TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 9724:2013 (EN 14132:2009) VỀ THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH OCHRATOXIN A TRONG CÀ PHÊ RANG VÀ LÚA MẠCH – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CÓ LÀM SẠCH BẰNG CỘT MIỄN NHIỄM

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

TCVN 9724:2013

EN 14132:2009

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH OCHRATOXIN A TRONG CÀ PHÊ RANG VÀ LÚA MẠCH – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CÓ LÀM SẠCH BẰNG CỘT MIỄN NHIỄM

Foodstuffs – Determination Of Ochratoxin A In Barley And Roasted Coffee – Hplc Method With Immunoaffinity Column Clean-up

Lời nói đầu

TCVN 9724:2013 hoàn toàn tương đương với EN 14132:2009;

TCVN 9724:2013 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F16 Cà phê và sản phẩm cà phê biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

 

THỰC PHẨM – XÁC ĐỊNH OCHRATOXIN A TRONG CÀ PHÊ RANG VÀ LÚA MẠCH – PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) CÓ LÀM SẠCH BẰNG CỘT MIỄN NHIỄM

Foodstuffs – Determination Of Ochratoxin A In Barley And Roasted Coffee – Hplc Method With Immunoaffinity Column Clean-up

CẢNH BÁO: Ochratoxin A gây độc đối với gan, thận và có tính chất ức chế miễn dịch. Hợp chất này đã được Tổ chức quốc tế nghiên cứu về Ung thư (IARC) xếp vào danh mục các chất có thể gây ung thư cho người (Nhóm 2B). Axetonitrit là chất nguy hiểm. Toluen là chất có hại và rất dễ cháy. Cần quan sát các cảnh báo an toàn khi thao tác với các hợp chất nêu trên.

Phải luôn đeo găng tay và kính an toàn, tất cả chất chuẩn và các bước chuẩn bị mẫu phải được thực hiện trong tủ hút. Các thao tác bên ngoài tủ hút như đo phổ của các chất chuẩn bằng máy đo quang phổ UV phải được thực hiện bằng cách đặt chất chuẩn trong vật chứa đậy kín.

Các quy trình khử nhiễm đối với chất thải phòng thử nghiệm được IARC nêu trong Tài liệu tham khảo [1].

1. Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng ochratoxin A trong cà phê rang và lúa mạch, dùng cột làm sạch miễn nhiễm và máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Phương pháp này đã được đánh giá xác nhận đối với hàm lượng ochratoxin A trong lúa mạch trong dải từ 0,1 mg/kg đến 4,5 mg/kg và trong cà phê rang từ 0,2 mg/kg đến 5,5 mg/kg.

2. Tài liệu viện dẫn

Các tài liệu viện dẫn sau rất cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi, bổ sung (nếu có).

TCVN 4851:1992 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích trong phòng thí nghiệm – Yêu cầu kỹ thuật và các phương pháp thử.

3. Nguyên tắc

Ochratoxin A được chiết ra khỏi lúa mạch bằng cách trộn với dung dịch axetonitril. Dịch chiết được tinh sạch bằng cách cho qua cột miễn nhiễm. Ochratoxin A được chiết ra khỏi cà phê rang xay bằng cách trộn với metanol và natri hydro cacbonat. Dịch chiết được làm sạch sơ bộ bằng cách đầu tiên cho qua cột phenyl silan sau đó cho qua cột miễn nhiễm. Ochratoxin A được tách bằng HPLC pha đảo rồi được xác định bằng độ huỳnh quang.

4. Thuốc thử

4.1. Yêu cầu chung

Trong suốt quá trình phân tích, chỉ sử dụng các thuốc thử tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước loại 1 theo quy định trong TCVN 4851 (ISO 3696), trừ khi có quy định khác. Các dung môi phải có chất lượng dùng cho phân tích HPLC.

Có thể sử dụng các thuốc thử có bán sẵn có các đặc tính tương đương với các thuốc thử sau:

4.2. Natri clorua

4.3. Dinatri hydro phosphat.

4.4. Kali dihydro phosphat.

4.5. Kali clorua.

4.6. Dung dịch natri hydroxit, r(NaOH) = 0,8 g/l

Hòa tan 8 g natri hydroxit trong 900 ml, thêm nước đến 1 lít.

