ tương ở mức tối thiểu.

Chuyển dịch chiết đã rửa qua giấy lọc trung bình/nhanh có chứa 60 g natri sulfat khan (5.9), vào một bình cầu thích hợp để bay hơi chân không.

Rửa sạch phễu chiết hai lần, mỗi lần dùng 20 ml dầu nhẹ (5.5) và cho nước rửa qua bộ lọc vào bình cầu làm bay hơi.

Rửa bộ lọc tiếp hai lần, mỗi lần dùng 25 ml dầu nhẹ (5.5) và cho nước rửa vào bình làm bay hơi.

Làm bay hơi dịch chiết dầu nhẹ đến khô dưới chân không ở nhiệt độ không quá 40 ⁰C.

Khôi phục lại áp suất khí quyển bằng cách nạp khí trơ (5.11).

9.4. Sắc ký lỏng hiệu năng cao

9.4.1. Hòa tan cặn bằng một lượng tối thiểu 2-propanol (5.4) và chuyển định lượng sang bình định mức 20 ml.

Rửa sạch bình cầu làm bay hơi có ba phần nhỏ 2-propanol (5.4), chuyển nước rửa vào bình định mức. Pha loãng đến vạch bằng 2-propanol (5.4) và trộn. Đối với vật liệu có chứa trên 100 000 IU/kg, thì có thể cần phải pha loãng tiếp.

CHÚ THÍCH: IU = Đơn vị quốc tế; 1 IU vitamin A = 0,300 mm của all-trans-retinol.

Nếu cần, lọc dịch chiết mẫu qua bộ lọc màng (6.6).

9.4.2. Nếu không thể tránh khỏi việc trì hoãn, thì bảo quản dịch chiết dưới khí trơ (5.11) trong tủ lạnh ở nhiệt độ 4 ⁰C và sau đó đưa trở lại nhiệt độ phòng ở nơi tối.

9.4.3. Bơm 10 ml dịch chiết mẫu vào cột sắc ký lỏng (6.1) và đo diện tích pic của retinol.

9.4.4. Tính diện tích pic trung bình thu được từ các lần bơm lặp lại dịch chiết mẫu và xác định nồng độ retinol của dịch chiết bằng cách so sánh với diện tích pic trung bình tìm được của các lần bơm lặp lại của chuẩn retinol có nồng độ tương tự. Thời gian lưu của retinol là khoảng 5 min. Thực hiện các lần bơm thay thế của dịch chiết mẫu và dung dịch chuẩn.

9.5. Thủy phân all-trans-retinyl axetat để hiệu chuẩn

Chuẩn bị dung dịch của all-trans-retinyl axetat (5.6) trong etanol (5.3) sao cho 1 ml chứa khoảng 15 000 IU vitamin A.

CHÚ THÍCH: 1 IU vitamin A = 0,344 mm các all-trans-retinyl axetat.

Dùng buret 5 ml với vạch chia 0,02 ml, chuyển 2,5 ml ± 0,02 ml dung dịch này sang bình cầu 150 ml.

Thêm 20 ml etanol (5.3), 1 ml dung dịch kali hydroxit (5.2) và 5 ml dung dịch natri ascorbat (5.10).

Lắp bình ngưng vào bình cầu. Nhúng bình cầu vào nồi cách thủy đun sôi và để hồi lưu trong 60 min.

Làm nguội bình cầu đến nhiệt độ phòng dưới dòng nước lạnh và chuyển lượng chứa trong bình sang phễu chiết (xem 6.5).

Tráng bình cầu bằng 50 ml nước (5.1), tiếp theo là 25 ml etanol (5.3), cho nước tráng sang phễu chiết.

Chiết pha nước bằng một phần 80 ml dầu nhẹ (5.5) và sau đó chiết tiếp hai lần mỗi lần 50 ml dầu nhẹ (5.5).

Gộp tất cả các dịch chiết bằng dầu nhẹ, sau đó rửa hai lần mỗi lần 50 ml nước. Thêm 2 g natri sulfat khan (5.9).

Chuyển dịch chiết dầu nhẹ sang bình định mức 250 ml và pha loãng đến vạch. Nồng độ retinol của dung dịch này (dung dịch 1) là khoảng 150 IU/ml.

9.6. Chuẩn hóa dung dịch retinol để hiệu chuẩn

Dùng pipet lấy 5 ml ± 0,03 ml dung dịch 1 (9.5) cho vào bình định mức 50 ml và loại bỏ dung môi ở nhiệt độ môi trường bằng dòng khí trơ (5.11).

Hòa tan cặn trong 2-propanol (5.4) và sau đó thêm 2-propanol đến vạch.

Đo độ hấp thụ (A) của dung dịch, sử dụng 2-propanol làm đối chứng, ở bước sóng 310 nm, 325 nm và 334 nm. Các giá trị độ hấp thụ phải xấp xỉ từ 0,7 đến 0,8. Có thể sử dụng dung dịch trung gian, nếu cần.

Sử dụng công thức sau đây, tính hấp thụ hiệu chỉnh ở bước sóng 325 nm:

A_{325, corr} = 6,815 x A₃₂₅ – 2,555 x A₃₁₀ – 4,26 x A₃₃₄

Nếu A_325,corr/A₃₂₅ nhỏ hơn 0,97, thì sử dụng giá trị A_325,corr để chuẩn hóa, nếu không sử dụng A₃₂₅.