4.7. Muối đệm phosphat (PBS)

Hòa tan 8 g natri clorua (4.2), 1,2 g dinatri hydro phosphat (4.3), 0,2 g kali dihydro phosphat (4.4) và 0,2 g kali clorua (4.5) trong 900 ml nước. Chỉnh pH đến 7,4 bằng dung dịch natri hydroxit (4.6) rồi thêm nước đến 1 lít.

Có thể sử dụng các viên muối đệm phosphat bán sẵn có các đặc tính tương đương.

4.8. Dung dịch natri hydro cacbonat, r(NaHCO₃) = 30 g/l

Hòa tan 30 g natri hydro cacbonat trong 900 ml nước trong bình định mức 1 lít. Thêm nước đến vạch.

4.9. Axit axetic băng, j(CH₃COOH) = 98%.

4.10. Metanol.

4.11. Axetonitril

4.12. Toluen.

4.13. Hỗn hợp dung môi toluen và axit axetic băng

Trộn 99 phần thể tích toluen (4.12) với 1 phần thể tích axit axetic băng (4.9).

4.14. Hỗn hợp dung môi để chiết lúa mạch

Trộn 6 phần thể tích axetonitril (4.11) với 4 phần thể tích nước.

4.15. Hỗn hợp dung môi để chiết cà phê rang

Trộn 1 phần thể tích metanol (4.10) với 1 phần thể tích dung dịch natri hydro cacbonat (4.8).

4.16. Dung môi bơm

Trộn 30 phần thể tích metanol (4.10) với 70 phần thể tích nước và 1 phần thể tích axit axetic băng (4.9).

4.17. Pha động

Trộn 102 phần thể tích nước với 96 phần thể tích axetonitril (4.11) và 2 phần thể tích axit axetic băng (4.9), lọc qua bộ lọc cỡ lỗ 0,2 mm (5.12) và loại khí trước khi sử dụng, ví dụ khí heli để loại khí.

4.18. Dung dịch rửa cột phenyl silan 1

Trộn 20 phần thể tích metanol (4.10) với 80 phần thể tích dung dịch natri hydro cacbonat (4.8)

4.19. Dung dịch rửa cột phenyl silan 2, r(NaHCO₃) = 1 g/ 100 ml

Hòa tan 1 g natri hydro cacbonat trong 90 ml nước đựng trong bình định mức 100 ml. Thêm nước đến vạch.

4.20. Dung dịch rửa giải cột phenyl silan

Trộn 7 phần thể tích metanol (4.10) với 93 phần thể tích nước.

4.21. Dung dịch gốc ochratoxin A

Hòa tan 1 mg ochratoxin A (dạng tinh thể) hoặc lượng chứa trong 1 ampun (nếu ochratoxin A thu được ở dạng màng) trong hỗn hợp dung môi (4.13) để có dung dịch chứa khoảng 20 mg/ml đến 30 mg/ml ochratoxin A. Để xác định nồng độ ochratoxin A, ghi lại đường cong hấp thụ ở bước sóng từ 300 nm đến 370 nm ở các khoảng bước sóng 5 nm trong cuvet thạch anh 1 cm (5.14), dùng hỗn hợp dung môi (4.13) làm dung dịch đối chứng. Nhận biết bước sóng cho độ hấp thụ tối đa và tính nồng độ khối lượng của ochratoxin A, r_ota, bằng microgam trên mililit (mg/ml), theo công thức (1):

                             (1)

Trong đó

A_max là độ hấp thụ tối đa được xác định trên đường cong hấp thụ (ở đây: ở bước sóng 333 nm);

M là khối lượng phân tử của ochratoxin A (M = 403,8 g/mol);

e là hệ số phân tử hấp thụ của ochratoxin A trong hỗn hợp dung môi (4.13), (trường hợp này là 544 m²/mol);

b là chiều dài đường quang của cuvet thạch anh, tính bằng centimet (cm).

Khi được bảo quản ở -18⁰C, dung dịch này bền ít nhất trong 4 năm.

4.22. Dung dịch chuẩn ochratoxin A

Pha loãng dung dịch gốc (4.21) bằng hỗn hợp dung môi (4.13) để thu được dung dịch chuẩn có nồng độ khối lượng ochratoxin A là 10 mg/ml. Bảo quản dung dịch này trong tủ lạnh ở khoảng 4⁰C và kiểm tra độ ổn định của dung dịch.

4.23. Dung dịch hiệu chuẩn ochratoxin A

Dùng pipet lấy 200 ml dung dịch chuẩn ochratoxin A nồng độ 10 mg/ml (4.22) cho vào lọ thủy tinh và pha loãng đến 1 ml bằng 800 ml hỗn hợp dung môi (4.13). Dung dịch này có nồng độ ochratoxin A 2 mg/ml. Dùng pipet lấy 100 ml dung dịch ochratoxin A nồng độ 2 mg/ml cho vào lọ thủy tinh (5.2). Làm bay hơi dung môi dưới dòng nitơ. Hòa tan lại trong 10 ml dung môi bơm (4.16), đã được lọc qua bộ lọc cỡ lỗ 0,2 mm (5.12), thu được dung dịch hiệu chuẩn nồng độ 20 mg/ml.

Chuẩn bị dung dịch hiệu chuẩn trong ngày phân tích.

4.24. Dung dịch bổ sung chuẩn

Dùng pipét lấy 100 ml dung dịch chuẩn ochratoxin A nồng độ 10 mg/ml (4.22) cho vào trong lọ thủy tinh. Pha loãng đến 2 ml bằng 1,9 ml hỗn hợp toluen và axit axetic băng (4.13). Dung dịch này chứa ochratoxin A với nồng độ khối lượng 500 ng/ml.

4.25. Cột miễn nhiễm

Cột miễn nhiễm chứa các kháng thể tùy theo ochratoxin A. Cột phải có khả năng chiết ochratoxin A không nhỏ hơn 100 ng. Tính năng của cột phải được kiểm tra bằng cách dùng dung dịch ochratoxin A 100 ng trong hỗn hợp dung môi có cùng thành phần như dịch chiết mẫu (6.1.3) đã được sử dụng. Cột này phải cho độ thu hồi không nhỏ hơn 85%.

4.26. Cột chiết pha rắn phenyl silan

Cột có chứa 500 mg chất hấp thụ và dung tích bể 3 ml (để đảm bảo cột có đủ độ sâu và tránh để chất phân tích đi xuyên qua). Cột phải có khả năng chiết ochratoxin A không nhỏ hơn 100 ng và cho độ thu hồi không nhỏ hơn 85% đối với dung dịch chuẩn ochratoxin A trong dung môi chiết cà phê rang (4.15) chứa 100 ng ochratoxin A.

5. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ của phòng thử nghiệm thông thường và cụ thể các thiết bị, dụng cụ sau:

5.1. Cân phân tích, có độ chính xác đến 0,01 mg

5.2. Lọ thủy tinh, dung tích nhỏ nhất là 10 ml

Một số kiểu lọ thủy tinh có thể làm thất thoát ochratoxin A trong quá trình bay hơi. Để tránh được điều này, lọ cần được silan hóa. Chuẩn bị lọ bằng cách đổ đầy thuốc thử silan hóa và để thuốc thử này trong lọ 1 min. Tráng lọ hai lần bằng dung môi thích hợp (toluen, axeton hoặc hexan) sau đó bằng nước (hai lần) và làm khô lọ.

5.3. Máy trộn, loại chống nổ

Bình dung tích 1 lít, có nắp đậy và có tốc độ trộn cao khoảng 20 000 min^-1.

5.4. Pipet loại thay đổi dung tích: 5 ml, 1 ml và 200 ml có các đầu típ thích hợp.

5.5. Ống hút chân không: dùng cho các cột miễn nhiễm và phenyl silan.