Nồng độ retinol của dung dịch 1 được đưa ra bằng:

nồng độ (IU/ml) = A₃₂₅ x 183 IU/ml, hoặc

nồng độ (IU/ml) = A_325,corr x 183 IU/ml.

9.7. Chuẩn bị chuẩn retinol cho sắc ký

Chuẩn bị dung dịch retinol trong 2-propanol (5.4) có nồng độ xấp xỉ như nồng độ dự kiến trong dịch chiết mẫu (9.4.1). Đối với mỗi 1 000 IU vitamin A trên kilogam mẫu, thì nồng độ retinol dự kiến có trong dịch chiết là 2,5 IU/ml.

Cho bay hơi một thể tích của dung dịch 1 (9.5) đến khô ở nhiệt độ môi trường bằng dòng khí trơ (5.11). Hòa tan cặn trong một lượng thích hợp của 2-propanol để có được nồng độ retinol theo yêu cầu và trộn.

Lọc dung dịch chuẩn qua bộ lọc màng (6.6), nếu cần.

Cách khác để hiệu chuẩn, có thể sử dụng dung dịch chuẩn của vitamin A (retinol) trong 2-propanol (5.4) được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc của all-trans-retinol bằng cách hòa tan một lượng thích hợp của chất chuẩn all-trans-retinol (5.6.2) trực tiếp trong 2-propanol (5.4).

Trong trường hợp này, kiểm tra chuẩn vitamin A bằng cách đo hấp thụ của dung dịch chuẩn trong các cuvet thạch anh (6.2) ở bước 300 nm, 325 nm, 350 nm và 370 nm với 2-propanol làm đối chứng. Xác định tỷ lệ A/A₃₂₅ tại mỗi bước sóng đối với all-trans-retinol. Nếu tỷ lệ này không vượt quá 0,602, 0,432 và 0,093 ở các bước sóng 300 nm, 350 nm và 370 nm tương ứng, thì các chất chuẩn là phù hợp cho sử dụng (xem tài liệu tham khảo [5], [6]).

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng hiệu chuẩn nhiều điểm để tạo thuận lợi cho phép phân tích trong những trường hợp, ví dụ, nồng độ vitamin A dự kiến trong mẫu chiết chưa biết.

10. Biểu thị kết quả

Tính hàm lượng vitamin A của mẫu thử, bằng công thức sau:

W_A = 20 000 x 

Trong đó:

w_A là hàm lượng vitamin A của mẫu thử, tính bằng đơn vị quốc tế trên kilogam (IU/kg);

c là nồng độ retinol của dịch chiết, tính bằng đơn vị quốc tế trên mililit (IU/ml);

m là khối lượng của mẫu thử, tính bằng gam (g).

11. Độ chụm

11.1. Thử nghiệm liên phòng

Các chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục A. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và chất nền khác với các dải nồng độ và chất nền đã nêu.

Bảng 1 – Giới hạn lặp lại (r) và giới hạn tái lập (R)

11.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử độc lập, đơn lẻ thu được khi sử dụng cùng phương pháp trên vật liệu thử giống hệt nhau trong cùng một phòng thử nghiệm, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn, trong không quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn gặp lại r nêu trong Bảng 1.

11.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử đơn lẻ, thu được khi sử dụng cùng phương pháp, tiến hành thử trên vật liệu giống nhau trong các phòng thử nghiệm khác nhau, do những người khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau thực hiện, trong không quá 5% các trường hợp lớn giới hạn tái lập R nêu trong Bảng 1.

12. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ:

– mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

– phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

– phương pháp thử nghiệm đã dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

– mọi chi tiết thao tác được quy định trong tiêu chuẩn này hoặc những điều được coi là tùy ý cũng như các sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả thử;

– thể hiện kết quả thử nghiệm thu được, hoặc hai kết quả thử nghiệm thu được nếu độ lặp lại được kiểm tra.

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

Kết quả của các phép thử liên phòng thử nghiệm

Độ chụm của phương pháp được thiết lập bởi phép thử nghiệm liên phòng được thực hiện ISO 5725 [1] [1]⁾. Kết quả của phép thử nghiệm này đã được công bố (xem Thư mục tài liệu tham khảo [7]). Trong các phép thử này có từ 12 phòng đến 14 phòng thử nghiệm tham gia và các mẫu đã được nghiên cứu là thức ăn thú cảnh bán ẩm, thức ăn cho gia cầm dạng viên, phần ăn cho gia súc lớn, phần ăn đậm đặc cho lợn và thức ăn cho cá.

Bảng A.1 – Thống kê các kết quả thử nghiệm liên phòng

Thư mục tài liệu tham khảo

[1] ISO 5725:1986, Precision of test methods – Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests.

[2] TCVN 6910-1:2001 (ISO 5725-1:1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung.

[3] TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2:1994) Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo – Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn.

[4] TCVN 4325 (ISO 6497), Thức ăn chăn nuôi – Lấy mẫu.

[5] Takashima, Y. et al. Stability of retinol analogs. Chem. Pharm. Bull., 27, 1979, pp. 1553.

[6] Bolliger, M.R. et al. The monograph of vitamin A in the European Pharmacopoeia. Pharm. Acta. Helv., 52 (8), 1977, pp. 161-174.

[7] Analytical Methods Committee, Analyst, 110, 1985, pp. 1019-1026