5.6. Bơm chứa và các phụ kiện kèm theo để gắn với cột miễn nhiễm.

5.7. Bơm chân không, có khả năng rút chân không ở 10 mbar và bơm với tốc độ 18 l/min.

5.8. Máy lắc tay hoặc loại tương tự

5.9. Máy li tâm lạnh, có khả năng ly tâm ở 1300 g và vận hành ở 4⁰C.

5.10. Ống ly tâm, ví dụ dung tích 50 ml.

5.11. Giấy lọc, cỡ lỗ 20 mm đến 25 mm hoặc loại tương tự.

5.12. Dụng cụ lọc dạng xyranh dùng một lần, màng polysulfon, đường kính 25 mm, cỡ lỗ 0,2 mm.

5.13. Thiết bị HPLC gồm có:

5.13.1. Hệ thống bơm, có van bơm dạng syranh với vòng bơm 100 ml hoặc loại tương đương.

5.13.2. Máy bơm HPLC, đẳng dòng, có khả năng duy trì tốc độ dòng thể tích ở 1 ml/min.

5.13.3. Cột tách pha đảo phân tích, ví dụ C₁₈ octyldecylsilan (ODS), đảm bảo rửa giải ochratoxin A ra khỏi tất cả các pic khác. Độ trùm tối đa của các pic phải nhỏ hơn 10% (có thể cần chỉnh pha động để có độ phân giải đường nền thích hợp). Nên sử dụng tiền cột thích hợp.

5.13.4. Detector huỳnh quang, được gắn với cuvet dòng chảy và cài đặt ở bước sóng 333 nm (bước sóng kích thích) và 460 nm (bước sóng phát xạ).

5.13.5. Hệ thống dữ liệu

5.14. Máy đo phổ UV, có cuvet thạch anh thích hợp.

6. Cách tiến hành

6.1. Lúa mạch

6.1.1. Chiết mẫu

Cần 25 g phần mẫu thử lúa mạch đã nghiền (cỡ hạt 0,5 mm), chính xác đến 0,1 g, cho vào bình trộn (5.3). Thêm 100 ml hỗn hợp dung môi chiết (4.14). Đậy kín bình và trộn 3 min trong máy trộn tốc độ cao khoảng 20 000 min^-1. Lọc dịch chiết qua giấy lọc (5.11).

6.1.2. Làm sạch bằng cột miễn nhiễm

Chuẩn bị cột miễn nhiễm theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

Dùng pipet lấy 4 ml dịch lọc của mẫu (xem 6.1.1) cho vào cốc thủy tinh có mỏ 100 ml (hoặc loại tương tự) và pha loãng bằng 44 ml PBS (4.7). Nối cột miễn nhiễm (4.25) với ống hút chân không (5.5) và gắn bình (5.6) vào cột miễn nhiễm. Cho tất cả dịch chiết mẫu đã pha loãng vào bình và cho đi qua cột miễn nhiễm. Tốc độ dòng không được vượt quá 5 ml/min. Không để cột miễn nhiễm bị khô. Rửa cột miễn nhiễm bằng 10 ml nước. Làm khô cột bằng cách cho không khí đi qua ít nhất hai lần. Tháo cột miễn nhiễm ra khỏi ống hút chân không và đặt lên trên lọ (5.2).

6.1.3. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử

Rửa giải ochratoxin A trong lọ (5.2) bằng dung môi phù hợp theo hướng dẫn của nhà sản xuất cột. Làm bay hơi dịch rửa giải trong cột miễn nhiễm đến khô, ví dụ dưới dòng nitơ ở khoảng 50⁰C. Hòa tan lại trong 1,0 ml dung môi bơm (4.16), đã được lọc qua bộ lọc 0,2 mm (5.12). Chuyển vào lọ HPLC (V₃). Đây là dung dịch mẫu thử.

6.2. Cà phê rang

6.2.1. Chiết mẫu

Cân 15 g phần mẫu thử của mẫu cà phê rang xay (cỡ hạt 1 mm), chính xác đến 0,1 g, cho vào bình nón 500 ml. Thêm 150 ml dung môi chiết (4.15). Đậy nắp và lắc nhẹ trong 30 min. Lọc dịch chiết qua giấy lọc (5.11). Chuyển khoảng 50 ml phần dịch chiết cà phê sang ống ly tâm (5.10) và ly tâm 15 min ở 4⁰C với gia tốc 1300 g.

6.2.2. làm sạch bằng cột phenyl silan

Gắn cột phenyl silan (4.26) với ống hút chân không (5.5) nhưng không sử dụng hút chân không cho cột (có thể dùng khí nitơ làm áp suất dương để hỗ trợ tốc độ dòng ở giai đoạn chuẩn bị cột, nếu cần). Rửa cột bằng 15 ml metanol (4.10) rồi rửa bằng 5 ml dung dịch natri hydro cacbonat (4.8). Loại bỏ nước rửa.

Dùng pipet lấy 10 ml dịch chiết cà phê đã ly tâm (xem 6.2.1) cho vào cốc thủy tinh có mỏ và thêm 10 ml dung dịch natri hydro cacbonat (4.8). Cho dịch chiết pha loãng này đi qua phenyl silan ở tốc độ tối đa 5 ml/min. Rửa cột phenyl silan bằng 10 ml dung dịch rửa 1 (4.18), tốc độ dòng tối đa 5 ml/min, sau đó rửa tiếp bằng 5 ml dung dịch rửa 2 (4.19). Tháo cột phenyl silan ra khỏi ống hút chân không và làm khô cột bằng cách bơm không khí ít nhất ba lần, mỗi lần 10 ml qua vật liệu nhồi, dùng xyranh. Sau đó, đặt cột lên trên bình thu nhận thích hợp và rửa giải ochratoxin A bằng 10 ml dung dịch rửa giải cột phenyl silan (4.20), tốc độ dòng tối đa 5 ml/min.

6.2.3. Làm sạch bằng cột miễn nhiễm

Pha loãng dịch rửa giải cột phenyl silan column (6.2.2) bằng 30ml PBS (4.7). Nối cột miễn nhiễm (4.25) với ống hút chân không (5.5), gắn bình chứa (5.6) vào cột miễn nhiễm. Cho dịch chiết mẫu đã pha loãng vào bình chứa và cho đi qua cột miễn nhiễm. Tốc độ dòng không được quá 5 ml/min. Không để cột miễn nhiễm bị khô. Rửa cột miễn nhiễm bằng 10 ml nước. Tháo cột miễn nhiễm ra khỏi ống hút chân không và đặt lên trên lọ (5.2)

6.2.4. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử

Rửa giải ochratoxin A vào trong lọ (5.2), dùng bốn phần, mỗi phần 1 ml dung môi rửa giải theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Làm bay hơi dịch rửa giải trong cột miễn nhiễm đến khô dưới dòng khí nitơ, ví dụ ở khoảng 50⁰C. Hòa tan lại trong 1 ml dung môi bơm (4.16) và lọc qua bộ lọc 0,2 mm (5.12). Chuyển vào lọ HPLC (V₃). Đây là dung dịch mẫu thử.

7. Quy trình bổ sung chuẩn

7.1. Quy trình bổ sung chuẩn đối với lúa mạch

Cân 25g mẫu trắng lúa mạch, chính xác đến 0,1 g, cho vào bình trộn. Dùng pipet lấy 200 ml  dung dịch bổ sung ochratoxin A (4.24) cho vào mẫu trắng lúa mạch. Để mẫu rắn đã bổ sung chuẩn trong tủ hút qua đêm, để dung môi bay hơi. Tiến hành tiếp như trong 6.1.

7.2. Quy trình bổ sung chuẩn đối với cà phê rang xay

Cân 15 g mẫu trắng của cà phê rang xay (cỡ hạt 1 mm), chính xác đến 0,1 g, cho vào bình nón 500 ml. Dùng pipet lấy 120 ml dung dịch bổ sung ochratoxin A (4.24) cho vào mẫu trắng cà phê. Để mẫu rắn đã bổ sung trong tủ hút qua đêm, để dung môi bay hơi. Tiến hành tiếp như trong 6.2.

8. Phân tích HPLC

8.1. Đường chuẩn

Chuẩn bị đường chuẩn trong ngày phân tích và khi có sự thay đổi các điều kiện sắc ký.

Chuẩn bị năm dung dịch hiệu chuẩn (4.23) cho vào các bình định mức 5 ml riêng rẽ theo Bảng 1. Pha loãng từng dung dịch hiệu chuẩn đến vạch bằng dung môi bơm đã lọc (4.16).

Bảng 1 – Chuẩn bị dung dịch hiệu chuẩn HPLC

Số của dung dịch hiệu chuẩn HPLC	Dung dịch hiệu chuẩn (4.23) (ml)	Dung môi bơm (4.16), đã lọc (ml)	Nồng độ khối lượng (ng/ml)
1	125	4875	0,5
2	250	4750	1,0
3	500	4500	2,0
4	1250	3750	5,0
5	2500	2500	10,0

8.2. Các điều kiện vận hành HPLC

Khi cột đáp ứng quy định kỹ thuật trong 5.13.3, (kích thước 4,6 mm x 250 mm với cỡ hạt 5 mm) và pha động quy định trong 4.17 được sử dụng, việc cài đặt sau đây là thích hợp:

– Tốc độ dòng pha động (cột): 1,0 ml/min;

– Detector huỳnh quang, bước sóng kích thích: 460 nm;

bước sóng phát xạ: 333 nm;

– Thể tích bơm: 100 ml (V₄)

8.3. Nhận biết

Nhận biết chất phân tích bằng cách so sánh thời gian lưu của pic liên quan trong mẫu với pic của chất chuẩn trong sắc đồ.

Đôi khi có thể cần nhận biết pic bằng cách bơm đồng thời dung dịch mẫu thử và dung dịch chuẩn.

8.4. Xác định

Tiến hành xác định bằng phương pháp ngoại chuẩn, tích phân diện tích pic hoặc xác định chiều cao pic và so sánh các kết quả với các giá trị tương ứng với chất chuẩn có diện tích pic hoặc chiều cao pic gần nhất hoặc sử dụng đường chuẩn. Trong trường hợp sử dụng đường chuẩn, thì có thể chuẩn bị các dung dịch bổ sung có các nồng độ mẫu nằm trong dải tuyến tính được chuẩn bị cho đường chuẩn.

Bơm các thể tích bằng nhau của dung dịch mẫu thử và dung dịch chuẩn dùng cho đường chuẩn.

Nếu tín hiệu ochratoxin A của mẫu nằm ngoài dải hiệu chuẩn thì chỉnh lượng mẫu đã bơm bằng cách pha loãng dung dịch mẫu thử.

9. Tính kết quả

Đọc từ đường chuẩn hàm lượng ochratoxin A, có trong phần dịch lỏng của dung dịch thử nghiệm được bơm lên cột HPLC, tính bằng nanogam.

Tính nồng độ khối lượng của ochratoxin A, w_OTA, bằng microgam trên kilogam (mg/kg), dùng Công thức (2):

Trong đó:

ma	là khối lượng ochratoxin A trong phần dịch lỏng của dung dịch thử nghiệm được bơm lên cột, tính bằng nanogram (ng);
V4	là thể tích phần dịch lỏng của dung dịch thử nghiệm đã được bơm lên cột (8.2), tính bằng mililit (ml);
V3	là thể tích dung dịch thử (6.1.3, 6.2.3), (V3 = 1,0 ml), tính bằng mililit (ml);
V2	là thể tích dịch lọc của mẫu được lấy để làm sạch, [đối với lúa mạch V2 = 4,0 ml (6.1.2), đối với cà phê rang V2 = 10 ml (6.2.2)], tính bằng mililit (ml);
V1	là thể tích của dung môi chiết, (đối với lúa mạch V1 = 100 ml, đối với cà phê rang V1 = 150 ml), tính bằng mililit (ml);
ms	là khối lượng của mẫu đã chiết, (đối với lúa mạch ms = 25 g, đối với cà phê rang ms = 15 g), tính bằng gam (g);

Biểu thị kết quả cuối cùng bằng microgam trên kilogam vì đơn vị đo này cũng tương đương với nanogam trên gam.

10. Độ chụm

10.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm

Các chi tiết về phép thử liên phòng thử nghiệm để xác định độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục A. Các giá trị thu được từ phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng cho các dải nồng độ và các chất nền khác với các giá trị nêu trong Phụ lục A.

10.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử nghiệm đơn lẻ thu được trên vật liệu thử giống hệt nhau, do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5% các trường hợp vượt quá giới hạn lặp lại r.

Các giá trị đối với lúa mạch là:

= 0,1 mg/kg    r = 0,112 mg/kg (mẫu trắng)

= 1,3 mg/kg    r = 0,896 mg/kg (mẫu bị nhiễm tự nhiên)

= 3,0 mg/kg    r = 1,036 mg/kg (mẫu bị nhiễm tự nhiên)

= 3,7 mg/kg    r = 0,448 mg/kg (mẫu bổ sung chuẩn)

= 4,5 mg/kg    r = 1,792 mg/kg (mẫu bị nhiễm tự nhiên)

Các giá trị đối với cà phê rang là:

= 0,2 mg/kg    r = 0,112 mg/kg (mẫu trắng)

= 1,2 mg/kg    r = 0,756 mg/kg (mẫu bị nhiễm tự nhiên)

= 2,7 mg/kg    r = 0,868 mg/kg (mẫu bị nhiễm tự nhiên)

= 3,5 mg/kg    r = 0,588 mg/kg (mẫu bổ sung chuẩn)

= 5,5 mg/kg    r = 0,308 mg/kg (mẫu bị nhiễm tự nhiên)

10.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ, tiến hành thử trên vật liệu giống thử hệt nhau, trong hai phòng thử nghiệm khác nhau, không được quá 5% các trường hợp vượt quá giới hạn tái lập R.

Các giá trị đối với lúa mạch là:

= 0,1 mg/kg    R = 0,280 mg/kg (mẫu trắng)

= 1,3 mg/kg    R = 1,232 mg/kg (mẫu bị nhiễm tự nhiên)

= 3,0 mg/kg    R = 1,456 mg/kg (mẫu bị nhiễm tự nhiên)

= 3,7 mg/kg    R = 1,204 mg/kg (mẫu bổ sung chuẩn)

= 4,5 mg/kg    R = 1,876 mg/kg (mẫu bị nhiễm tự nhiên)

Các giá trị đối với cà phê rang là:

= 0,2 mg/kg    R = 0,308 mg/kg (mẫu trắng)

= 1,2 mg/kg    R = 0,896 mg/kg (mẫu bị nhiễm tự nhiên)

= 2,7 mg/kg    R = 1,120 mg/kg (mẫu bị nhiễm tự nhiên)

= 3,5 mg/kg    R = 1,288 mg/kg (mẫu bổ sung chuẩn)

= 5,5 mg/kg    R = 2,184 mg/kg (mẫu bị nhiễm tự nhiên)

11. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm các thông tin sau đây:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử (loại mẫu, nguồn gốc của mẫu, tên gọi);

b) viện dẫn tiêu chuẩn này;

c) ngày và phương pháp lấy mẫu (nếu biết);

d) ngày nhận mẫu;

e) ngày thử nghiệm;

f) kết quả thử nghiệm và đơn vị biểu thị kết quả;

g) các điểm cụ thể quan sát được trong khi tiến hành thử nghiệm;

h) mọi chi tiết thao tác khác với quy định trong tiêu chuẩn này hoặc tùy chọn có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm.

 

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

DỮ LIỆU VỀ ĐỘ CHỤM

Các dữ liệu sau đây thu được từ các phép thử liên phòng thử nghiệm [2], [3] theo nguyên tắc hài hòa [4].

Bảng A.1 – Dữ liệu về độ chụm đối với lúa mạch

Mẫu	Mẫu trắng a)	Mức thấp	Mức trung bình	Mức cao	Mẫu mù
Năm tiến hành phép thử liên phòng thử nghiệm	1998/1999	1998/1999	1998/1999	1998/1999	1998/1999
Số lượng các phòng thử nghiệm	15	15	15	15	15
Số lượng các phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ	14	15	14	12	12
Số lượng loại trừ (phòng thử nghiệm)	1	0	1	3	3
Số lượng các kết quả được chấp nhận	14	15	14	12	12
Giá trị trung bình, , mg/kg	0,1	1,3	3,0	4,5	3,7
Độ lệch chuẩn lặp lại sr, mg/kg	0,04	0,32	0,37	0,64	0,16
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại RSDr, %	26	24	12	14	4
Giới hạn lặp lại r [r = 2,8 x sr], mg/kg	0,112	0,896	1,036	1,792	0,448
Độ lệch chuẩn tái lập sR, mg/kg	0,10	0,44	0,52	0,67	0,43
Độ lệch chuẩn tương đối tái lập RSDR, %	72	33	17	15	12
Giới hạn tái lập R [R = 2,8 x sR], mg/kg	0,280	1,232	1,456	1,876	1,204
Độ thu hồi, %	–	–	–	–	(93 ± 10)%
a) Bộ dữ liệu đối với mẫu trắng ở mức giới hạn phát hiện.

Bảng A.2 – Dữ liệu về độ chụm đối với cà phê rang

Mẫu	Mẫu trắng a)	Mức thấp	Mức trung bình	Mức cao	Mẫu mù
Năm tiến hành phép thử liên phòng thử nghiệm	1998/1999	1998/1999	1998/1999	1998/1999	1998/1999
Số lượng các phòng thử nghiệm	15	15	15	15	15
Số lượng các phòng thử nghiệm còn lại sau khi trừ ngoại lệ	14	15	14	12	13
Số lượng phòng thử nghiệm đã loại trừ	1	0	1	3	2
Số lượng các kết quả được chấp nhận	14	15	14	12	13
Giá trị trung bình, , mg/kg	0,2	1,2	2,7	5,5	3,5
Độ lệch chuẩn lặp lại sr, mg/kg	0,04	0,27	0,31	0,11	0,21
Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại RSDr, %	28	22	11	2	6
Giới hạn lặp lại r [r = 2,8 x sr], mg/kg	0,112	0,756	0,868	0,308	0,588
Độ lệch chuẩn tái lập sR, mg/kg	0,11	0,32	0,40	0,78	0,46
Độ lệch chuẩn tương đối tái lập RSDR, %	71	26	15	14	13
Giới hạn tái lập R [R = 2,8 x sR], mg/kg	0,308	0,896	1,120	2,184	1,288
Độ thu hồi, %	–	–	–	–	(88 ± 15)%
a) Bộ dữ liệu đối với mẫu trắng ở mức giới hạn phát hiện.

 

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Castegnaro M. Barek J., Fremy J.M., Lafontaine M., Miraglia M., Sansone E.B. and Telling G.M. Laboratory decontamination and destruction of carcinogens in laboratory wastes; some mycotoxins. IARC Scientific Publication No. 113, International Agency for Research on Cancer, Lyon (France), 1991, 63 p.

[2] EC, BRC Information, Report on Workpackage 4.9, Immunoaffinity Column Clean-up with Liquid Chromatography for the Determination of Ochratoxin A in Barley: Collaborative Study, Contract No. SMT4-CT96-2045, 1999, EUR 18954 EN

[3] EC, BRC Information, Report on Workpackage 4.9, Combined Phenyl Silan & Immunoaffinity Column Clean-up HPLC Method for the Determination of Ochratoxin A in Roasted Coffee: Collaborative Study, Contract No. SMT4-CT96-2045, 2000, EUR 19504 EN

[4] Guidelines for Collaborative Study to Validate Characteristics of a Method of Analysis” J.AOAC Int. 72, 1989, 694-704.